外泌体是指直径40-100纳米的盘状囊泡。1983年，Harding等人和Pan等人分别在鼠和羊的网织红细胞中首次发现，1987年由Johnstone正式命名为"Exosome"。外泌体含有蛋白质、mRNA和microRNA等多种物质。它们不仅可用于疾病诊断和病情监测，还在细胞治疗、药物递送、医疗美容等领域发挥作用。因此，外泌体研究一直是热点话题，相关论文经常发表在《科学》和《自然》等顶级期刊上。
外泌体的形成过程
研究表明，所有类型的细胞都能分泌外泌体，包括免疫细胞、上皮细胞、胚胎干细胞、间充质细胞和癌细胞。外泌体的形成过程如下：
- 首先，细胞膜内陷形成杯状的早期分选内涵体（ESE），其中主要含有外泌体蛋白、膜蛋白和循环外泌体。
- 然后，ESE的膜向内内陷，将细胞质蛋白、核酸、代谢物等物质包裹在ESE内部，形成含有腔内囊泡的晚期分选内涵体（LSE）。
- 最后，LSE成熟为多泡体（MVB）。部分MVB与自噬体或溶酶体融合并被降解，而其他MVB与质膜融合，将腔内囊泡释放到细胞外。这些释放到细胞外的腔内囊泡就是最终的外泌体。
外泌体的蛋白质类型
尽管不同类型细胞或相同细胞在不同条件下分泌的外泌体成分各不相同，但外泌体在蛋白质类型上具有一些共同特征，主要分为以下几类：
- 整合的外泌体膜蛋白：主要包括四跨膜蛋白（CD81、CD82、CD37、CD63）及其伴侣蛋白（MHC II、IGSF8、ICAM-1、SDC1-4、整合素等），以及膜信号蛋白（EGFR、c-Kit、GPCRs、Notch受体、T细胞受体、细胞因子受体等）。
- 脂锚定的外膜蛋白：包括C端糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白（CD39、CD73、Juno、CD55、CD59、glypican-1、PrP SC）和Hedgehog形态发生素等。
- 脂锚定的内膜蛋白：包括酰化的小GTP酶（Rabs、Ras、Rho等）、豆蔻酰化的信号激酶（Src）和棕榈酰化的膜蛋白等。
- 外周表面蛋白：包括Wnt蛋白及其受体/伴侣蛋白、GPR177、BMPs、TGF β、TNF、TNF相关凋亡诱导配体、FAS配体、细胞因子和细胞外基质蛋白（纤连蛋白、腱生蛋白C、ECM1等）。
- 内部和外周膜蛋白：包括细胞骨架连接蛋白（ERMs）及其配体（EBP50、CD44、CD43、IGSF8、PTGFRN等）、Alix及其配体（TGS101、ESCRTs 0-4）以及分子伴侣HSPs（HSP70、Hsp40/DnaJ、Hsp90、Hsp20、Hsp27、α/β-晶状体蛋白）。
- 外泌体酶：包括CD39、CD73、磷酸酶、焦磷酸酶、钙结合衔接蛋白、磷酸转运蛋白、RNA编辑酶、脂肪酶、蛋白酶、糖基转移酶、糖苷酶和代谢酶等。
- 可溶性蛋白和内含物：CD81、CD9、CD63等异质蛋白。
外泌体的提取方法
目前有多种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心、试剂盒提取、尺寸排阻色谱、超滤、聚合物沉淀、免疫亲和分离和压力筛分。其中，差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
不同提取方法的原理、优缺点如下表所示：
| 方法 | 原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 差速离心/密度梯度离心 | 利用不同离心力的作用逐步纯化获得外泌体 | 适用于大体积样品，成本低 | 耗时长，产量低 |
| 聚合物沉淀 | 用疏水聚合物沉淀外泌体 | 无需特殊设备，操作简单 | 产物中混有聚合物颗粒，引入杂质蛋白，产量与聚合物有关 |
| 超滤 | 用孔径小于150 nm的超滤膜进行离心过滤 | 耗时短，无体积限制，杂质蛋白少 | 易造成外泌体丢失和损伤，产量受温度、粘度和浓度影响大 |
| 免疫亲和分离 | 通过磁珠特异性吸附外泌体表面抗原沉淀外泌体 | 选择性高，能筛选特定类型外泌体 | 含有抗体杂质，存在体积限制，无法筛选所有外泌体亚群 |
| 尺寸排阻色谱 | 根据不同粒径颗粒通过凝胶柱的洗脱时间不同进行分离 | 纯度高，杂质少，耗时短，成本低 | 样品需稀释，分离体积和通量低 |
| 压力筛分 | 通过压力或电场使外泌体穿过膜 | 外泌体纯度高 | - |
外泌体的鉴定方法
形态学表征
使用透射电子显微镜（TEM，常用方法）、扫描电子显微镜（SEM）、冷冻电子显微镜（Cryo EM）或原子力显微镜（AFM）等观察外泌体的形态。
注意：（1）至少应使用两种方法进行形态鉴定；（2）外泌体呈圆形，直径为40-150 nm。
粒径分布表征
使用动态光散射（DLS）、纳米颗粒追踪分析（NTA，常用方法）和可调电阻脉冲感应（TRPS）等分析外泌体的直径。
蛋白标志物分析
根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的建议，外泌体分析应至少检测三种蛋白（两种阳性、一种阴性），包括：
- 跨膜或GPI锚定蛋白（阳性）：CD63、CD9、CD81等；
- 外泌体内部蛋白（阳性）：TSG101、HSP70和Alix等；
- 其他细胞器或细胞结构蛋白（阴性）：组蛋白、LaminA和钙联蛋白等。
注意：CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70和Alix是最常用的外泌体标志物。
外泌体的保存方法
根据Cheng等人的研究，将外泌体保存在pH 7.0的保存液中，置于-80℃，可最大程度地维持外泌体的活性和完整性。此外，尽可能避免反复冻融也能保持外泌体的活性和完整性。
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