通过纳米传感器化学细胞术（NCC）揭示人类真皮成纤维细胞的老化异质性
组织再生细胞中的老化异质性导致治疗效果的变异性，使得质量控制和临床可预测性变得复杂。传统的依赖于标记或细胞裂解的分析方法具有破坏性，无法与下游治疗应用兼容。在此，我们展示了一种基于NCC的无标签、非破坏性单细胞分析平台，该平台集成了自动化硬件和深度学习技术。微流控通道中的近红外（nIR）荧光单壁碳纳米管阵列（SWCNT）与光子纳米射流效应相结合，以高通量方式从流动细胞中提取四个关键的老化表型（细胞大小、形状、折射率和H2O2外排）。在1小时内量化约10^5个细胞，并使用NCC表型数据在三维空间中构建虚拟老化轨迹。由此产生的表型异质性与RNA测序基因表达谱一致，能够可靠地预测治疗效果。该平台可以在不干扰的情况下快速识别最佳老化细胞，为再生细胞制造提供实时监控和质量控制的强大工具。
研究背景
移植和工程细胞在医疗治疗中的应用日益广泛，因此需要先进的分析方法来确保其疗效和可靠性。例如，组织再生涉及将特定类型的细胞输送到受损组织或器官以恢复其功能，使其成为目前最广泛使用的细胞疗法之一。组织再生策略已通过多种途径扩展，包括利用同种异体成纤维细胞的多细胞片Gintuit以及最近获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的组织工程皮肤替代品StrataGraft，后者包含活的人类真皮成纤维细胞（hDFs）。hDFs常用于基于支架的组织工程策略，特别是伤口愈合，因其在生成血管生成旁分泌因子和细胞外基质（ECM）关键成分（如胶原蛋白和纤连蛋白）方面的突出潜力。尽管这些高效生物特性使hDFs和其他真皮细胞在组织再生方面极具优势，但由于其在各种治疗条件下无法始终实现一致的治疗性能，它们在实际临床应用中并未得到广泛应用。
实验方法
为了准确研究hDFs的老化特征，我们通过不同的传代次数区分正常（非老化）细胞和老化细胞。第5代hDFs（p5），通常因其高增殖能力和治疗效果而被用于细胞疗法，作为对照组；而第15代hDFs（p15），以其再生潜力下降并代表细胞供应商保证的最大传代数作为老化组。对p5和p15之间的中间传代进行常规老化标志物分析表明，这两个传代足以覆盖关键的老化阶段，并显示出显著的老化特征差异。我们采用多种分析技术来表征p5和p15之间的年龄相关表型和分子差异。已建立的细胞老化标志包括衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加、线粒体膜电位（MMP）因线粒体功能障碍而降低、端粒长度缩短、促炎细胞因子上调、特定细胞周期调节因子的变化以及细胞形态和大小的变化。这些差异导致整个细胞群体中出现多样化老化速率，部分细胞比其他细胞老化得更快或更慢，从而导致治疗效率极低。
NCC工作流程
基于hDFs的老化特征，我们将p5、p7、p9、p11、p13和p15注入制造的纳米光子芯片并进行NCC分析。此分析是在悬浮状态下进行的，反映了最终产品条件，因为大多数细胞疗法都是以悬浮形式施用的。为了检查每个单细胞的生物物理和分子特征，我们获取了nIR图像。使用我们指定的深度学习工具分析每个老化样本的nIR图像以检测单个hDFs。此外，我们采用了yolov5l模型并进行了深度学习训练。每一种组件都增强了模型在精确定位边界框、评估对象置信度和分类对象方面的性能，从而提高了细胞检测精度。由于模型在置信水平为0.4和0.5时始终达到F1评分高于0.97，我们设置了置信阈值为0.50。只有超过此阈值的预测被视为有效检测，并以从橙色到黄色的渐变色表示。
老化异质性的揭示
使用NCC工作流程，我们分析了单细胞内p5和p15群体中四种老化表型（细胞大小、偏心率、折射率和H2O2外排）的分布。结果发现，随着传代次数的增加，所有四个表型的标准差显著增加，表明细胞异质性整体上升。通过绘制二维相关图，我们可视化了单细胞密度的动态变化，并根据核密度估计（KDE）识别最大密度值的坐标。此外，我们计算了皮尔逊相关系数（R）以定量分析两个指标之间的相关性。
三维老化轨迹
基于二维动态分析，我们选择了反映hDFs老化的三个表型（细胞大小、折射率和H2O2外排），并绘制了p5和p15的三维单细胞分布空间。基于这些坐标，我们完成了hDFs的三维老化轨迹，这些轨迹直观地表示了不同传代间细胞群体转移的空间趋势。欧几里得距离显示，相邻传代之间的最大密度坐标逐渐增加，尤其是p13和p15之间距离最大，为9.033。p5和p15之间的距离为13.828，表明早期和晚期传代间细胞群体中心分布有显著的空间变化。这一轨迹提供了细胞群体随老化空间演化的视觉解释。
细胞治疗效果评估及基因组相关性
最后，通过体外实验评估了hDFs的治疗性能，以验证NCC结果是否与不同年龄段的基因组和细胞因子谱一致。基因组分析揭示了支持年轻和老化hDFs功能差异的显著基因改变。具体而言，p15表现出涉及氧化应激和活性氧（ROS）生产的基因表达增加，包括IFI6、SLC1A1和PDK4，而缓解氧化应激的CBS基因表达减少。这些基因改变提示老化细胞中ROS生产潜力增强，这与观察到的MMP降低和ROS水平升高一致。此外，暴露于ROS后，这些细胞表现出呼吸爆发，与p5中观察到的稳态调节形成对比，后者积极下调凋亡途径。相比之下，p5表现出与氧化应激和伤口愈合相关的IGFBP5、MBP和AGT基因表达增加，反映了对外部压力和损伤作出反应的强健细胞机制。这些差异在细胞外基质（ECM）组织中也显而易见，p5表现出更高的ECM相关基因表达，包括COL11A1、MFAP5、AGT和ACAN，相较之下p15则较低。基因本体论–生物学过程（GO-BP）分析进一步阐明了这些差异，p15主要富集在ECM组织和血管发育中，而p5则在骨化和ECM调控途径中富集。这些基因组和功能差异突显了hDFs在不同老化阶段的不同生物状态，p5倾向于生长和再生，而p15则表现出丰富的应激反应和与老化相关的衰退。与炎症和细胞凋亡相关的基因表达谱进一步支持这些结论，展示了p5的生长导向谱和p15的炎症和应激响应谱的明显区别。
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