多尺度蛋白质组学建模揭示驱动阿尔茨海默病发病机制的蛋白质网络 - 认知障碍

研究亮点

• 一个胶质细胞-神经元蛋白质共表达子网络与阿尔茨海默病关联最为密切

• 通过整合遗传和蛋白质组学数据构建了蛋白质因果网络

• 确定了阿尔茨海默病进展的关键驱动蛋白质

• 下调星形胶质细胞驱动蛋白AHNAK可减少磷酸化Tau蛋白和β-淀粉样蛋白水平

摘要

阿尔茨海默病(AD)作为最常见的痴呆形式，其发病的分子机制仍然知之甚少。蛋白质组学为阐明AD发病机制提供了一种关键方法，因为蛋白质表达的改变比基因或转录组水平的变化更直接地与表型结果相关。在这项研究中，我们通过整合来自易受疾病影响脑区的大规模匹配蛋白质组学和遗传数据，为AD开发了多尺度蛋白质组学网络模型。这些模型揭示了详细的蛋白质相互作用结构，并确定了参与AD进展的潜在关键驱动蛋白(KDPs)。值得注意的是，网络分析发现了一个捕获胶质细胞-神经元相互作用的AD相关子网络。AHNAK作为该胶质细胞-神经元网络中的顶级KDP，在基于人诱导多能干细胞(iPSC)的AD模型中得到了实验验证。这一系统性识别失调蛋白质调控网络和KDPs的工作为开发创新的AD治疗策略奠定了基础。

关键词

阿尔茨海默病
蛋白质组学
转录组学
共表达网络
贝叶斯因果推断网络
关键驱动因子分析
AHNAK

引言

阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆形式。尽管一些化合物，例如lecanemab和aducanumab在减少大脑中β-淀粉样肽(Aβ)和减缓早期AD患者的认知衰退方面显示出适度疗效，但大多数AD实验药物都已失败。从病理学角度看，AD的特征是神经原纤维缠结、营养不良性神经突、丰富的细胞外Aβ纤维和炎症。然而，散发性AD(尤其是晚发性AD)的病因仍然知之甚少。

多组学技术，如基因组学、甲基组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，结合网络生物学方法，已显示出剖析包括AD在内的复杂疾病关键通路和驱动因子的巨大潜力。蛋白质组学尤为重要，因为蛋白质表达的改变比基因或转录组水平的变化更直接地与表型变异相关。迄今为止，针对AD的人类脑组织仅进行了有限的蛋白质组学研究。目前，对AD最易感脑区——海马旁回(PHG)的大规模深度蛋白质组学分析和先进的网络生物学建模仍然缺乏。PHG包含大部分内嗅皮层、外嗅皮层和后部海马旁回皮层，位于内侧颞叶内。它对记忆形成和视觉场景回忆至关重要。PHG在处理与环境和空间记忆相关的上下文信息中起着关键作用，是海马体与其他脑区之间的中继站。PHG结构异常可能表明潜在疾病如AD。功能性成像分析的结果一致地识别出海马旁回的异常变化，如灰质萎缩、皮层厚度减少、白质体积减少和白质微结构异常，这些变化与AD/轻度认知障碍(MCI)患者的认知损伤相关。

为了全面了解AD脑PHG中的分子失调并最终实现发现AD的独特机制，在本研究中，我们对来自西奈山/JJ Peters退伍军人事务医疗中心脑库(MSBB)的198例死后AD、MCI和正常对照(NL)脑的PHG进行了深度蛋白质组学分析。随后，我们进行了多尺度蛋白质网络分析，结合蛋白质共表达和贝叶斯因果网络方法，通过整合匹配的遗传、蛋白质组学、临床和病理数据，系统地识别AD的关键蛋白质子网络和驱动因子。多尺度网络分析揭示了一个捕获神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞之间相互作用的AD相关子网络，这些相互作用通过迄今为止最大的AD单核RNA测序(snRNA-seq)数据集得到验证。我们进一步使用人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的星形胶质细胞及其共培养的小鼠神经元，验证了AHNAK(AD中胶质细胞-神经元网络的顶级蛋白质驱动因子之一)的功能作用。本研究提出了重要的多尺度蛋白质组学调控网络集合和首个潜在因果蛋白质驱动因子列表，为系统揭示AD的分子机制和推进AD下一代治疗方法的发展奠定了基础。

结果

研究设计概述

本研究聚焦于两个大型多组学AD队列中的蛋白质组学数据：MSBB和纵向宗教修道院研究/记忆与老龄化项目(ROSMAP)。值得注意的是，ROSMAP中的多组学数据是从背外侧前额叶皮层(PFC)样本生成的。除了差异蛋白质表达和蛋白质-特征相关性分析外，我们还进行了蛋白质共表达网络分析，以识别多个紧凑度尺度上的共表达蛋白质模块，随后进行蛋白质因果网络分析以预测AD的潜在蛋白质驱动因子。AHNAK作为与AD最相关的蛋白质模块中的顶级蛋白质驱动因子之一，使用人iPSC AD模型进行了实验验证。由于两个队列都包含来自多个脑区的匹配转录组学数据，我们还评估了同一区域和不同区域之间基因和蛋白质模块的保守性，从而识别出PHG和蛋白质组特异性的与AD相关的蛋白质模块。

开发来自185个AD和非AD脑PHG的蛋白质组学数据队列

我们对来自MSBB队列的185个死后AD和非AD脑的PHG进行了蛋白质组学分析。PHG是最易受AD影响的脑区之一，因此了解其蛋白质组有助于更相关地了解AD发病机制。蛋白质组学数据通过我们内部的多组学检测样本质量控制(QC)流程进行预处理，185个样本通过了QC。根据建立阿尔茨海默病登记处的联盟(CERAD)神经病理学分类，QC后的蛋白质组学数据包括76例确诊、24例可能和25例疑似AD病例，以及60例健康NL对照(图1B，左上)。共有116名女性和69名男性，平均死亡年龄为84.5岁，年龄范围从61.0岁到108.0岁(补充表S1，第1-2页)。AD供体被选择排除具有非AD共病的供体。

我们在每个185个脑样本中鉴定出12,147个具有可检测信号的独特蛋白质异构体(除非另有说明，以下简称蛋白质)。这些蛋白质异构体由9,272个独特基因生成(平均每个基因1.34个蛋白质异构体)。随后，蛋白质的归一化表达水平针对性别、种族、死亡年龄、死后间隔(PMI)和批次等协变量进行了调整(见STAR方法)。

识别AD相关蛋白质

为了便于识别AD相关蛋白质，我们将受试者分为3组，代表从正常到AD病理和痴呆严重程度的疾病严重程度阶段。具体而言，对于Braak评分(BS)，受试者被分为低(BS≤2)、中(2<BS≤4)和高(BS>4)组；对于临床痴呆评分(CDR)，受试者被分为认知正常(非痴呆，CDR=0)、受损(0<CDR≤2)和痴呆(CDR>2)组；对于斑块平均密度(PMD)，受试者被分为正常(PMD=0)、轻度(0<PMD≤9)和重度(PMD>9)组；对于CERAD评分，受试者被分为确诊AD(CERAD=2)、疑似AD(包括可能AD，CERAD=3和疑似AD，CERAD=4)和NL(CERAD=1)(补充表S1，第1-2页)。

随后，我们研究了每个蛋白质与四个AD神经病理学和临床特征(包括BS、CDR、CERAD和PMD)的关联。图2C总结了先前定义的每个AD特征的三个受试者亚组之间两两比较所识别的差异表达蛋白质(DEPs)。我们将每个比较中的DEP特征进一步分为下调和上调子集。如果比较亚组之间的倍数变化(FC)为正，则DEP被视为上调；否则被视为下调。

我们从严重AD病理与健康对照之间的比较中(例如确诊AD与NL)识别出1000多个DEPs，约占评估的总蛋白质的10%。有趣的是，>70%的DEPs在严重AD病理病例中上调。在严重和中度AD病理之间的比较中(例如确诊AD与疑似AD)也观察到类似趋势。然而，在中度AD病理和健康对照之间，我们检测到很少或没有DEPs。从蛋白质表达与AD临床和神经病理学特征的相关性分析中也发现了类似结果。因此，大量蛋白质在AD和健康对照之间差异表达。

为了揭示DEPs在AD神经病理学中的生物学相关性，我们研究了这些DEP特征中富集的已知功能通路。如图S1A所示，DEP特征在AD发病机制中重要的GO通路中富集，例如下调DEP特征中富集神经元和突触功能，上调DEP特征中富集免疫反应。这些观察结果与我们之前发现的下调DEP特征在神经元细胞中富集，而上调DEP特征在小胶质细胞和星形胶质细胞中富集的结果一致。我们还观察到DEP特征中AD风险基因和Aβ通路基因的显著富集。这些结果表明DEP特征捕获了AD神经病理学的一些关键组成部分。

CDR和CERAD捕获AD病理的不同方面

CDR和CERAD是用于评估痴呆和AD病理进展的两个特征，CDR评估痴呆严重程度和认知状态，CERAD基于神经病理学标准指示AD的病例-对照状态。在MSBB中，CDR和CERAD呈中度相关(r=0.6，p=1.1e-19)，表明它们与AD进展的共享和不同关联。因此，我们比较了与CDR和CERAD相关的蛋白质表达特征。虽然大量基于CDR的DEPs与基于CERAD的DEPs重叠，但也有一些DEPs仅与CDR或CERAD相关，表明某些对AD中认知损害有贡献的异常表达蛋白质并不直接与主要神经病理学病变相关。

接下来，我们对这些DEP特征进行了GO富集分析，以识别相关的功能通路。图2D(底部)显示了维恩图中六个DEP子集中的每一个最富集的通路，突出了它们在AD病理和痴呆中的不同作用。例如，在高CDR评分受试者中下调的DEPs富集于认知、学习或记忆等生物过程。

APOE基因型在AD相关蛋白质组中的关键作用

APOE基因型是AD的主要风险因素，APOE ε4/ε4 (APOE 44)基因型具有特别有害的影响。因此，我们评估了不同APOE基因型对与AD病理相关的蛋白质组的影响。由于MSBB中只有4名185名受试者携带APOE 44基因型，我们将携带APOE ε4/ε4和APOE ε3/ε4的受试者合并为一个称为"APOE4"的单一类别。基于CERAD，我们将确诊AD和疑似AD进一步合并为AD，与NL组形成对比。我们然后关注APOE基因型和疾病状态组合的以下三个亚组：APOE4-AD(57名受试者)、APOE33-AD(56名受试者)和APOE33-NL(35名受试者)。我们识别了APOE4-AD与APOE33-AD、APOE4-AD与APOE33-NL以及APOE33-AD与APOE33-NL之间的DEPs。我们在APOE4-AD和APOE33-NL之间检测到244个下调和1,114个上调DEPs，但在APOE33-AD和APOE33-NL之间仅检测到42个DEPs。有趣的是，两个DEPs(NSUN5P2和GPM6A)在APOE33-AD和APOE4-AD与APOE33-NL相比时表现出相反的差异表达方向。APOE4-AD和APOE33-AD之间没有DEP。例如，我们展示了AHNAK蛋白质表达从APOE33-NL到APOE33-AD再到APOE4-AD的渐进增加。这些结果表明APOE4基因型和疾病状态之间可能存在相互作用，这可能会加剧AD病理的进展。

性别共享和特定的AD相关蛋白质组

鉴于性别是AD病理的主要风险因素，我们对性别分层的AD组进行了差异表达分析(详见STAR方法)。在男性中，我们识别出142个下调和434个上调DEPs(确诊AD与NL相比)；在女性中，我们识别出220个下调和784个上调DEPs(确诊AD与NL相比)(补充表S2，第8页)。尽管男性和女性DEP特征之间存在显著重叠，但大量DEPs对每种性别都是独特的，表明与AD相关的蛋白质组变化存在明显的性别特异性差异。

DEP特征在独立AD蛋白质组数据集和AD小鼠模型中得到验证

为了评估上述关键发现，我们检查了来自MSBB蛋白质组学数据的DEP特征(补充表S2，第1页)与来自ROSMAP和巴尔的摩老龄化纵向研究(BLSA)队列的独立蛋白质组学数据集的重叠情况(图1B，中左和底左)。为了便于比较三个不同队列，我们为每个队列中每个特征的DEPs生成了最终DEP特征(STAR方法)。结果发现这三个最终DEP特征彼此显著重叠。例如，MSBB队列中的下调和上调DEP特征分别与ROSMAP队列中的下调(FE=4.3，FDR=6.2e-75)和上调DEPs(FE=3.6，FDR=1.4e-45)显著重叠。

我们还检查了我们的AD蛋白质组特征是否与来自AD小鼠模型的特征重叠。6个月大的5xFAD及其对应野生型(WT)小鼠的蛋白质组按照描述进行分析和处理。选择在6个月大时评估5xFAD与WT小鼠之间的DEPs的决定基于证据，即5xFAD小鼠的记忆功能大约在5个月开始恶化。基于多重检验校正p值(FDR<0.05)，在6个月大时5xFAD与WT小鼠之间有227个DEPs。由于通过FDR<0.05在5xFAD小鼠中识别出的DEPs数量较少，我们通过使用名义p值<0.05放宽了标准。基因集富集分析(GSEA)显示MSBB AD DEP特征与小鼠AD DEP特征之间存在强富集(标准化富集分数[NES]=2.2，校正p值=4.6e-12)。

最后，我们检查了MSBB队列中PHG的DEP和差异表达基因(DEG)特征之间的一致性(图1B，右上)。观察到48.2%的上调DEPs和79.2%的下调DEPs在AD的mRNA水平上分别一致地上调和下调(图3E、3F和S2A；STAR方法)。正如预期，这些保守DEPs的蛋白质水平也与其相应的mRNA谱显著相关。

总体而言，这些结果表明我们的人类DEP特征不仅高度可重复，而且与AD发病机制强烈相关。

蛋白质共表达网络分析揭示与AD相关的蛋白质模块

为了研究AD中蛋白质之间复杂相互作用的结构，我们通过多尺度嵌入基因共表达网络分析(MEGENA)构建了蛋白质共表达网络。我们识别出386个共表达蛋白质模块，大小从10到3,118个蛋白质不等(补充表S4，第3页)。为了识别与AD相关的共表达网络模块，我们将这些蛋白质模块与DEP特征相交，并根据总富集分数对它们进行排序(图4B，轨迹2)，该分数计算为多次富集检验显著性水平的总和。

图4B显示了排名前30的模块，按与AD关联强度的降序排列。在排名前30的AD相关模块中，五个(M5、M2、M120和M186)富集于下调DEP特征，而其他25个富集于上调DEP特征。这些AD相关模块基于它们对人类脑细胞类型特异性标记特征的富集而具有细胞类型特异性。例如，许多下调模块(如M2、M4、M5、M54和M58)富集神经元标记，而胶质细胞特异性上调模块(如M3、M46、M245、M533和M771)富集星形胶质细胞或小胶质细胞标记。这些脑细胞类型特异性模块涉及多种生物功能。例如，排名最高的模块M3(图4B)，在AD中上调(图4E)，涉及各种关键生物通路，如代谢过程、抗原呈递、信号转导和内质网(ER)吞噬体(图4D；补充表S4，第6页)。因此，共表达网络分析突出了几个共表达蛋白质模块的功能通路，这些通路可能有助于AD发病机制。例如，排名第六的模块M39在星形胶质细胞中发挥作用，在AD中上调，并参与细胞因子信号传导。

另一个关键发现是模块M3捕获了下调神经元、激活星形胶质细胞和激活小胶质细胞蛋白质之间的相互作用(图4E)。为了验证这一发现，我们计算了snRNA-seq数据集中细胞类型特异性伪批量数据，并识别出兴奋性神经元中四个枢纽蛋白(OPCML、OLFM3、RPH3A和NRN1)与M3中所有星形胶质细胞蛋白之间2,394个显著相关性，以及与M3中小胶质细胞基因之间的294个显著相关性。在抑制性神经元中，这四个神经元枢纽蛋白与M3中星形胶质细胞蛋白和小胶质细胞蛋白分别有2,497和342个显著相互作用。此外，M3中的七个星形胶质细胞枢纽蛋白(VIM、GFAP、PLEC、PRDX6、EZR、AHNAK和MSN)与M3中兴奋性神经元、抑制性神经元和小胶质细胞中的蛋白分别有1,182、805和264个显著相关性。总体而言，这些结果揭示了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞通过蛋白质子网络M3之间引人入胜的相互作用。

识别和表征PHG蛋白质组学特异性模块

我们随后进行了模块保守性分析，以识别MSBB队列PHG中的蛋白质特异性模块，与MSBB队列PHG中的基因共表达网络以及ROSMAP队列PFC中的基因和蛋白质共表达网络进行比较(STAR方法；补充表S5，第1-4页)。在MSBB队列PHG的386个蛋白质模块中，148个(38.3%)、47个(12.2%)和40个(10.4%)模块分别在ROSMAP PFC蛋白质、MSBB PHG基因和ROSMAP PFC基因网络中保守(图5A，左；补充表S5，第5页)。在排名前50的AD相关模块中，29个(58%)、22个(44%)和27个(54%)模块分别在ROSMAP PFC蛋白质共表达网络、MSBB PHG基因共表达网络和ROSMAP PFC基因共表达网络中保守(图5A，右和S4A)。因此，排名前50的AD相关PHG蛋白质模块在AD中的其他蛋白质和基因共表达网络中保存得更好。

我们继续识别PHG特异性、与AD相关的蛋白质模块。图5B显示了排名前50的AD相关PHG蛋白质模块及其在上述三个网络中的保守状态(轨迹#3-#5，分别用灰色和白色表示保守和非保守)。值得注意的是，M245和M46在所有三个其他网络中保守，其成员蛋白(特别是枢纽节点)的高比例在mRNA和蛋白质水平上表现出一致的差异表达。M3和M5仅在ROSMAP基因网络和ROSMAP蛋白质网络中保守，分别。M5是神经元特异性模块，在AD中下调，而M3捕获下调神经元蛋白和激活胶质细胞蛋白之间的相互作用，如前所述。

重要的是，10个模块(M2、M23、M56、M278、M476、M31、M512、M486、M145和M511)在其他3个网络中的任何一个中都不保守，因此对PHG蛋白质共表达网络具有特异性(图5B)。神经元特异性模块M2排名27，在化学突触传递和金属离子运输中发挥作用，而M31是M2的子模块。

最后，我们探索了PHG中排名前50的蛋白质模块的富集功能通路。由于许多排名靠前的蛋白质模块是胶质细胞特异性的，我们检查了它们对已知小胶质细胞状态(MGs)或疾病相关星形胶质细胞(DAAs)基因特征的富集。值得注意的是，星形胶质细胞模块M39、M210、M762和M510富集DAA基因特征，而小胶质细胞模块M245、M46、M771和M553富集MG状态的基因特征。注意，M3是一个大模块，不仅富集星形胶质细胞标记特征，还富集MG11和MG2特征。因此，许多排名靠前的AD相关蛋白质模块捕获了特定细胞类型的疾病状态。

令人惊讶的是，两个蛋白质模块M5和M10也富集MG状态的基因特征。神经元模块M5富集MG3的基因特征。M5和MG3共享的基因主要与核糖体生物发生相关。少突胶质细胞特异性模块M10在AD中被激活，因为其许多成员蛋白在AD中上调。M10富集MG12细胞周期状态的基因特征。事实上，M10和MG12共享的基因参与细胞周期信号传导通路，包括染色质结构、DNA修复和细胞对DNA损伤的反应。DNA损伤和修复已被认为在少突胶质细胞谱系、大脑衰老和AD中发挥重要作用。因此，AD相关模块捕获了AD中细胞类型特异性失调。

我们进一步检查了PHG特异性蛋白质模块的遗传学。排名靠前的AD小胶质细胞模块富集小胶质细胞中转录组范围关联研究(TWAS)基因特征，PHG特异性小胶质细胞模块与小胶质细胞TWAS基因共享的大量基因在AD中差异表达。例如，M3和小胶质细胞TWAS特征共享的214个蛋白质中有28%(61个)在AD中上调，表明蛋白质差异表达在AD中可能受到遗传调控。

贝叶斯因果蛋白质网络揭示AD的关键驱动蛋白

为了揭示蛋白质之间潜在的调控关系，我们使用PHG蛋白质组学数据以及匹配的遗传数据构建了全局贝叶斯因果网络(详细信息见STAR方法；图6A；补充表S4，第7页)，随后进行关键驱动因子分析(KDA)以识别关键驱动蛋白(KDPs)。KDA检查每个候选蛋白的网络邻域如何富集先前识别的AD相关蛋白质特征。我们识别出580个KDPs，对应于471个基因(平均每基因1.23个蛋白质异构体)(补充表S4，第8页)。波形蛋白(MSN)和PRDX6是排名前两位的KDPs(补充表S4，第8页)，它们共定位于在AD中上调的蛋白质子网络中(图6B)。我们还重点介绍了以VIM(图6C)、PLEC(图6D)和OLMF3(图6E)为中心的因果蛋白质子网络。这些排名靠前的KDPs已被证明在AD中发挥作用。例如，PRDX6被证明在神经退行性疾病发展中对神经发生具有抑制作用，减弱缺血性氧化损伤，并在胶质细胞中具有抗炎过程。

有趣的是，72%(469个中的340个)KDPs在AD中研究不足，因为它们与"阿尔茨海默病"在少于5篇论文中共同出现，而这些340个蛋白质中的11个(AHNAK、RPH3A、EZR、PLEC、OLFM3、NUMA1、LIMS1、DTNA、PLCB1、NDUFS1和PLCD1)是排名前30的KDPs(补充表S4，第8-9页；STAR方法)。值得注意的是，105个KDPs在AD中尚未被研究。总体而言，这些结果表明预测的KDPs不仅包括MSNs等已建立的AD相关靶点，还包括在AD背景下研究最少或以前未研究的蛋白质。

实验验证AD排名靠前的KDPs的蛋白质表达

我们通过定量毛细管西方测定法(Wes)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)验证了来自相同受试者的PHG区域中排名靠前的KDPs的蛋白质表达(补充表S6，第1页；STAR方法)。基于KDP排名分数(补充表S4，第8页)和抗体的可用性，并在合并来自相同蛋白质的异构体后，我们选择了七个排名靠前的KDPs进行验证，包括MSNs(#1，表示其排名顺序)、PRDX6(#2)、VIM(#3)、AHNAK(#5)、RPH3A(#6)、OLFM3(#10)和NRN1(#14)。除NRN1在AD中的下调未达到统计学显著性(p=0.11)外，所有七个KDPs都表现出与蛋白质组学分析中观察到的一致的表达模式(即上调或下调)。

人iPSC衍生脑细胞中AHNAK下调挽救神经退行性变

我们选择了AHNAK进行进一步的功能研究，因为其在KDP列表中的高排名以及其在AD研究中的生物学意义，因为它是排名前五的KDPs中研究最少的(补充表S4，第9页；STAR方法)。在因果和共表达蛋白质网络中，AD相关的DEPs在AHNAK为中心的子网络中高度富集。AHNAK在AD中上调，并且不仅与神经病理学特征显著相关，还与认知功能显著相关。AHNAK是PHG中MSBB队列蛋白质共表达网络中星形胶质细胞模块M3和M39的枢纽基因，其MEGENA网络邻域仅富集星形胶质细胞标记(FE=2.7，校正p值=8.0e-26)。AHNAK也是ROSMAP队列PFC中蛋白质共表达网络模块M34的枢纽基因，该模块对星形胶质细胞标记的富集程度最高(FE=3.5，校正p值=8.4e-15)。此外，PFC的snRNA-seq数据显示AHNAK主要在星形胶质细胞中表达。这些结果强烈暗示AHNAK在星形胶质细胞中发挥作用。因此，我们进行实验验证研究，以确定AHNAK在AD中使用人iPSC衍生星形胶质细胞的功能作用。

由于患者亚组与不同APOE基因型的先前DEP分析显示AHNAK蛋白质表达从APOE33-NL到APOE33-AD再到APOE4-AD的渐进增加，我们决定使用来自APOE ε4/ε4 (APOE 44)携带者的iPSC系。然后，我们比较了不同人iPSC衍生星形胶质细胞培养物中的AHNAK表达水平，并选择了一个具有高AHNAK表达的APOE 44 AD iPSC系。图7A概述了我们用于验证AHNAK在AD中功能作用的实验工作流程。这些实验旨在确定在星形胶质细胞中敲低AHNAK是否会对神经元产生有益影响，正如我们的网络分析所表明的那样，PHG蛋白质共表达网络模块M3中星形胶质细胞枢纽基因与神经元之间存在显著相互作用。

AHNAK短发夹RNA(shRNA)处理降低了APOE 44 AD星形胶质细胞培养物中其蛋白质表达(对照的83.4%，p=0.0001)(图7B；补充表S6，第2页)。与对照相比，AHNAK下调的APOE44 AD星形胶质细胞培养物中pTau水平降低(对照的70.8%，p=0.0001)(图7C；数据S1，第4D页；补充表S6，第3页)。AHNAK下调的APOE 44 AD星形胶质细胞中Aβ42、Aβ40和APOE水平略有降低(Aβ42、Aβ40和APOE水平分别降低8.9%、9.4%和9.3%)(数据S1，第4D页；补充表S6，第4-6页)。

接下来，我们测试了在共培养时，星形胶质细胞中AHNAK下调是否会对神经元产生任何有益/保护作用。使用轴突多电极阵列(MEA)系统测量与携带乱序对照或AHNAK shRNA转染的APOE44人iPSC衍生星形胶质细胞共培养的5xFAD小鼠原代皮层神经元的神经元活性。在基线时，来自5xFAD小鼠的皮层神经元(与乱序对照处理的星形胶质细胞共培养)表现出神经元活性受损，记录到有限的放电。然而，与AHNAK下调的星形胶质细胞共培养的神经元显示出改善的电活动(图7D)。点图显示放电、爆发和同步性增加(图7D)。一旦与AHNAK下调的星形胶质细胞共培养，神经元的尖峰数量表现出神经元活性的统计学显著增强(1.8倍增加；p=0.0378)(图7D，右；补充表S6，第7页)。与AHNAK shRNA处理的星形胶质细胞共培养的神经元中pTau水平持续降低(pTau水平降低11.4%，p=0.002；18%的AHNAK敲低，p<0.0001)(数据S1，第4E页，顶部；补充表S6，第8-9页)。另一方面，在与神经元共培养的AHNAK shRNA处理的星形胶质细胞中未观察到Aβ42或Aβ40水平的显著降低(数据S1，第4E页，底部；补充表S6，第10-11页)。总体而言，这些发现表明星形胶质细胞中AHNAK下调提供了促进神经元活性和维持神经元功能的有益作用，部分通过降低星形胶质细胞和星形胶质细胞/神经元共培养物中的pTau水平实现。

AHNAK调控的iPSC蛋白质特征在AHNAK蛋白质网络邻域中富集

我们进一步研究了AHNAK下调导致有益/保护作用的潜在分子机制。在APOE44人iPSC衍生星形胶质细胞中AHNAK下调后(图S5A)，我们观察到数百个蛋白质的表达发生显著变化(p<0.05且FC>1.1或<0.91)(图S5B)。然后，我们进行GSEA以检查AHNAK扰动蛋白质特征在AHNAK为中心的网络邻域中的过度表达。事实上，AHNAK扰动蛋白质特征在AHNAK为中心的蛋白质网络邻域中富集(NES=1.6，校正p值=4.0e-4)。基于AHNAK扰动特征，我们进一步构建了一个AHNAK调控的信号通路图，涉及代谢过程、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号、炎症和脂质代谢之间的相互作用，所有这些都与AD或认知功能相关(图7F；STAR方法)。总体而言，这些发现进一步验证了AHNAK在AD中的功能相关性。值得注意的是，来自APOE 44人iPSC衍生星形胶质细胞的AHNAK KD实验的AHNAK蛋白质组特征验证了从AD中大规模人类脑蛋白质组学数据建议的分子功能。

讨论

在本研究中，我们通过整合来自AD易感脑区(包括PHG和PFC)的大规模匹配蛋白质组学和遗传数据，为AD开发了多尺度蛋白质组学网络模型。识别并表征了数百个共表达蛋白质模块与AD的关联，顶级模块捕获了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞之间的相互作用，突显了AD中失调的胶质细胞-神经元相互作用。同时，贝叶斯因果网络揭示了数千种蛋白质之间的因果关系，并实现了对AD的KDPs的系统识别。AHNAK是AD的顶级驱动因子，也是排名最高的胶质细胞-神经元模块的枢纽基因，在iPSC-based AD模型系统中得到实验验证。AHNAK下调不仅挽救了神经退行性变，还诱导了蛋白质组变化，重现了在人类脑蛋白质组学因果网络中观察到的变化，从而证明了AD多尺度蛋白质组学建模的力量。

MSBB PHG蛋白质共表达网络中的模块M3捕获了下调神经元基因、激活星形胶质细胞基因和激活小胶质细胞基因之间的相互作用，反映了神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的通信。在M3模块中的108个KDPs中，21个(19.4%)在AD中尚未被研究，因此它们是未探索的靶点。一个顶级靶点ERBB2IP，一种在AD中上调的蛋白质酪氨酸激酶，被发现对表皮癌发生中的不良预后有贡献，在B细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥作用，并加速溶酶体生物发生和自噬。ERBIN已被证明在突触后膜与PSD-95相互作用，可能在调节neuregulin信号传导中起重要作用。ERBIN对再生轴突后髓鞘形成是必需的。ERBIN在AD中的作用仍有待阐明。另一个下调的KDP OLFM3已被证明在肿瘤微环境中充当促血管生成因子。我们之前强调OLFM3作为AD潜在的脑脊液(CSF)生物标志物。

开发AD治疗的关键步骤是靶点识别和优先排序。由于本研究开发的蛋白质网络比转录组网络和通用蛋白质相互作用网络与AD更相关，它们为开发治疗AD的下一代治疗方法提供了基础。在本研究中，我们识别了580个不同的KDPs，包括一些已知的AD蛋白质靶点，如MSNs和PRDX6。事实上，PRDX6被证明在AD中发挥功能作用，例如减弱缺血性氧化损伤和胶质细胞中的抗炎过程。这些结果支持我们的KDPs作为AD药物发现潜在靶点的有效性。

在本研究中，我们观察到中度与NL组之间要么没有DEPs，要么非常少DEPs，如图2C所示。几个因素可能导致MSBB队列中MCI和临床前AD患者脑中PHG区域缺乏可检测的蛋白质变化：(1)MSBB队列中整理的脑在PHG区域没有表现出显著的分子变化，因为我们也在PHG样本的批量RNA测序(RNA-seq)数据中发现MCI(CDR=0.5)和非痴呆(CDR=0)受试者之间没有DEGs；(2)MCI患者可能比AD患者表现出更大的分子异质性；(3)我们用于识别DEPs的标准(FDR<0.05且FC>1.1或<1/1.1)可能过于严格，因为许多先前的蛋白质组学研究使用了更宽松的截断值(例如名义p值<0.05)。使用名义p<0.05的标准，我们观察到MCI和非痴呆之间有269个DEPs，受损(CDR为0.5、1和2)和非痴呆之间有403个DEPs。需要进一步研究来解释MCI和临床前AD患者脑中PHG区域蛋白质变化的缺失。

总之，本研究通过整合匹配的遗传、蛋白质组学、临床和病理数据，开发了AD的多尺度蛋白质组学调控网络模型。我们系统地识别了参与AD发病机制的共表达蛋白质模块和蛋白质网络驱动因子，突显了一个捕获神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞之间相互作用的子网络。这些发现为揭示AD潜在分子机制和推进针对AD的下一代治疗方法的发展奠定了基础。