摘要
心室流出道（OFT）将血液输送至主动脉和肺动脉。在胚胎发育过程中，OFT分化为体循环和肺循环系统。该区域缺陷占先天性心脏病的三分之一。本研究通过两个发育阶段（胚胎期和胎儿期）及成年主动脉瓣的转录组数据，结合空间转录组技术，揭示了胚胎分子特征在成年细胞中的持续存在，并利用单细胞调控网络推导发现转录因子GATA6是瓣膜前体细胞的关键调控因子。其下游网络揭示了人类心脏缺陷的候选驱动基因，阐明了正常与病理性瓣膜发育的分子机制。研究成果定义了OFT细胞及分子特征，为先天性心脏病研究和再生医学提供了关键基础。
引言
先天性心脏病（CHD）影响约1%新生儿。OFT缺陷占所有CHD病例的三分之一。人类OFT发育在胚胎期Carnegie阶段13-23（约3周内）完成重构。该过程涉及第二心区和心脏神经嵴细胞系的协同作用。尽管模式生物研究取得进展，但人类OFT发育及成年分子特征仍知之甚少。本研究首次提供涵盖发育期与成年OFT的系统性转录组图谱，通过空间定位揭示细胞分布，并通过新型谱系追踪算法建立胚胎与成年细胞的分子关联。
研究方法
样本获取
胚胎（CS16-17）和胎儿（12pcw）OFT样本来自英国人类发育生物学资源库，成年主动脉瓣取自3名55-70岁女性心脏捐献者。样本经单核RNA测序和空间转录组分析，结合SCENIC算法推导基因调控网络。
关键技术
- 单核RNA测序：使用10x Genomics平台，靶向回收2500个细胞核/样本
- 空间转录组：10x Genomics Visium技术实现OFT区域基因表达空间定位
- 谱系追踪算法：通过胚胎期100个差异基因与成年标记基因重叠分析建立发育关联
- 数据整合：Scanpy工具实现多阶段（胚胎/胎儿/成年）数据整合分析
研究结果
OFT细胞全景图
共鉴定30,166个细胞核，分为18个簇（胚胎2簇、胎儿12簇、成年4簇）。主要细胞类型包括：
- 心肌细胞：表达MYH11（平滑肌标记）
- 内皮细胞：高表达CDH5（血管内皮钙粘蛋白）
- 间充质细胞：含瓣膜间质细胞（HAPLN1阳性）
- 神经/免疫细胞：神经嵴标记基因HOXA3/B3在胚胎期富集
GATA6调控网络
- 胚胎期簇4：SCENIC分析揭示GATA6为关键调控因子（RSS评分最高）
- 下游靶点：包含MECOM（与主动脉硬化相关）、NOTCH2（Alagille综合征致病基因）、LTBP1（TGF-β调节因子）等
- 功能验证：基因敲除小鼠显示CAT、肺动脉高压等表型
空间转录组定位
- 簇3/6：定位至主动脉外壁及分隔区，共表达DCN（成纤维细胞标记）
- 簇9：平滑肌层，高表达MYH11
- 簇12：瓣膜区，HAPLN1特异表达
谱系追踪
- 胚胎簇4：发育为成年瓣膜成纤维细胞（簇4/7）
- 胚胎簇20：贡献平滑肌细胞（簇1）和非瓣膜成纤维细胞（簇9）
- 关键证据：成年簇1/4/7保留胚胎期GATA6调控基因的显著表达
成年瓣膜异质性
成年主动脉瓣11个簇中：
- 簇1：平滑肌细胞（CALD1+, ACT1+）
- 簇3/4/5/7：瓣膜间质细胞（COL1A1, VCAN）
- 簇9：钙化相关（SPARC高表达）
- 炎症标记：簇4/7高表达CCL2（单核细胞趋化蛋白-1）
胚胎印记持续存在
- 定量验证：成年簇4/7保留胚胎簇4基因的31.2%（p<2.8×10⁻¹⁵）
- 功能意义：可能解释年龄相关瓣膜钙化的异质性
讨论
本研究首次建立人类OFT发育的时空分子图谱，揭示：
- 谱系起源：瓣膜成纤维细胞起源于内皮-间质转化，而平滑肌细胞来自神经嵴和第二心区双重贡献
- GATA6核心作用：其调控网络关联15种先天性心脏病相关基因（如NOTCH2, LTBP1）
- 胚胎记忆：成年细胞保留发育期分子特征，可能影响疾病易感性
- 转化应用：为先天性心脏病诊断提供72个候选基因，并揭示SPARC等钙化治疗靶点
研究局限性：未包含妊娠早期（<CS16）样本，且空间分辨率限于5μm。未来将结合类器官模型验证调控机制。
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