冠状动脉疾病（CAD）是全球致死的主要原因。近年来，数百个基因组位点被证实与疾病风险增加有关，然而风险位点信号背后的分子机制仍不清楚。本研究整合来自超过100万人的最新冠心病遗传学统计数据，以及45种细胞类型的表观遗传数据，以鉴定其调控受变异影响的基因和转录因子。通过两种统计学方法，我们识别出1580个候选疾病基因，其中23.5%为非编码RNA基因。富集分析和全表型组关联研究将这些候选基因与疾病特异性通路和风险因素联系起来。我们通过对非编码RNA基因IQCH-AS1在人前脂肪细胞系中进行敲除，开展了概念验证的生物学验证。本研究不仅以细胞类型特异性方式指出了CAD候选基因，还突出了一个此前研究不足的非编码RNA基因在CAD遗传学中的作用。
引言
过去15年，全基因组关联研究（GWAS）在常见复杂疾病的遗传发现上呈爆炸式增长。对于冠状动脉疾病（CAD），已有超过300个基因位点达到全基因组显著性水平，加深了对疾病病理的理解。除了遗传发现，填补遗传变异与疾病风险之间的空白是一项重大挑战。为此，功能研究对于揭示相关分子机制以及指导新的诊断和疗法开发不可或缺。重要的是，GWAS信号大多位于基因组的非编码区域，这表明基因调控改变在病因学中起主要作用。因此，需要阐明下游的因果基因及作用的细胞类型，从而精确定位CAD的生物学机制。迄今为止，已通过各种独立或联合的方法，通过评估以下方面来优先考虑CAD位点中的因果基因：1）生物学合理性；2）与CAD相关的罕见编码变异；3）ClinVar中与CAD相关的可能致病变异；4）心血管药物的证据；5）孟德尔随机化研究的因果关系；6）与领导性CAD变异高度连锁不平衡的蛋白质改变变异；7）CAD相关组织中的表达数量性状位点（eQTL）；8）敲除小鼠模型中的心血管相关表型。然而，仍有GWAS位点无法通过这些方法与基因相关联。在这些方法中，eQTL分析贡献了最多的候选基因，但eQTL可能仅解释GWAS遗传力的一小部分。除转录组学之外，更多样化的功能基因组读数对于识别疾病机制至关重要。表观基因组调控细胞中的基因表达，并介导遗传变异对环境变化的反应。虽然零星的研究探索了CAD位点上的组织水平染色质状态或表观遗传标记，但CAD遗传学的表观遗传学方面仍研究不足。
在本研究中，我们通过整合来自超过100万人的遗传汇总统计数据和45种疾病相关细胞类型的调控元件，系统性地研究了CAD遗传学的细胞类型特异性表观遗传回路。简言之，我们利用一种方法识别可能影响转录因子（TF）结合的变异，并结合细胞类型特异性的调控元件与基因相互作用，以及基于基因的关联检验。我们识别出1580个CAD位点的候选基因，其中798个未被以前报道的方法检测到。除了常见探索的蛋白质编码候选基因外，我们的分析还允许广泛检查CAD相关的非编码RNA（ncRNA）基因，而这些基因通常因转录组基础因果优先级中测序深度不足或功能解释困难而被忽视。此外，我们通过在人前脂肪细胞系中敲除新型候选CAD基因IQCH-AS1（一种长非编码RNA）进行了生物学验证，以确认我们分析的可靠性并增进对CAD机制的理解。
结果
细胞类型特异性注释CAD相关SNV
为探索CAD遗传学的表观遗传和细胞类型特异性效应，我们获取了来自超过100万人的人类最新CAD GWAS汇总遗传统计数据，以及来自45种疾病相关细胞类型的批量或单细胞表观遗传数据（图1a）（补充数据1、2）。这些细胞类型基于潜在的临床相关性进行人工优先排序，最终选择由数据可用性决定。47,635个CAD相关单核苷酸变异（SNV）（≤1% FDR）以及24,799个连锁不平衡（LD）SNV（R²≥0.8）总计72,432个CAD-SNV被纳入分析（补充数据3）。基于Ensembl变异效应预测器（VEP），大多数（67.1%）CAD-SNV为内含子变异，不到10%的变异可能具有更强效应，如错义、UTR或剪接区域SNV（图1b）。除了使用VEP的一般注释外，我们进一步研究了CAD-SNV与45种细胞类型表观遗传图谱的重叠，这些细胞类型涵盖12个细胞谱系，包括淋巴、血液、髓系、红系、内皮、肌原、神经、脂肪、成纤维、肝、上皮和间充质细胞。平均每种细胞类型识别出121,376个顺式调控元件（CRE），总计1,243,265个来自45种细胞类型的CRE。18.73%的CAD-SNV位于CRE中，其中14.49%位于基因内CRE，4.24%位于基因间CRE（图1c）。在位于CRE的CAD-SNV中（N=13,563），39.80%（N=5,397）影响了预测的转录因子结合（TF-SNV），意味着它们显著增加或减少了TF结合基序与DNA序列的匹配程度（图1d）。从CRE的角度看，0.71%（N=8,864）的CRE包含CAD-SNV，其中47.89%（N=4,233）的CAD-SNV同时也是TF-SNV。跨细胞类型共享的CRE比细胞类型特异的CRE更可能包含CAD-SNV或TF-SNV（双尾Fisher精确检验，p值均≤0.0001；CAD-SNV的log2比值比1.46；TF-SNV的log2比值比1.68）。就含有TF-SNV的CRE比例而言，血管和免疫细胞是领先的细胞类型，如内皮细胞（EC）、平滑肌细胞（SMC）、成纤维细胞、T细胞、单核细胞和中性粒细胞（图1e），这与它们在心血管健康中的关键作用一致。957个TF-SNV位于神经元的CRE中，这与神经免疫界面在动脉粥样硬化中的作用相呼应。
图1：分析概览及冠状动脉疾病（CAD）相关单核苷酸变异（SNV）的细胞类型特异性注释。a 项目概述。CAD的GWAS与表观基因组数据以及预测的顺式调控元件（CRE）到基因的相互作用在45种细胞类型中相结合。使用注释转录因子（TF）SNV的工具（SNEEP）和基于基因的关联检验（GATES）识别候选CAD基因。结果辅以CAD患者数据、PheWAS分析以及候选CAD基因的功能验证。使用BioRender创建。b 使用Ensembl变异效应预测器（VEP）注释的CAD-SNV（p值≤2.52E-5及连锁不平衡中的SNV）的功能后果。每个变异仅考虑一个后果。c CAD-SNV相对于基因和CRE的位置。d CAD-SNV、TF-SNV和位于任何细胞类型CRE中的SNV的维恩图。e CAD-SNV和TF-SNV与CRE的重叠按细胞类型和组织，按谱系分组。谱系按含有CAD-SNV的CRE平均分数排序。NK细胞自然杀伤细胞，DC树突状细胞，BFU红系爆裂形成单位红系，CFU红系集落形成单位红系，CM心肌细胞，EC内皮细胞，SMC骨骼肌细胞，FB成纤维细胞。源数据以源数据文件形式提供。
表观遗传数据揭示新的候选CAD基因
基于45种细胞类型的表观遗传数据（图1e），我们使用两种互补方法优先考虑CAD的候选基因，即基于基因的关联检验（GATES）和利用SNEEP进行的基因优先级排序（方法，补充图1a，补充数据4）。GATES是一种常见的方法，它汇总基因体内所有SNV，考虑其LD结构；而SNEEP则通过识别TF-SNV并根据预测的CRE-基因相互作用将其与基因关联，从而观察表观遗传后果。这些CRE与基因之间的相互作用是为每种细胞类型分别构建的。我们通过GATES获得了1387个基因，通过SNEEP获得了503个基因，总计1580个候选CAD基因（补充数据5）。我们将我们的候选基因与其他遗传研究报告的CAD基因以及通过GWAS-eQTL共定位分析（使用来自基因型-组织表达（GTEx）和斯德哥尔摩-塔尔图动脉粥样硬化反向网络工程任务（STARNET）项目的CAD相关组织类型的基因型转录组数据）鉴定的基因进行了比较。在1580个基因中，有782个与已报告的CAD基因或CAD eQTL基因重叠，相对于其他研究或方法，基因的重复率为49.49%（图2a，补充图1b, c）。798个基因是通过我们的表观遗传学-GWAS整合优先考虑的新型CAD候选基因。基因集富集分析显示，脂质代谢、TGF β、VEGFA和白细胞介素11信号传导是由1580个候选基因介导的CAD风险的主要通路（图2b，补充数据6），这与已知的疾病通路一致。我们的分析还指出了一条与ncRNA相关的通路，即ECM和膜受体中的miRNA靶标，与CAD相关。我们的1580个候选基因包含1208个蛋白质编码基因和372个ncRNA基因（图2c，补充图1c）。与其他三个来源相比，我们的表观遗传整合识别出了最高比例的ncRNA基因，包括众所周知的心血管疾病（CVD）ncRNA CDKN2B-AS1和microRNA132（MIR132）（图2c，补充图1c, 2b）。
图2：候选冠状动脉疾病（CAD）基因的特征。a 候选CAD基因、已知CAD位点基因和通过eQTL共定位分析发现的基因的交集。在维恩图中，Coloc指通过GTEx和STARNET发现的基因的联合集。b 候选CAD基因的GO术语富集。显示的是WikiPathways数据库前20个富集术语中的选定术语（来自g:Profiler的调整后p值，不含冗余术语，对于家族性高脂血症，所有五种类型的调整后p值取平均值）。c 来自(a)的基因集中蛋白质编码和非编码RNA基因的比例。d 在STARNET各组织和来自慕尼黑血管生物库（MVB）的动脉粥样硬化斑块中差异表达（DEG，FDR≤5%，绝对log2FC≥0.3）的候选基因数量。e 候选基因的表达广度，按基因生物型区分。f 每个具有转录因子单核苷酸变异（TF-SNV）的基因的顺式调控元件（CRE）数量，按基因生物型区分。仅显示通过TF-SNV发现的基因（N=503）。带有TF-SNV的CRE在所有细胞类型中合并，其中基因在其启动子处有CRE，因此被认为是活跃的。g 通过TF-SNV并按谱系分组的候选CAD基因数量（箱线图由分配给谱系的细胞类型形成，中心线为中位数，箱体限为四分位距，须线延伸至1.5倍四分位距）。h 按合并的带有TF-SNV的CRE数量排名前20的基因的热图（如(f)所述）。每个基因添加了额外证据（补充数据5）。如果基因在细胞类型中不被视为活跃，则该细胞类型中带有TF-SNV的CRE数量设为零。源数据以源数据文件形式提供。
我们调查了我们的候选基因中有多少在CAD病例与对照相比有显著差异表达。为此，我们使用了两个数据集。首先，对来自接受颈动脉内膜切除术的患者的145个早期（对照）和57个晚期（病例）人类颈动脉斑块病变进行RNA测序（慕尼黑血管生物库）。其次，来自CAD病例和对照的五个组织的RNA数据（STARNET），即内脏腹部脂肪、皮下脂肪、动脉粥样硬化主动脉根部、肝脏和骨骼肌（每种组织≥500例病例和≥100例对照）。值得注意的是，我们的候选基因中共有1276个（81%），包括165个非编码RNA基因，在至少一个组织中差异表达（图2d）。许多基因在多个组织中差异表达，我们候选基因的16%在两个队列的所有组织中均差异表达，29%在STARNET的所有组织中差异表达（补充图1d）。
为了说明候选CAD基因在不同细胞类型和组织中的表达，我们确定了它们在IHEC EpiATLAS中的表达广度，该广度衡量基因在多少种细胞类型中表达（图2e）。正如预期，大多数蛋白质编码基因在许多细胞类型中表达，而ncRNA基因大多表现出细胞类型特异性表达。由SNEEP优先考虑的503个基因在所有细胞类型中平均有4.5个含有TF-SNV的CRE（图2f）。通过TF-SNV鉴定的CAD基因数量因细胞类型而异（图2g）。髓系和造血祖细胞具有最高数量的受TF-SNV调控的基因，尽管变异相当大。令人惊讶的是，许多基因（N=503）在不同细胞类型中通过TF-SNV被鉴定，且没有强烈的遗传连锁迹象，这表明同一基因与一系列不同的调控性CAD-SNV相关联（图2f）。
在含有TF-SNV的CRE数量最多的前20个基因中，10个是已知的CAD基因，15个也通过GWAS-eQTL共定位分析鉴定，14个在小鼠中保守（图2h，补充图2）。排名靠前的基因SMG6（端粒酶结合蛋白EST1A）有21个含有TF-SNV的CRE，主要存在于血液和免疫细胞中。SMG6通过影响转录后RNA甲基化的SNV、eQTL数据共定位以及TF结合分析，被认为与CAD有关。据我们所知，B3GNT8（β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶8）尚未被证实与CAD有关。然而，B3GNT蛋白与糖尿病和免疫系统过程相关，这些都是CAD的风险因素。三个具有高数量TF-SNV含有的CRE的ncRNA基因之一是CDKN2B-AS1。CDKN2B-AS1位于首个被发现且至今仍最强的CAD GWAS位点，即9p21位点。该位点的候选基因及其作用机制对于CAD的研究一直具有挑战性。我们发现CDKN2B-AS1是该位点的候选因果基因，在10个不同的CRE中有11个TF-SNV，这些CRE主要在免疫细胞中活跃（补充图3，补充数据16）。
遗传信号精确定位CAD相关转录因子
由于大部分CAD-SNV似乎影响TF结合（图1d），我们进一步研究了相关的TF。使用SNEEP-TF检验来发现比偶然情况下更频繁受CAD-SNV影响的TF（比值比≥5，方法）。对45种表观基因组样本细胞类型分别进行分析，揭示了38个TF（CAD-TF），其结合在至少一种细胞类型中因CAD风险等位基因而改变（图3a，补充数据7）。在预测的CAD-TF靶基因中，有蛋白质编码和ncRNA基因，其中几个是已知的CAD GWAS基因或候选CAD基因。26个TF的预测结合在超过一种细胞类型中受影响。值得注意的是，AP-1家族TF的结合仅在脂肪细胞中富集，包括BATF3、FOSB和FOS，以及二聚体FOS::JUND、FOSL2::JUN和FOS::JUN。虽然AP-1家族TF执行多种功能，但其成员已被特别证明参与小鼠脂肪细胞的分化和凋亡。Zhao等人发现AP-1家族的TF调控已知的CAD基因SMAD3和CDKN2B-AS1，这些也在我们的CAD候选基因集中。这些数据强调了脂肪细胞或脂肪组织在CAD中的作用。
图3：冠状动脉疾病（CAD）风险等位基因影响转录因子（TF）结合。a 受TF单核苷酸变异（SNV）结合影响的CAD-TF的细胞类型特异性富集。每个TF调控不同数量的靶基因。堆叠条形图（左侧）可视化了靶基因中与CAD相关的分数和生物型。b, c 使用STARNET数据对CAD-TF进行差异表达分析（来自edgeR的调整后p值≤0.05，绝对log2FC≥0.3），在所有(b)或单个STARNET组织(c)中。d 具有eQTL支持（GTEx）的CAD-TF及其相关的生物学过程和通路（来自g:Profiler的调整后p值）。e KLF16的TF基因失调（log2倍变化，条形图）以及相关TF靶基因在不同STARNET组织中的表达失调（log2倍变化，小提琴散点图）。调整后p值≤0.05且绝对log2FC≥0.3的基因被定义为差异上调或下调（黄色和绿色表示）。源数据以源数据文件形式提供。
进一步使用STARNET项目中对照和CAD患者疾病相关组织的转录组数据进行分析显示，大多数CAD-TF（N=29）在所研究的组织中差异表达（图3b，补充数据8）。在每个组织内，平均44.7%的CAD-TF表现出差异表达（图3c）。调控TF结合的CAD-SNV也在CAD相关组织中被鉴定为eQTL，构成了疾病相关TF的独立证据。TF CTCFL、TFAP2E和ZNF610具有最高的eQTL支持，eQTL基因参与CAD相关通路，如免疫反应和炎症、脂质代谢、TGF β信号传导和血管重塑通路（图3d，补充数据9、10）。有趣的是，调控TCFL5结合的CAD-SNV的eQTL基因富集于神经支配和突触传递，这是CAD的一个新发现通路。此外，我们观察到几个TF在STARNET的动脉粥样硬化主动脉根部组织中上调或下调，同时在脂肪、肝脏和骨骼肌中表现出相反的调控。一致地，我们也观察到其靶基因表达的组织特异性变化。一个在患者组织中具有此类表达变化的TF例子是KLF16（图3e）。已有研究表明，KLF16本身以及Krüppel样家族的其他TF参与CVD并在心血管系统中发挥多种功能。还观察到其他TF的类似组织特异性效应，包括PATZ1、BHLHA15、KLF7和ZNF93（补充图4）。
候选基因与心血管风险因素相关
为了研究已识别的CAD候选基因的相关性，我们对1580个候选基因的组织eQTL进行了全表型组关联研究（PheWAS）（补充图5a）。为了以无偏方式进行，我们从候选基因列表开始，而未添加任何先前分析的其他信息。然后，我们将基因的外部eQTL数据与相关特征的GWAS数据进行共定位。PheWAS数据集来自常见代谢疾病知识门户，包括29个CAD风险因素特征的最新GWAS汇总遗传统计。我们从GTEx和STARNET的CAD相关组织转录组中提取了eQTL。基于PheWAS-eQTL共定位的概率（方法），我们确定了连接候选基因与CAD的表型特征。总计1173个候选基因，包括1010个蛋白质编码和163个非编码基因，在相关组织类型中与至少一个GWAS特征显示出显著共定位（PPH4≥0.80）（补充数据11、12）。
总体而言，CAD候选基因与炎症生物标志物（主要是免疫细胞计数）的相关性频率最高，其次是血脂水平（主要是胆固醇和甘油三酯水平），两者均涉及超过800个基因（图4a）。动脉和脂肪组织在血管和代谢功能中发挥着重要作用，具有显著共定位的基因数量最多，分别为811个和761个优先基因（图4a）。相比之下，胫神经、骨骼肌和血液显示出几乎相等的基因计数，分别为676、642和639个基因。有趣的是，35个基因在肾皮质组织中显示出显著的PheWAS-eQTL共定位信号，这与慢性肾脏疾病是CAD的风险因素这一事实相符。共定位在组织间的分布与一般基因表达模式不匹配，表明PheWAS分析发现了独立的调控效应（补充图5b）。对于新型CAD候选基因（图4b），我们观察到与所有优先CAD基因和已知基因相比相似的模式（图4a，补充图5c），再次暗示了新型基因的可靠性。
图4：优先基因的PheWAS（全表型组关联研究）-eQTL共定位分析。a, b 在所有优先(a)和新型冠状动脉疾病（CAD）基因(b)中，跨表型和组织类型具有显著共定位GWAS-eQTL信号的蛋白质编码和非编码基因数量。c, d 对CAD相关表型具有最强eQTL效应的前10个CAD新型蛋白质编码(c)和非编码(d)基因。显示共定位表型GWAS变体的每个基因最低p值。e CAD新型非编码基因的表型关联显示在小鼠中保守。f IQCH-AS1位点显示体重指数（BMI）GWAS与内脏腹部脂肪（VAF）eQTL信号的共定位，PPH4=0.89。源数据以源数据文件形式提供。
对于按其与PheWAS特征的关联强度排序的前沿新型候选基因，蛋白质编码和ncRNA基因均主要与炎症生物标志物和血脂水平相关（图4c, d）。我们的数据表明，ncRNA可能独立于蛋白质编码基因对CAD有贡献，尤其是对于基因间ncRNA，例如LINC01132。LINC01132与血脂水平独特相关。然而，前沿ncRNA基因均未在小鼠中显示保守性。有趣的是，在163个具有PheWAS-eQTL共定位信号的ncRNA基因中，有6个在小鼠中保守（图4e）。
IQCH-AS1通过肥胖相关表型对CAD有贡献
为了进一步验证我们的新发现，我们对一个新的CAD候选基因进行了生物学验证，该基因编码一个保守的lncRNA，即IQCH-AS1。PheWAS-eQTL共定位分析表明，IQCH-AS1与肥胖相关表型（包括体重指数（BMI）和腰臀比（WHR））最显著相关（图4e）。BMI和WHR的GWAS信号与来自脂肪组织的IQCH-AS1 eQTL共定位，表明IQCH-AS1在该组织中的作用可能促成肥胖，从而增加CAD风险（图4f，补充图5f）。因此，我们在人Simpson-Golabi-Behmel综合征（SGBS）前脂肪细胞和脂肪细胞中研究了IQCH-AS1的功能。我们首先通过双重CRISPR靶向策略生成了IQCH-AS1敲除（KO）的SGBS前脂肪细胞系，该策略使用两个基因特异性单导向（sg）RNA靶向主要IQCH-AS1异构体IQCH-AS1的共享外显子。双重CRISPR切除了外显子13的48 bp，与加扰对照系相比，显著降低了IQCH-AS1的RNA水平（图5a, b）。宿主基因IQCH的mRNA和蛋白质水平未受影响（补充图7a, b）。通过基于BrdU的增殖实验，我们观察到IQCH-AS1-KO前脂肪细胞的增殖减少，这在高脂血症条件下可能因新脂肪细胞来源减少而间接导致现有脂肪细胞肥大（图5c）。IQCH-AS1-KO前脂肪细胞的分化效率降低，表现为细胞核中PPARG表达减少（图5d，补充图6）。因此，相应的分化脂肪细胞显示出较少的甘油三酯积累（图5e），这可能因脂肪细胞脂质储存能力下降而导致循环中甘油三酯增加。此外，IQCH-AS1-KO脂肪细胞释放更多的促炎细胞因子，包括pentraxin 3和IL-18，但较少的抗炎细胞因子，包括IGFBP-3、Cripto-1、VEGF和IL-10（图5f）。我们来自IQCH-AS1-KO前脂肪细胞和脂肪细胞的数据表明该基因对CAD具有保护作用。确实，与对照组相比，STARNET队列中动脉粥样硬化患者的SAT和VAT中IQCH-AS1表达下调（图5g）。其宿主基因IQCH也显示出类似的下调（补充图7c, d）。此外，该位点增加BMI和WHR的等位基因与IQCH-AS1表达降低相关（图5h，补充图5g）。生物学实验证明了我们的新基因IQCH-AS1与CVD的相关性，这进一步支持了我们表观遗传学-GWAS分析的可靠性。
图5：基于CRISPR的IQCH-AS1敲除（KO）诱导的致动脉粥样硬化表型。a 双重CRISPR-KO SGBS前脂肪细胞中的IQCH-AS1扰乱了IQCH-AS1位点。实验独立重复n=5次生物学重复，结果相似。b 通过qRT-PCR测量，IQCH-AS1 RNA水平显著降低。数据以n=6个独立生物学重复的平均值±SEM表示；与对照比较的双尾非配对t检验（P<0.0001）。c IQCH-AS1的缺失降低了SGBS前脂肪细胞的增殖，表现为BrdU阳性细胞数量减少。通过前向散射（FSC-A）对比BrdU强度分析细胞以评估增殖。数据以n=4个独立生物学重复的平均值±SEM表示；与对照比较的双尾非配对t检验（P=0.0465）。d, e IQCH-AS1-KO脂肪细胞表现出PPARG表达减少(d)和甘油三酯（TG）积累减少(e)。使用蛋白特异性抗体（绿色）检测PPARG，用HCS LipidTOX™ Red中性脂质染色液（红色）染色脂滴，并用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染（补充图6）。(d)中的数据以n=8个独立生物学重复的平均值±SEM表示，与对照比较的双尾非配对t检验（P<0.0023）。(e)中的数据以n=3个独立生物学重复的平均值±SEM表示，与对照比较的双尾非配对t检验（P=0.0213）。f 条件培养基的蛋白质组学分析显示来自IQCH-AS1-KO脂肪细胞的细胞因子分泌改变。x轴代表log2倍变化（log2FC），右侧基因（log2FC>0）上调，左侧基因（log2FC<0）下调。y轴代表-log10(p值)。绝对log2FC>1且p<0.05的基因被认为显著差异表达。实验独立重复n=4次生物学重复。使用DESeq2计算差异表达。g 与对照组相比，动脉粥样硬化患者的皮下脂肪（SF）和内脏腹部脂肪（VAF）中IQCH-AS1表达显著降低。数据以n=568例患者和n=92例对照（SF）以及n=531例患者和n=103例对照（VAF）的平均值±SEM表示；与对照比较的双尾非配对t检验（SF和VAF均P<0.0001）。箱线图显示中位数（中心线）、第25-75百分位数（箱体）和最小值-最大值（须线）。h VAF中IQCH-AS1的BMI增加等位基因对IQCH-AS1表达的影响。来自图4F的主要BMI相关SNP（rs4261477）和10个高度连锁不平衡（R²>0.8）的SNP被纳入。, p≤0.05。***, p≤0.0001。源数据以源数据文件形式提供。
讨论
我们目前的工作利用45种疾病相关细胞类型的表观遗传学解释了CAD的群体遗传学。我们表明，细胞类型中平均1.04%的CRE含有CAD-SNV，约50%的CAD-SNV位于45种细胞类型的CRE或预测的TF结合位点内（图1）。通过GATES检验和SNEEP分析，我们鉴定了1580个疾病的候选因果基因，包括1208个蛋白质编码和372个ncRNA基因。CAD相关的ncRNA基因比蛋白质编码对应基因表现出更好的细胞类型特异性（图2e）。我们的792个候选基因也被已发表的研究或基于eQTL的方法发现，798个是新的（图2）。1580个基因中的542个受38个TF调控，这些TF的结合受CAD-SNV调控（图3）。81%的候选基因在患者队列的RNA数据中差异表达。基于PheWAS分析，可以在选定的细胞类型中探索与候选基因相关的疾病相关细胞表型。新型蛋白质编码和ncRNA候选基因在相关特征和eQTL组织类型方面均显示出与已知候选基因相似的PheWAS-eQTL共定位模式（图4），表明我们新型CAD候选基因的可靠性。我们对其中一个新型候选lncRNA基因IQCH-AS1的生物学验证表明，该lncRNA的缺失可能导致有害的脂肪功能，这与其与BMI和WHR的关联、在CAD患者脂肪组织中的下调以及同一组织中的eQTL相关性一致（图5）。IQCH-AS1的敲除影响了前脂肪细胞增殖和脂质积累，因此可能在肥胖和CAD中发挥作用。应进一步研究分子机制以探索该RNA的治疗潜力。
我们的工作为CAD鉴定了比已发表研究或基于eQTL方法更多的候选基因（N=1580）。数据集和统计方法的不同可能导致了发现能力的提高。首先，我们纳入了来自45种心血管细胞类型的表观遗传数据，代表了CAD遗传学研究中最多样化的细胞组。其次，我们的分析似乎比使用GTEx和STARNET数据集的GWAS-eQTL共定位更敏感，后者共识别出9种CAD相关组织的1095个基因。鉴于这些eQTL是使用组织水平数据绘制的，由于高细胞特异性而具有小效应的eQTL信号可能在批量转录组分析中被掩盖。虽然未来的系统性单细胞eQTL数据集可以弥补这一缺陷，但我们整合细胞类型表观遗传学已经揭示了具有高细胞特异性的CAD候选基因和CAD-TF，例如树突状细胞中的FLT1、脂肪细胞中的SLC22A3或AP-1家族TF。第三，我们使用了两种互补策略，GATES检验和SNEEP分析，来优先考虑CAD候选基因。GATES检验汇总了基因区域中所有SNV的显著性，因此考虑了编码和非编码基因区域中的SNV。SNEEP分析将TF-SNV的预测与细胞类型特异性调控元件中的出现相结合，因此聚焦于（表观）基因组的非编码部分。这些检验从不同的统计学原理中汲取力量，解释了它们的互补性。值得注意的是，使用SNEEP进行优先级排序的方式比之前的应用更为严格。一种受控的随机化方法建议，使用至少两个非LD的调控元件中出现TF-SNV作为更严格的阈值，以避免假阳性（补充图1e）。第四，系统性探索了遗传调控的非编码RNA基因，这增加了我们的发现。在我们的候选CAD基因中，23.5%是非编码RNA基因，与已报告的候选基因和通过GWAS-eQTL共定位分析发现的基因相比，代表了最高的比例。
在我们的研究中，通过遗传分析，microRNA被优先作为CAD的候选基因。使用基于群体转录组的方法不可能做到这一点，因为现有的基因型转录组数据集（如GTEx和STARNET数据集）在分析中排除了短RNA。有趣的是，microRNA132（MIR132），一个用于心力衰竭的2期临床试验（NCT05350969）的治疗靶点，也仅由我们的分析强调（补充图2b）。我们的分析表明MIR132也可能在CAD中发挥作用。确实，这个ncRNA基因含有TF-SNV的CRE不仅来自心脏细胞，也来自免疫细胞。此外，优先考虑了361个lncRNA基因，其中只有14个在人类和小鼠之间保守，这允许在体外和体内进行生物学研究和治疗探索。在我们的功能验证实验中，我们证明了新型ncRNA IQCH-AS1确实参与了CAD相关的细胞功能。
我们的研究存在局限性。我们的分析无法区分microRNA基因与宿主基因的作用。因此，我们从最终的候选基因列表中排除了基因间区域中的microRNA基因。此外，表观基因组数据的收集包括不同的分析方法（DNase-seq、ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq），它们可能揭示不同的调控区域，并进而决定哪些SNV可以通过表观基因组分析被发现。然而，对于如此大量的CAD相关细胞类型的收集，目前还没有统一分析的数据集。CRE-基因相互作用的预测允许一个CRE与多个基因连接。在这些情况下，我们假设所有靶基因都受到影响，尽管效应可能仅限于单个基因。我们分析了结合位点独立受影响的TF，尽管TF也以组合方式发挥作用。系统性整合TF协同作用需要所有可能TF相互作用的知识，目前尚不可用。TF-SNV的预测基于TF结合基序，这对于注释结合位点并不完美，但使我们能够分析如此大量的细胞类型和TF。另需考虑的一点是，GWAS和LD数据并非来自同一种群。虽然两者主要来自欧洲血统，但我们可能高估或低估了其他血统SNV的连锁。在来自其他人群（如非洲、西班牙裔和亚洲人群）的GWAS样本量大幅增长后，可以投入精力探索CAD位点的血统特异性表观遗传调控回路。
尽管如此，我们的研究创建了一个由遗传影响的表观遗传学以细胞类型特异性方式调控的CAD候选基因清单。我们超越了现有方法，优先考虑了新的候选基因，包括蛋白质编码、lncRNA和microRNA编码基因。我们证明了TF在遗传调控的CAD风险中的重要性。这些结果可为CAD候选基因的进一步生物学研究和治疗探索奠定基础。
【全文结束】