摘要
人类海马体神经发生的存在长期以来一直存在争议，其与认知功能的相关性仍不明确。近期研究已确认增殖性祖细胞和未成熟神经元的存在，以及阿尔茨海默病(AD)患者中后者的减少。然而，它们的起源以及调控神经发生和功能的分子网络仍不甚了解。本研究分析了来自不同队列的人类死后海马体样本：认知功能完好的年轻成年人、无认知障碍的老年人、具有卓越记忆能力的老年人("SuperAgers")、前临床中期病理患者以及阿尔茨海默病患者。通过多组学单细胞测序(单核RNA测序和单核染色质转座酶可及性测序)，我们分析了来自海马体样本的355,997个细胞核的特征，并确定了神经干细胞、神经母细胞和未成熟颗粒神经元。神经发生的失调主要与染色质可及性的变化相关。对区分各组的转录因子和靶基因特征的分析显示，前临床阿尔茨海默病患者的神经发生细胞中染色质可及性出现早期改变，而在阿尔茨海默病患者样本中这种变化更为明显。我们发现了"SuperAgers"中独特的神经发生特征，这可能反映了"韧性特征"。最后，星形胶质细胞和CA1神经元特征的改变控制着衰老海马体的认知功能。总体而言，本研究揭示了海马体的多组学分子特征，这些特征区分了与衰老相关的认知韧性和认知衰退。
神经发生的调控网络
为确定成年人大脑中神经发生的调控通路，我们首先分析了85,977个来自8名20-40岁认知完好的年轻成年人(YA队列)的细胞核测序数据。为确保可靠的细胞注释，我们使用了机器学习标签转移算法scANVI，将标签从两个人脑scRNA-seq数据集转移到我们的数据：一个人类发育前脑数据集和一个成年海马体数据集。基于snRNA-seq的无监督聚类在海马体中揭示了12种细胞类型，包括神经母细胞和未成熟神经元。未成熟神经元在二维均匀流形近似和投影(UMAP)可视化中出现在成熟颗粒神经元簇的外边缘。神经母细胞簇与成熟少突胶质细胞(mOL)簇部分重叠。
差异表达基因(DEGs)和通路分析比较这些簇显示，与mOL相比，神经母细胞中有4,166个DEGs和169条通路上调。其中80条通路与树突、轴突、突触后密度和神经传递通路相关。为确定这两个簇相似性的本质，我们检查了单细胞转录组学人脑图谱中观察到的替代标志物的表达水平。我们发现，少突胶质细胞相关替代标志物，如髓鞘相关糖蛋白(MAG)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，在神经母细胞中也有表达，尽管水平低于mOL。这一发现可能部分解释了UMAP上簇的视觉接近性，尽管它们的基因表达谱明显不同。
为识别神经干细胞(NSCs)及其发育轨迹，我们使用RNA速度分析了星形胶质细胞、神经母细胞、未成熟和成熟颗粒神经元簇的潜在时间。该方法基于新生和成熟mRNA比例分析细胞分化水平与mRNA半衰期之间的关联。我们观察到几个亚簇。通过机器学习识别的未成熟神经元的潜在时间低于成熟颗粒神经元。确定了两个潜在时间大于星形胶质细胞但低于未成熟神经元的亚簇。一个亚簇被验证为上述神经母细胞簇。与星形胶质细胞相比，检查另一个亚簇发现766个DEGs(671个上调，95个下调)。通路分析显示，65条通路中有25条与神经发育相关，包括轴突发育、兰氏结、初始段、生长锥、轴突引导、树突棘和突触后密度。该簇被指定为NSCs。RNA速度分析揭示了从NSCs到星形胶质细胞亚簇，然后通过未成熟神经元向神经母细胞再到成熟颗粒神经元的定向流动，支持成年海马体中存在发育轨迹。与啮齿类动物报道类似，与神经母细胞和未成熟神经元相比，人类NSCs表达高水平的干性替代标志物和低水平的神经元标志物。
snATAC-seq分析通过染色质可及性实现了干性的正交评估。我们观察到NSCs中与多谱系潜能相关的区域具有高染色质可及性，而神经母细胞和未成熟神经元中神经元成熟替代标志物表现出高水平的开放染色质。将我们的神经发生特征与先前观察到人齿状回神经发生的研究进行比较，显示出高度一致性。我们通过将其应用于未预期神经发生的大规模scRNA-seq全脑数据集，进一步验证了我们的神经发生特征。该分析证实了我们的神经发生特征具有高特异性。
NSCs中的顶级DEGs和差异可及区域(DARs)在神经母细胞中下调，在未成熟神经元中进一步下调。相反，神经母细胞中的顶级DEGs和DARs在NSCs中下调。其中一些基因在未成熟神经元中进一步上调，而其他基因则维持其表达水平或下调。在未成熟神经元中识别的顶级DEGs在NSCs中表达水平低，在神经母细胞中中等，这与该轨迹中的转录组谱转变一致。发育通路，如β-连环蛋白和基底外侧质膜，在NSCs中富集，并在神经母细胞和未成熟神经元中下调。在未成熟神经元中富集的通路与突触功能和可塑性相关。基序富集统计显示，NSCs中的顶级基序是信号转导因子STAT转录因子(TFs)家族(如STAT3、STAT4和STAT5)、PLAGL1和NFIB的基序。相比之下，在未成熟神经元中，这些是RFX2、FOS-JUN、NFE2、MEIS2和PBX2。这种模式表明，从NSCs中促进干细胞维持和增殖的TFs活动转变为未成熟神经元中调控神经元分化和成熟的TFs，为进一步支持海马体中的发育轨迹提供了证据。
配对的snRNA-seq和snATAC-seq数据使我们能够使用TF-峰-基因三元组方法和增强子驱动的基因调控网络(eRegulons)确定神经发生的基因调控网络(GRNs)。神经发生轨迹显示，NSCs中最强的相互作用在神经母细胞中下调，在未成熟神经元中进一步下调。相比之下，NSCs中不存在的相互作用在神经母细胞中轻度上调，在未成熟神经元中上调程度更大。相互作用的幅度在所有细胞类型中发生变化，而其调控方向保持一致。不同的eRegulon网络控制每种细胞类型。NSCs中最突出的eRegulons是RORA、RORB、SMAD1、ZNF98、SOX6、PRRX1、NFIA、GLIS3、BCL6和ETV6。在神经母细胞中，这些是ZNF740、ZNF180、THRA、NFE2L1、NEUROD1、FEZF2、EGR1、EGR3、E2F1和NRF1的抑制因子。在未成熟神经元中，主要eRegulons是ZNF589、ZNF519、TFDP1、ONECUT2、MTF2、MTA3、GLIS1和E2F3，以及SOX2和MXI1的抑制因子。总之，这些单核多组学分析确立了成年人大脑中神经发生的多方面分子框架。
改变由DARs驱动
为检查年龄和认知诊断对神经发生的影响，我们对来自健康老年人(HA队列；n=8，73,093个细胞核测序)、前临床中期病理患者(PCI队列；n=6，58,281个细胞核测序)或阿尔茨海默病患者(AD；n=10，87,209个细胞核测序)的海马体分离的细胞核进行了测序。还分析了"SuperAgers"(SA队列；n=6，51,437个细胞核测序)的海马体样本；这些个体被定义为年龄80岁或以上，其在情景记忆测试中的表现等于或优于50-59岁个体。
在YA组中观察到的所有细胞类型在其他组中都被检测到。然而，与HA队列相比，PCI和AD组中NSCs的数量显著增加。此外，与HA和YA组相比，AD组中神经母细胞和未成熟神经元的平均数量显著减少。与PCI组相比，AD队列中未成熟神经元的数量也显著减少。神经发生的大多数与年龄和诊断相关的改变在DARs数量上比在DEGs中更为明显，这表明染色质可及性的表观遗传差异代表了与认知衰老相关的不同分子特征，比差异mRNA表达更为稳健。具体而言，大多数DEGs在NSCs中观察到，只有172个DEGs区分AD和HA组，AD和PCI之间6个，AD和YA之间154个，SA和其他诊断队列之间18个。随着年龄和诊断，NSCs中上调或下调的DEGs和DARs数量大致相等。
检查所有神经发生细胞的DEGs和DARs作为诊断功能的组合显示，与其他条件相比，AD组中基因和开放染色质区域的方向性相反。基于DAR的基序富集显示，不同可及染色质区域中识别的顶级基序属于锌指TF家族，而最下调的基序属于调节因子X(RFX)家族，两者都是发育和细胞生长及分化的关键驱动因素。值得注意的是，我们确定了一组在PCI队列中与YA、HA和SA组相比，特异性在神经母细胞和未成熟神经元中下调的DARs。这些DARs在AD组中进一步下调。我们认为，染色质可及性的这种改变先于PCI中相应RNA表达特征的变化。我们将这些峰与GRN分析整合以识别推断的靶基因，然后进行通路富集分析。该过程揭示，大多数通路与神经元结构和功能的维持、突触可塑性和神经元发育相关。总之，这些结果表明，DARs的下调导致神经发生的改变，作为认知衰退的函数，而随着年龄增长的最早改变发生在NSCs中。此外，AD组中神经母细胞和未成熟神经元中的大多数DARs和DEGs显著下调，与突触可塑性和神经传递相关的DARs可能作为神经发生病理改变的早期标志。
年龄和诊断调控网络
接下来，我们试图确定随着衰老和疾病调控神经发生改变的最强GRNs。使用SCENIC+，它将单细胞染色质可及性和基因表达数据与基序发现相结合，以推断增强子驱动的GRNs(eGRNs)，我们确定了这些过程的eRegulons。基于eRegulon的UMAP可视化显示NSCs构成了一个独特的簇，这一结果进一步突显了NSCs在GRN水平上的特征分子特征。这一发现通过基于eRegulons的SCENIC+ eRegulon扩散得到验证，该方法基于eRegulons揭示了NSCs、神经母细胞和未成熟神经元的谱系连续性。
为识别与认知衰退中神经发生相关的eRegulons，我们检查了与HA队列相比在PCI和AD组中改变的顶级eRegulons。我们观察到一组独特的eRegulons，它们驱动HA组中的神经发生，而与PCI和AD条件不同。驱动HA组中神经发生的六个顶级eRegulons中有五个在PCI和AD组中下调。相反，一组单独的eRegulons在PCI中上调，在AD中进一步上调。值得注意的是，在七个上调的eRegulons中，五个(ZNF98、SMAD1、RORB、PRRX1和NFIA)构成了YA队列中NSCs的顶级eRegulons。这一发现可能部分解释了AD中NSC数量的显著上调。检查HA、PCI和AD组中的细胞类型特异性eRegulons显示，这一结果可能是由于与HA队列相比，PCI和AD组中NSCs中NFIA抑制因子的下调。此外，不同的激活剂和抑制剂eRegulons集合控制这三个认知队列中的NSCs。具体而言，ZNF565、ONECUT2激活剂和SOX6、PAX6和ARNT2抑制剂在PCI中上调。这些因子在AD中被RXRG、RARG、NFIC和KLF5激活剂取代。
检查所有诊断条件揭示了几个值得注意的发现。首先，与所有其他条件相比，SA具有独特的特征，其中TFDP1、ONECUT2和GLIS1激活剂以及SOX2、MXI1和FOXO3抑制剂上调。其次，AD中唯一上调的激活剂特征，而其他特征显著下调，包括ZNF98、ZNF423、ZIC1、RORB、RARG、PAX6、NFIA和CPSF4。第三，由衰老驱动的特征，特别是ZNF580、SOX15、IRF3、E2F4和CHURC1激活剂。总之，这些结果表明，作为认知诊断函数的神经发生改变是由代表cis调控元件、TFs和靶基因之间改变的网络相互作用的不同GRN组合集合驱动的。
神经发生的韧性特征
在确定神经发生在认知衰退中发生改变后，我们接下来试图确定认知韧性的特征，特别是在SA队列中。SA组的细胞丰度分析显示，与其它队列相比，SA组中未成熟神经元的数量显著增加。然而，我们担心这种效应主要是由于一个具有高数量未成熟神经元的离群样本。但即使排除该样本后，我们仍观察到未成熟神经元增加了2.5倍。与AD队列相比，SA组中未成熟神经元的丰度显著增加，无论是否排除该样本。与HA、YA和PCI队列相比，SA组中未成熟神经元的数量增加了约两倍，尽管这一结果不显著。我们还观察到SA组中神经母细胞数量显著多于AD组。
检查SA组中的神经发生特征显示，未成熟神经元和神经母细胞的这种独特特征主要可归因于DARs。具体而言，在SA队列与其它组相比中，未成熟神经元中有7,058个DARs和神经母细胞中有674个DARs上调。相比之下，NSCs中观察到的改变很少。神经母细胞和未成熟神经元中上调了少数关键基因，如BDNF(编码脑源性神经营养因子)和CALB1。下调基因包括NEUROD6和NECTIN3，它们与载脂蛋白E(APOE)一起，参与突触可塑性。
为确认神经发生中是否存在韧性特征，我们计算了韧性评分，该评分被定义为识别AD组相对于YA、HA和SA队列的DEGs和DARs的一致效应模式。我们计算了每次比较的倍数变化，韧性评分是这些乘积的几何平均数。在神经母细胞和未成熟神经元中观察到明显的特征，其中大多数基因和峰在YA、HA和SA中表现出稳定的表达水平，而在AD中显著下调。这种模式在开放染色质区域中尤为明显。在NSCs中，一些基因和峰的表达水平随年龄或认知诊断而变化。
NSCs中每个细胞类型前500个韧性基因中富集的通路(FDR<0.05)与增殖和生长的细胞过程相关。在神经母细胞中，顶级通路是线粒体和内体通路以及突触小泡内吞作用。在未成熟神经元中，这些是RNA结合和蛋白质结合、细胞质和轴突通路。在未成熟神经元中前500个韧性开放染色质峰中富集的基序包括锌指蛋白TFs，这些蛋白参与促进神经元分化(FDR<0.05)。
为识别支撑认知韧性的最强网络，我们检查了SA组中的顶级eRegulons。我们观察到YA和SA组之间eRegulons的共同特征。具体而言，与YA组类似，SA队列中NSCs的顶级激活剂是ZNF98、SOX6、RORB、PRRX1、ETV6和BCL6，共同抑制剂是SOX2和MXI1。同样，YA和SA组中的未成熟神经元共享以下共同激活剂eRegulons：ZNF589、TFDP1、ONECUT2、MTF2、MTA3、GLIS1和E2F3。共同抑制剂是SOX2和MXI1。SA组样本还表现出独特的eRegulons。具体而言，未成熟神经元中的激活剂eRegulon PROX1，以及NSCs中的ZNF423、ZIC1、SOX2和NFE2L2。此外，SA组的NSCs表现出一系列在YA组中不活跃的抑制剂。
值得注意的是，在YA队列中，神经母细胞显示出由NEUROD1、FEZF2、EGR1、EGR3、E2F1和THRA驱动的强烈分化相关eRegulon特征。这种协调程序在SA中完全缺失，SOX2和NFE2L2是SA中唯一活跃的激活剂。相反，SA组的神经母细胞表现出一系列在YA队列中不活跃的抑制剂。总之，这一结果表明，YA和SA组中调控神经发生的转录组景观发生了转变。
SA组中的独特eRegulon特征在与所有其他诊断队列的比较中也很明显。在未成熟神经元和神经母细胞中，特定eRegulons的强烈上调伴随着抑制剂和大多数激活剂的显著下调。在神经母细胞中，这包括NEUROD1和NRF1抑制剂的下调，同时FOXO3和MXI1抑制剂上调。值得注意的是，NSCs中大多数激活剂和顶级抑制剂下调，这可能部分解释了在SA组NSCs中观察到的DEGs和DARs的稀缺性。
鉴于这些结果，我们接下来询问SA的独特特征是否由衰老驱动。我们观察到，尽管SA的特征表现出一些衰老效应，但大多数变化独立于衰老。具体而言，在NSCs中，激活剂E2F1和抑制剂NFIB在HA和SA组中均下调；因此，这些因素可能代表神经发生中由衰老引起的改变。同样，在YA组中占主导地位的激活剂CEBPZ在HA和SA队列中下调。然而，与HA相比，驱动SA组NSCs和未成熟神经元的是一组独特的eRegulons，特别是在NSCs中上调ZBTB21、NFE2L2、MBNL2、FOS、EGR4和EGR1激活剂，以及在未成熟神经元中上调ZBTB7A、NFE2L1、ELK1和EGR3激活剂。然而，我们不能排除在SA组样本中检测到的独特eRegulons是衰老驱动改变的结果。支持这一理论的是，HA和SA组中神经母细胞的特征相似。总之，这些结果突显了控制SA中神经发生的特定分子网络，可能有助于认知优越性。
成功或失败的衰老
我们接下来试图确定维持海马体认知完整性(HIPPI)或导致病理性衰老的分子信号。为此，我们检查了在SA组与HA队列相比中差异表达的信号，以及在PCI组与HA和YA组相比中表现出相反趋势的信号。我们观察到1,001个DEGs和579个DARs。大多数DEGs出现在CA1神经元中，而大多数DARs出现在星形胶质细胞中。在少突胶质细胞祖细胞(OPCs)和mOLs中也观察到DEGs和DARS的显著改变。
值得注意的是，CA1神经元中HIPPI中最显著的包括在神经元功能和神经传递中起作用的基因；例如，GABRB1、NRGN和KCNF。同样值得注意的是小胶质细胞中的APOE，以及将受体(包括1组代谢型谷氨酸受体)与神经元蛋白连接的EGR1和GRASP。还确定了以下关系：抑制性神经元中的谷氨酸代谢型受体GRM8；以及成熟颗粒细胞(mGCs)中的KCNE、GRIN2B、GRIA1和GRIK1。
总之，这些结果表明，维持有效的神经传递、突触可塑性和氧化还原平衡是成功认知衰老表型的核心，而它们的破坏标志着向PCI的转变。除突触和细胞稳态外，CA神经元中HIPPI基因的通路分析揭示了细胞质核糖体通路、能量代谢以及线粒体、内体和溶酶体通路。星形胶质细胞中的DARs及其基序分析揭示了众多FOS-JUN碱性亮氨酸拉链因子(bZIP)。
为检查HIPPI DEGs和DARs对神经发生的影响，我们分析了神经发生细胞、星形胶质细胞和CA1神经元配体-受体信号之间的CellChat分析。我们分析了每个诊断组中星形胶质细胞和CA1神经元的GRN，并计算了跨诊断组的相同TF-峰-基因相互作用强度的"衰老评分"比较。最显著的通路与突触复合物neurexin-neuroligin(NRXN1-NLGN)相关，包括阿尔茨海默病相关的类钙粘蛋白calsyntenin蛋白(例如，NRXN1-CLSTN1和NRXN1-CLSTN2)、NCAM1、contactin(CNTN)、APP-SORL1和谷氨酸能受体(例如，Glu-SLC17、GRIAs；Glu-SLC17、GRIK2；和Glu-SLC17、GRMs)。SA和HA组中增强的突触粘附和谷氨酸能通信与PCI和AD组中的减弱形成对比。这一结果表明，兴奋性突触完整性的维持是健康认知衰老的标志，也是预防认知衰退的潜在干预靶点。
讨论
通过使用具有不同认知功能特征的个体的人类海马体样本的snRNA-seq和ATAC-seq，并整合和分析这些数据，本研究为人类神经发生提供了关键见解。首先，我们分析了来自20-40岁无已知认知缺陷和无痴呆相关蛋白病的年轻成年人的死后样本中调控成年人大脑海马体神经发生的分子网络。我们观察到从NSCs到成熟颗粒神经元通过神经母细胞和未成熟神经元的神经发生轨迹。我们识别的NSC簇包含具有不同潜在时间的几个亚群，可能代表NSCs和神经祖细胞的不同状态。未来具有更高灵敏度的分析可能有助于更清晰地识别NSC亚群。
我们通过将其与先前观察到人齿状回神经发生的研究进行比较来验证神经发生特征，并通过将其应用于未预期神经发生的大规模scRNA-seq全脑数据集进行验证。如预期，这些研究中的大多数脑区显示缺乏NSCs，这与成年人大脑中的神经发生仅限于海马体齿状回等区域的概念一致。偶尔在其他脑区中鉴定出零星细胞作为NSCs。然而，鉴于测序组织通常来自粗略定义的冷冻块，我们不能排除这些是存在于标记为其他脑区的脑块中的齿状回神经发生细胞的可能性。我们自己的样本经过验证，确认我们处理和激光显微切割以富集齿状回的每个冷冻组织块中都存在齿状回。鉴于这两项研究中个体之间的高度变异性以及参与者不同的年龄和认知状态，我们得出结论，我们的NSCs被正确注释。
我们展示了神经发生通过共享的基因集、染色质可及性的独特特征及其调控网络表现出来，这些特征清晰地定义了细胞表型和成熟水平。第二，我们检查了随着年龄和认知诊断而改变的调控神经发生的调控网络。DEGs和DARs的最早改变发生在NSCs中，随着衰老，可能导致AD中神经母细胞和未成熟神经元中DARs的显著改变。第三，我们确定了PCI中的DARs，这些DARs可能代表向AD发展的分子进展轨迹。与这些DARs相关的下调通路与突触可塑性和神经传递相关。靶向它们可能减弱或防止AD中神经发生的恶化。第四，我们确定了与年龄和认知衰退相关的神经发生改变相关的eRegulons。靶向这些网络可能预防或减弱神经发生的改变，这可能表现为认知衰退的减弱。
第五，我们确定了与认知韧性相关的神经发生分子网络。除了与其它条件相比表征SA中神经发生的基因、开放染色质区域、通路和基序外，我们还检查了在YA和HA组中维持在SA中，同时在PCI和AD中显著表现出相反方向性的信号。该特征代表了可能与维持衰老中完整认知功能相关的神经发生调控机制。值得注意的是，我们观察到SA中未成熟神经元数量总体增加；然而，样本间变异性大和样本数量少限制了我们分析的效力。应该注意的是，细胞类型丰度的样本间高度变异性限制了我们研究的定量效力。未来需要更多人类脑样本的实验来深入研究这一方面。
人类大脑多组学分析的一个关键限制是样本量有限和人类脑样本中存在的大变异性。随着多组学测序在具有明确认知功能的人类大脑中更广泛地应用，未来研究将有助于进一步阐明染色质可及性与mRNA表达之间差异的稳健性。DEGs数量少与年龄和功能表型中DARs数量显著更高之间的一个解释可能是mRNA稳定性取决于收集方法差异的短暂性质。相比之下，DNA的染色质可及性不太可能依赖于收集时间和程序的差异。或者，mRNA差异也可能更能指示大脑对刺激的急性反应，而染色质可及性可能是潜在神经元状态的更稳健和一致的指标。
第六，我们确定了SA中的神经发生由一组独特的GRNs引导。最后，我们确定了海马体中促进具有完整认知的健康衰老(HIPPI)或认知衰退的分子信号。我们表明，这些改变在CA1神经元中的DEGs和星形胶质细胞中的DARs中最明显，并确定了调控这些相互作用的假定调控网络。谷氨酸能通路引领CA1、星形胶质细胞和神经发生之间的相互作用，可能决定成功与失败衰老的十字路口。CA1中的这些改变可能导致AD中CA1神经元数量显著减少。这些数据表明，细胞-细胞相互作用可能在记忆形成和认知功能中起作用。
总之，本研究描绘了海马体神经发生的分子特征及其随着年龄和认知状态的改变。神经发生谱系中染色质可及性的显著差异表明，表观遗传差异代表了与年龄相关的认知损伤轨迹的更明确特征，比仅通过基因表达分析观察到的特征更为明确。本研究通过推断DARs和靶基因之间的相互作用，分析了最显著的增强子驱动GRNs，并确定了支撑认知韧性的分子网络。证明与人海马体神经发生细胞相关的此类表观遗传特征，突显了确定潜在分子机制的重要性，以开发旨在维持衰老过程中认知功能的未来靶向治疗。
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