外周淀粉样蛋白-β（Aβ），包括血液和肠道中的Aβ，与阿尔茨海默病（AD）的发病机制有关。此外，糖尿病和胰岛素抵抗与Aβ代谢受损及认知能力下降和AD风险增加相关。先前的研究表明大麻二酚（CBD）和S-烯丙基半胱氨酸（SAC）具有神经保护作用；然而，它们在糖尿病背景下对Aβ水平的影响尚未被探索。5周龄的db/db糖尿病小鼠接受了为期23周的SAC、CBD或SAC与CBD联合治疗的饮食干预。通过免疫荧光成像量化了肠上皮细胞Aβ丰度，并使用ELISA测量了血浆中Aβ42、Aβ40和Aβ寡聚体的浓度。结果显示，db/db小鼠的肠上皮细胞Aβ表达逐步增加，这一现象可通过SAC给药得到缓解。相比之下，单独使用CBD或与SAC联合治疗增加了肠上皮细胞Aβ丰度并提高了血浆Aβ42浓度。联合治疗减少了Aβ寡聚体。这些发现表明，SAC的神经保护作用部分由其对外周Aβ水平的影响介导。CBD可能会加剧糖尿病中的Aβ积累。
引言
阿尔茨海默病（AD）以脑内淀粉样蛋白-β（Aβ）肽的积累为特征，导致神经退行性病变和认知功能下降。尽管脑内Aβ沉积是AD的标志，但越来越多的证据表明，外周因素，特别是与代谢疾病如糖尿病相关的因素，可能在加速AD病理过程中起关键作用。2型糖尿病与认知能力下降和AD风险增加密切相关，多项纵向研究表明，中年胰岛素抵抗和糖尿病与认知正常个体脑内淀粉样蛋白负荷增加有关。
糖尿病如何增强脑内Aβ沉积的具体机制尚不完全清楚。然而，包括我们最近在db/db小鼠（一种2型糖尿病模型）中的研究在内的先前工作表明，糖尿病与肠道和血浆中Aβ水平升高有关。这些外周变化伴随着血脑屏障的破坏，表明糖尿病可能促进Aβ从外周运输到大脑，从而促成AD病理的早期阶段。重要的是，这些改变发生在可检测的认知功能障碍之前，突显了一个潜在的干预窗口。
鉴于糖尿病与外周Aβ动态之间的联系，靶向调节肠道和血浆等外周组织中Aβ合成和清除的途径，可能为延缓糖尿病人群AD进展提供新的策略。大蒜中的生物活性成分S-烯丙基半胱氨酸（SAC）和来自大麻的非精神活性化合物大麻二酚（CBD）均在AD的临床前模型中显示出抗氧化、抗炎和神经保护特性。尽管这些化合物对脑部病理有令人鼓舞的效果，但它们调节外周Aβ稳态的能力，特别是在糖尿病背景下的效果，仍很大程度上未被探索。
本研究旨在调查SAC和CBD单独或联合使用调节db/db糖尿病小鼠肠道Aβ合成和血浆Aβ水平的潜力。通过研究这些化合物如何影响外周Aβ动态，这项工作寻求确立它们在减轻糖尿病相关AD进展风险因素中的治疗相关性。
方法
动物和实验设计
本研究中的所有实验程序均获得科廷动物伦理委员会（批准号ARE 2018-19）的批准，并按照ARRIVE指南和《澳大利亚动物护理和使用科学目的守则》进行。
从珀斯动物资源中心（西澳大利亚州）获取4周龄雄性db/db和db/+ C57BLK/6 J小鼠，并在科廷动物设施中于受控温度和12小时光照/黑暗循环下饲养。经过一周适应期后，随机将8至13只小鼠分配到6周或14周对照组或28周研究组。对照组包括db/db和db/+小鼠，6周组的小鼠被安乐死以获取基线组织样本。28周组包括对照db/db和db/+小鼠，以及从5周龄开始接受含SAC、CBD或SAC+ CBD饮食23周的db/db小鼠。
对照组小鼠提供基于AIN93M的基础饲料，而干预组则接受补充以下成分之一的AIN93M基础饲料：0.04% w/w SAC（ChemScene，新泽西州，美国）、0.06% w/w CBD（Zelira Therapeutics，西澳大利亚州珀斯）或0.04% w/w SAC和0.06% w/w CBD的组合。CBD（>99%纯度）在掺入饲料前以14.5%的浓度溶于Miglyol 812N中。
根据db/db小鼠的平均每日食物摄入量（5-6克）和平均体重48克，膳食浓度对应于约50 mg/kg SAC和75 mg/kg CBD的剂量。
样品收集和组织制备：
用异氟烷麻醉小鼠，通过心脏穿刺将血液样本收集到乙二胺四乙酸涂层管中。通过3000 rpm、4°C离心10分钟分离血浆。然后通过颈椎脱位处死小鼠。小心移除一段2厘米长的小肠近端，并固定在4%多聚甲醛中至少24小时。随后处理样品并嵌入石蜡块中，从中切出5微米厚的切片并安装在硅烷涂层载玻片上用于后续免疫染色。
肠上皮细胞Aβ和ApoB的免疫荧光检测
使用免疫荧光显微镜测量肠上皮细胞中Aβ的丰度，方法如前所述。简而言之，将5微米厚的组织切片脱蜡、再水化，并置于沸水中15分钟以恢复抗原结合位点。然后在PBS-Tween-20溶液中透化10分钟，并用20%山羊血清封闭1小时。然后在4°C下过夜孵育兔抗小鼠Aβ（1–40/42）抗血清（1:200，Millipore）。使用Alexa546标记的抗兔IgG（1:100）检测免疫荧光，并用HOECHST（1:2000，ThermoFisher）染色细胞核。使用Zeiss Axioscan Z1滑动扫描仪捕获荧光图像，并使用Zeiss Zen Blue软件量化像素强度以评估Aβ丰度。
血浆Aβ分析
使用市售ELISA试剂盒（Wako，日本）根据制造商说明测量血浆中Aβ40、Aβ42和Aβ寡聚体的浓度。测量针对Aβ40（0–100 pmol/L）、Aβ42（0–20 pmol/L）和Aβ寡聚体（0–100 pmol/L）的标准品进行校准。
血浆葡萄糖、胰岛素和甘油三酯水平的测量
分别使用比色法试剂盒（Cayman Chemical）和小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Mercodia）根据各制造商提供的说明测量血浆葡萄糖和胰岛素浓度。使用EnSight多模式酶标仪在500 nm波长下测量葡萄糖，在450 nm波长下测量胰岛素的光学密度。
按照制造商指南使用Randox比色试剂盒（Randox Laboratories，英国）评估血浆甘油三酯水平。简而言之，将2 µL血浆样本或标准溶液与200 µL反应溶液混合在96孔板中，并在37°C孵育5分钟。随后在500 nm波长下测量吸光度。
统计分析
使用GraphPad Prism 9（美国）进行统计分析。所有数据表示为均值±SEM。对于正态分布的数据，使用Brown-Forsythe和Welch ANOVA进行分析，并采用未配对t检验和Welch校正。非正态分布的数据使用Kruskal-Wallis检验进行分析，并采用Dunn多重比较检验。统计显著性设定为p < 0.05，并报告适用的p < 0.01和p < 0.001显著性水平。
结果
糖尿病db/db小鼠肠上皮细胞Aβ表达随年龄增长而增加
免疫组化定量显示，非糖尿病db/+小鼠在6、14和28周时Aβ水平没有显著的年龄相关差异（图1）。相反，糖尿病db/db小鼠显示出统计学上显著的年龄依赖性肠上皮细胞Aβ增加。特别是，14周龄db/db小鼠的Aβ水平高于6周龄db/db小鼠，而28周龄db/db小鼠进一步增加，超过年轻糖尿病db/db小鼠和同龄非糖尿病db/+对照组的水平。
图1
控制小鼠肠上皮细胞Aβ丰度的半定量免疫显微镜检查。每核区域表达的肠上皮细胞Aβ强度总和（A）和显示小肠绒毛中Aβ（橙色）和核（蓝色）的代表性免疫显微照片（B）。白色箭头指示固有层（Lp），Lu标记腔。数据表示为均值±SEM。统计显著性通过Brown-Forsythe和Welch ANOVA估算（n=8-12，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
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SAC完全正常化db/db小鼠肠上皮细胞Aβ丰度
SAC补充显著降低了db/db小鼠肠上皮细胞Aβ水平（图2A,B）。相反，单独使用CBD及其与SAC联合使用增加了Aβ水平，联合给药接近统计显著性（p=0.054）。
图2
SAC、CBD和SAC+CBD对肠上皮细胞Aβ丰度的差异效应。每核区域表达的肠上皮细胞Aβ强度总和（A）和显示小肠绒毛中Aβ（橙色）和核（蓝色）的代表性免疫显微照片（B）。白色箭头指示固有层（Lp），Lu标记腔。数据表示为均值±SEM。统计显著性通过Brown-Forsythe和Welch ANOVA估算（n=7-14，*p<0.05）。
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CBD增加血浆Aβ寡聚体和Aβ42水平
SAC治疗并未显著影响Aβ42浓度，但注意到Aβ40和Aβ寡聚体水平有小幅下降（图3A-C）。相反，单独使用CBD或与SAC联合治疗显著提高了Aβ42水平，并导致Aβ40水平非显著增加。此外，两种治疗组的Aβ寡聚体水平都降低，尽管仅在联合治疗中差异显著。
图3
SAC、CBD和SAC+CBD对血浆Aβ亚型浓度的差异效应。血浆Ab40（A）、Aβ42（B）、Aβ42/Aβ40（C）和Aβ寡聚体（D）的成对比较。值表示为±SEM（每组5-12只小鼠）。统计显著性通过Brown-Forsythe和Welch ANOVA估算Aβ42数据集，通过Kruskal-Wallis估算Aβ40和Aβ寡聚体数据集（n=6-9，*p<0.05，**p<0.01）。
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CBD和SAC改善高胰岛素血症并适度减少甘油三酯
尽管降低了循环胰岛素浓度，SAC和CBD的单独或联合治疗均增加了血浆葡萄糖水平（图4A,B）。所有治疗组的血浆甘油三酯水平均降至与非糖尿病对照组（db/+）相当的水平，但这种减少未达到统计显著性（图4C）。此外，只有CBD治疗组表现出显著的体重减轻（图4D）。
图4
SAC、CBD和SAC+CBD对代谢参数的差异效应。血浆葡萄糖（A）、胰岛素（B）、甘油三酯（C）和体重（D）的成对比较。值表示为±SEM（每组3-12只小鼠）。统计显著性通过Brown-Forsythe和Welch ANOVA估算（n=6-9，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
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讨论
与我们的先前研究一致，我们观察到糖尿病db/db小鼠小肠吸收细胞中Aβ表达显著增加。我们的结果进一步扩展了这些观察结果，显示db/db小鼠的肠上皮细胞Aβ水平随年龄逐渐增加，而在db/+小鼠中未观察到这种模式（图1）。还注意到db/db小鼠血浆中Aβ40和Aβ寡聚体水平升高，而Aβ42水平保持不变。虽然糖尿病提高肠上皮细胞Aβ的确切机制尚不完全清楚，但db/db小鼠常见的过度进食和肠道肥大等因素可能通过增强饮食脂肪摄入而贡献于Aβ水平的增加。先前的研究表明，饮食脂肪影响野生型小鼠的Aβ丰度，这在本文中可能相关。
本研究还考察了SAC和CBD对肠上皮细胞和血浆Aβ水平的影响。SAC给药显著降低了肠上皮细胞Aβ水平（图2），与其报道的抑制脑内Aβ合成和调节淀粉样前体蛋白加工的能力一致。SAC对肠上皮细胞Aβ的观察到的减少也可能源于其减轻高胰岛素血症和氧化应激的能力，这两条途径都与淀粉样蛋白生成过程有关。然而，血浆Aβ缺乏显著减少表明系统清除机制，主要是肝脏清除机制，未受影响。尽管胰岛素水平降低，但血浆葡萄糖的矛盾上升进一步支持肝胰岛素敏感性受损的可能性。
相比之下，虽然CBD表现出与SAC相似的代谢改变，但其对Aβ稳态的影响明显不同。CBD单药治疗增加了肠上皮细胞Aβ表达并提高了血浆Aβ42水平（图2和图3）。有趣的是，CBD与SAC联合给药抵消了SAC对肠上皮细胞Aβ的抑制作用并提高了血浆Aβ42水平，而Aβ寡聚体水平降低。CBD对质膜流动性以及细胞内胆固醇处理的影响可能部分解释这些发现，尽管确切机制尚不清楚。先前的研究表明，关于CBD对脑内Aβ影响的结果不一致。然而，本研究首次表明外周Aβ上调。需要进一步研究以确定CBD影响Aβ代谢的途径，特别是在糖尿病背景下的情况。
结论
总之，我们的研究显示糖尿病db/db小鼠肠上皮细胞Aβ水平逐步增加，SAC有效降低这些水平。相反，CBD增加了肠道和血浆中的Aβ表达。这些发现表明SAC可能具有调节Aβ代谢的治疗潜力，而使用CBD时需谨慎，特别是在糖尿病模型中。需要进一步研究以充分理解这些效应背后的机制，并阐明管理糖尿病中Aβ相关病理的治疗意义。
(全文结束)
