摘要
急性心肌梗死仍然是全球发病率和死亡率的主要原因。药物遗传学和时间治疗学方法正越来越多地应用于优化慢性心血管疾病的治疗。虽然基因变异已知会影响长期药物疗效，但它们在调节急性心肌梗死等急性条件下药物诱导的心肌保护方面的作用尚不清楚。同样，昼夜节律对心肌保护反应的影响也尚未得到充分界定。为了解决这些问题，我们以美托洛尔作为模型心肌保护剂进行了评估。在METOCARD-CNIC试验(NCT01311700)的非预先指定探索性分析中，我们研究了ADRB1 Arg389Gly多态性和急性心肌梗死发病时间对美托洛尔疗效的影响。我们发现，美托洛尔仅在ADRB1 Arg389等位基因纯合子患者中减少了梗死面积，这与该基因型依赖性的中性粒细胞迁移抑制一致。计算机对接和结合研究表明，美托洛尔与ADRB1的Gly389变异体之间的相互作用不稳定。此外，当急性心肌梗死在6:00至12:00之间发作时，美托洛尔与梗死面积减少相关。在雄性小鼠和中性粒细胞特异性Adrb1基因敲除模型中，仅在光照阶段的心肌保护作用得到了证实。这些发现共同强调了遗传背景和昼夜节律在塑造急性心肌保护治疗效果中的关键作用，支持了在急性心肌梗死中进行个体化干预的理论基础。
引言
精准医学涉及根据患者的特定因素（如环境、生活方式和基因型）调整疾病治疗和预防策略。精准医学的关键要素之一是药物基因组学检测，它已成为治疗受药物代谢酶基因变异影响的心血管疾病的宝贵指南。最突出的例子是CYP2C19基因分型，现已广泛用于预测氯吡格雷的疗效。药物基因组学指导在心血管医学中的其他有前景的应用包括华法林剂量和他汀类药物治疗。
几种心血管表型与β-1肾上腺素受体(ADRB1)中的单核苷酸多态性相关。研究最多的ADRB1变异是Arg389Gly (rs1801253)和Ser49Gly (rs1801252)多态性，在每种情况下，Gly变异均与较低的受体活性相关，分别通过降低信号转导和受体下调实现。这些单核苷酸多态性已被证明影响心血管疾病进展和对β受体阻滞剂的反应。特别是Arg389变异与β受体阻滞剂在慢性疾病（包括心力衰竭、心房颤动和高血压）中更强的效果密切相关。
心血管病理生理学，包括药物动力学和药效学，也受到昼夜节律的影响，导致给药时间对疗效和安全性产生差异。根据人体昼夜节律安排用药，即所谓的时间治疗学，已被证明可以改善治疗效果。例如，他汀类药物在晚餐前服用可以更有效地控制高胆固醇血症，而乙酰水杨酸如果在睡前服用，可以更有效地减少觉醒后血小板聚集的峰值。
药物基因组学和时间治疗学策略越来越多地用于慢性心血管疾病的管理；然而，人们对它们在急性疾病环境（如心肌梗死）中的潜在应用关注较少，而心肌梗死是全球发病率和死亡率的主要原因。心肌梗死在发病时间和不可逆损伤程度上均显示出时间差异，光照阶段的开始与事件发生频率更高和梗死面积更大相关。也有证据表明，白细胞（尤其是中性粒细胞）浸润梗死心肌的速率存在时间差异。
心肌梗死后心肌功能的保存取决于快速恢复心肌血流以最小化梗死面积。然而，再灌注会触发中性粒细胞驱动的无菌性炎症过程，导致缺血-再灌注损伤和最终的梗死面积扩大。微血管阻塞是缺血-再灌注损伤的另一个重要贡献因素，即使大表层冠状动脉血流恢复，它也可能阻止有效的组织灌注。及时给予选择性ADRB1阻滞剂美托洛尔可以限制梗死面积。基于患者和动物模型的证据，当前临床实践指南建议在心肌梗死发作期间早期静脉注射美托洛尔。
在本研究中，我们探索了根据心肌梗死发作时间及患者基因型，静脉注射美托洛尔对心肌缺血-再灌注损伤的保护效果。我们的结果显示，美托洛尔心肌保护仅限于具有Arg/Arg389 ADRB1基因型的患者，并且仅在心肌梗死上午发作时有效。这些结果强调了在评估急性临床环境中药物疗效时考虑基因型和时间因素的重要性，并支持开发针对急性心血管疾病的个体化治疗方案。
结果
美托洛尔在急性心肌梗死患者中的心肌保护效果取决于ADRB1基因型
从马德里METOCARD-CNIC试验中最后102名连续入组的患者采集的血液样本用于对ADRB1中的Arg389Gly SNP (rs1801253)进行基因分型。根据试验方案，患者在心肌梗死期间医院转运过程中被随机分配接受静脉注射美托洛尔(n=51)或对照(无美托洛尔,n=51)。与先前研究一致，Arg389Gly基因型分布为56% Arg/Arg389、37% Arg/Gly389和8% Gly/Gly389。分析假设为显性模型，并比较Arg/Arg与Gly携带者。
通过心脏磁共振(CMR)在梗死后第7天测量的梗死面积在Arg/Arg389基因型患者中，静脉注射美托洛尔显著限制了梗死面积(中位数[Q1,Q3]：16.94克[6.080,36.30克] vs. Arg/Arg389对照组29.16克[13.38,45.04克]；P<0.05)。对于Arg/Gly389和Gly/Gly389基因型，美托洛尔组与对照组之间的梗死面积无差异。当分析仅限于血管造影显示完全闭塞动脉的患者(PCI前TIMI 0-1)时，也获得了类似结果。通过CMR测量的微血管阻塞(MVO)——另一个独立的长期死亡率预测因子——也仅在Arg/Arg389患者中被再灌注前静脉注射美托洛尔显著减少。左心室射血分数(LVEF)也是如此，仅在纯合子Arg389携带者中，美托洛尔治疗后LVEF显著更高。梗死后6个月的第二次CMR评估也显示梗死面积减小和LVEF改善。
美托洛尔对中性粒细胞迁移的抑制取决于ADRB1基因型
美托洛尔不仅通过减少心脏收缩和氧气需求发挥心肌保护作用，还通过阻断中性粒细胞迁移从而在再灌注期间减少微血管阻塞。因此，我们接下来评估了ADRB1 Arg389Gly多态性如何影响化学诱导迁移Transwell实验中的这种中性粒细胞抑制效应。该分析所用的中性粒细胞来自健康志愿者捐献的血液。该组中Arg389Gly (rs1801253)变异的频率为46% Arg/Arg389、49% Arg/Gly389和5% Gly/Gly 389。
人类中性粒细胞通过Transwell滤器暴露于趋化因子CXCL1，在有或无美托洛尔(10 µM)的情况下，90分钟后通过流式细胞术量化穿过膜的细胞数量。鉴于只有一名志愿者是Gly389等位基因的纯合子，该志愿者在与Arg/Arg389组比较时被归入Arg/Gly389基因型。在Arg/Arg389携带者中，美托洛尔抑制了约20%的基础中性粒细胞向CXCL1的迁移(P<0.05)，而在Arg/Gly389携带者的中性粒细胞中未观察到这种效果。此外，在无美托洛尔的情况下，基因型对沿CXCL1梯度的中性粒细胞迁移没有影响。
ADRB1 Gly389变异体与美托洛尔形成不稳定的复合物
使用PPM服务器进行的计算机对接研究（该服务器提供膜中蛋白质位置和方向的准确建模）揭示了Arg389和Gly389人类ADRB1变异体之间美托洛尔结合稳定性的显著差异（复合物能量：-1263.53 vs. -482.89；界面能量：-19.57 vs. -16.21，以Rosetta能量内部单位计）。此外，模型显示Gly389 ADRB1变异体具有更小的药物结合口袋和更小的内部腔室，而这些参数受美托洛尔存在的影响不显著。这些计算数据表明美托洛尔与Gly389 ADRB1形成不稳定的复合物，因此可能迅速被置换。
为深入探索这些结果，我们对Gly389和Arg389人类ADRB1的计算机模型进行了分子动力学(MD)模拟。比较分析显示均方根偏差(RMSD)谱存在显著差异。在Arg389 ADRB1的情况下，腔室表现出与美托洛尔的强烈稳定化，美托洛尔在整个轨迹中与蛋白质紧密结合。对于Gly389 ADRB1，核心和腔室表现出与Arg389形式相似的行为。然而，在这种情况下，美托洛尔初始结合较低，随着轨迹增加，并在约60%时显示出强烈的稳定化。
均方根波动(RMSF)谱表示蛋白质残基在MD模拟过程中从原始平均位置波动的程度。与Arg389变异体相比，与美托洛尔结合的Gly389 ADRB1表现出更高的波动，这表明分子运动更大，与药物的结合更不稳定。
为验证我们的计算机结果，使用HEK293细胞进行重组蛋白表达，生产并纯化了人类ADRB1的两种变异体(Arg389和Gly389)。然后，使用亲和纯化的TwinStrep-His10标记的Arg389或Gly389人类ADRB1进行表面等离子共振(SPR)结合研究。美托洛尔对两种形式均表现出强亲和力(KD nM)，但对Arg389变异体的亲和力约为Gly389的15倍。这主要是由于美托洛尔与Arg389结合的关联速率常数(ka)增加(1.10×10⁶ M⁻¹ s⁻¹ vs. Gly389的1062 M⁻¹ s⁻¹)，这可能加速Arg389的阻断效果。这些结果强化了我们的计算机结果，并有力支持我们的疗效结果，显示美托洛尔对Arg/Arg 389患者具有心肌保护作用。
美托洛尔诱导的心肌保护显示出时间OfDay变化
鉴于中性粒细胞生物学存在显著的昼夜节律变化，我们接下来检查了完整的METOCARD-CNIC试验队列数据(220名患者：美托洛尔组n=108；对照组n=112)，以确定美托洛尔的心肌保护效果是否具有时间OfDay依赖性。心肌梗死发作时间OfDay被分为基于先前研究的4个时段。
与先前研究一致，心肌梗死发作在早晨时段更为频繁，跨越暗-光转换期(P2,6 am-noon)。在P2时段(6 am-noon)发作心肌梗死的患者中，美托洛尔显著发挥了心肌保护作用(CMR中位数梗死面积：美托洛尔组22.00克[Q1,Q3:10.20-30.00克] vs. 对照组29.55克[Q1,Q3:17.28-42.93克]；P<0.05)。当分析仅限于呈现完全闭塞动脉的患者时，也获得了类似结果。通过CMR在第7天评估的微血管阻塞也显示相同模式，仅在心肌梗死发作发生在P2时，美托洛尔治疗患者中微血管阻塞显著减少。LVEF分析也显示相同模式，仅在P2时段发作心肌梗死的患者中，美托洛尔治疗患者的LVEF显著更高。
ADRB1通过美托洛尔的调节因而心肌保护仅限于光照阶段的开始
美托洛尔通过抑制中性粒细胞的结构重组来预防它们与其他细胞的相互作用及其对靶组织的浸润，从而保护免受心肌缺血-再灌注损伤，以及急性肺损伤和腹膜炎等以炎症加剧为特征的其他疾病。因此，我们接下来研究了美托洛尔对中性粒细胞生物学影响的时间OfDay限制是否是其心肌保护效果时间限制的次要因素。
我们在不同时间OfDay通过阻塞左前降(LAD)冠状动脉45分钟，随后释放结扎以产生再灌注，诱导小鼠心肌缺血-再灌注损伤。在光照周期开始时(ZT 1-5)给予静脉注射美托洛尔(12.5 mg/kg)10分钟前再灌注，显著限制了梗死面积(表示为风险区域百分比)。当缺血-再灌注损伤在光照周期后期(ZT 9-13)诱导时，美托洛尔对梗死面积表现出较温和的保护作用，但在暗期(ZT 18-22)诱导的缺血-再灌注损伤中则无效。
通过在LysM-GFP小鼠(携带髓系细胞中的GFP报告基因)中诱导心肌缺血-再灌注损伤，我们发现ZT 1-5期间美托洛尔的心肌保护作用与左心室中性粒细胞浸润减少相关，并减少了24小时后血液中中性粒细胞和血小板的共聚集体形成。同样，当心肌梗死在暗期诱导时，未观察到这种效果。
讨论
本研究结果提供了有力证据，表明光-暗周期和个体遗传学在急性心肌梗死期间选择性ADRB1阻滞剂美托洛尔的心肌保护反应中发挥重要作用。在METOCARD-CNIC试验的ADRB1基因分型患者中，再灌注前静脉注射美托洛尔仅在携带2个Arg389 ADRB1等位基因的患者中具有心肌保护作用，证明Arg389Gly (rs1801253)多态性是美托洛尔反应的良好预测因子。此外，美托洛尔注射的有益效果仅在光照周期开始时心肌梗死发作时明显，这表明美托洛尔诱导中性粒细胞抑制的能力与中性粒细胞活性增强期 coincide。
我们先前的报告表明，美托洛尔通过中性粒细胞中ADRB1的选择性阻断，对中性粒细胞活性产生独特影响，从而改善以炎症加剧为特征的急性疾病，如心肌缺血-再灌注损伤、中风和急性呼吸窘迫综合征。ADRB1多态性变异和心肌梗死及中性粒细胞活性的光-暗模式的存在促使我们调查静脉注射美托洛尔对急性中性粒细胞驱动疾病的保护效果是否可能仅限于具有特定ADRB1基因型的患者和一天中的特定时间。与将药物遗传学和时间治疗学广泛应用于改善慢性心血管疾病管理相比，人们对这些方法在急性心血管疾病管理中潜在应用的关注较少。
药物治疗的临床反应是一个复杂的现象，源于所用药物、患者合并症和环境因素的相互作用。这种复杂性导致对处方用于心血管疾病的药物的反应和疗效存在显著的个体间异质性。与基因型相关的药物反应个体差异可能源于编码药物代谢酶(如CYP2C19用于氯吡格雷)、药物转运蛋白(如SLCO1B1用于他汀类药物)或药物靶点(如VKORC1用于华法林)的基因中的序列变异。
基于美托洛尔通过中性粒细胞抑制实现的独特心肌保护效果，当前ST段抬高型心肌梗死管理的临床实践指南推荐早期静脉注射美托洛尔，优先于其他β受体阻滞剂。然而，仍缺乏在终点减少方面显示出坚实临床益处的减少梗死面积的干预措施。从动物模型到人类试验的转化复杂性突显了在实验环境中考虑动物遗传背景与患者遗传学相关性的必要性。
ADRB1是心血管药理治疗的主要靶点，目前正在大力努力将ADRB1多态性变异纳入个体化治疗方案的开发中。ADRB1中的单核苷酸多态性已被证明调节对β受体阻滞剂治疗的反应，临床上最重要的ADRB1多态性是Arg389Gly (rs1801253)。Arg/Arg389基因型与β受体阻滞剂在慢性适应症中更强的临床效果密切相关。我们研究的结果强化了Arg389Gly ADRB1多态性对预测ST段抬高型心肌梗死患者对美托洛尔急性反应的相关性。只有Arg/Arg389纯合子是良好应答者并从美托洛尔诱导的心肌保护中获益。
在急性心肌梗死等急性条件下的基因型依赖性对美托洛尔的反应，与美托洛尔抑制中性粒细胞迁移仅限于Arg/Arg389健康个体一致。计算机对接分析和分子动力学模拟显示，与Gly389变异体相比，美托洛尔与Arg389 ADRB1的结合和稳定化更快更强，这可以解释在后者中观察到的药物反应较弱。表面等离子共振研究也支持这些结论。
心血管生理学和病理生理学的多种特征表现出昼夜节律，主要归因于时间OfDay对神经体液轴的控制(包括皮质醇、褪黑激素、儿茶酚胺和肾素-血管紧张素-醛固酮系统)，因为光是使时钟与环境同步的最重要线索。因此，动脉血压、心率、内皮功能、血小板聚集和血液粘度在清晨均增加，不良心脏事件的发生也是如此。这些节律还在调节男性和女性大多数生殖激素方面发挥重要作用。此外，昼夜节律钟基因(如BMAL1和CLOCK)的改变导致血压失调并促发高血压。
光-暗周期还影响髓系细胞(粒细胞和单核细胞)的产生和活性。外周血中的中性粒细胞数量遵循昼夜节律，这也影响循环中性粒细胞表型及其被招募到组织中的方式。中性粒细胞表型由表面分子(CD62L、CXCR4和CXCR2)的表达定义，其表达遵循昼夜模式。
人类和小鼠研究表明，当心肌梗死发生在光周期时，梗死往往更大。与这些先前结果一致，我们也在P2时段发现了心肌梗死发病率的显著增加；然而，时间OfDay差异在梗死面积方面并未显现。我们当前的发现表明，美托洛尔注射提供的临床心肌保护仅限于P2时间窗口(6 am-noon)中心肌梗死发作的患者。
美托洛尔心肌保护效果的时间OfDay变化在小鼠缺血-再灌注损伤模型中得到了证实，在该模型中，心肌保护在整个白天逐渐下降，在光照周期最初几小时(ZT 1-5，相当于人类研究中的P2)达到峰值。美托洛尔对左心室中性粒细胞浸润的阻断仅限于ZT 1-5诱导的心肌梗死，可能表明这种效果依赖于暗周期期间中性粒细胞的重编程。单细胞体内2D体内显微镜分析证实，中性粒细胞在暗周期开始时对美托洛尔变得本质上无反应。美托洛尔对中性粒细胞募集的光依赖性效应也在急性腹膜炎诱导后观察到。
此外，在中性粒细胞中组成型缺乏Adrb1的Mrp8-Cre-/+ Adrb1FLOX/FLOX小鼠在光照周期最初几小时内被诱导缺血-再灌注损伤时受到心肌保护，美托洛尔在这些动物中没有额外的保护作用。这一结果证实美托洛尔通过关闭Adrb1信号传导实现的中性粒细胞抑制来保护免受缺血-再灌注损伤。当中性粒细胞无反应性再次显现时，因为在暗期诱导缺血-再灌注损伤时，Adrb1的缺失对梗死面积没有影响。
本研究的关键发现是美托洛尔的心肌保护作用既受ADRB1基因型限制，也受心肌梗死发作时间OfDay限制。只有具有Arg/Arg389基因型且在上午(6:00-12:00)发作心肌梗死的患者才从美托洛尔治疗中获益。这些发现共同强调了在急性心血管疾病治疗中考虑患者遗传背景和生物钟的重要性，为急性心肌梗死的个体化精准医疗提供了科学依据，有望显著改善急性心血管事件的治疗效果和患者预后。
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