摘要
循环代谢物可以识别与阿尔茨海默病(AD)相关的生化风险因素。我们在两个队列中测量了1,068名加勒比海西班牙裔参与者（250名AD患者和818名健康对照）的血浆代谢物，并分析了它们与临床AD、生物标志物支持的AD以及血浆生物标志物（P-tau181、P-tau217、P-tau231和Aβ42:Aβ40）的关系。与P-tau生物标志物相关的代谢物在氨基酸代谢途径中富集，而唾液酸和N-聚糖途径则与Aβ42:Aβ40相关。通过几种降维方法，我们确定了携带多不饱和脂肪酸的溶血磷脂酰胆碱（lysoPCs）与生物标志物支持的AD和P-tau生物标志物之间存在APOE-ε4依赖性关系。在110个非西班牙裔白人参与者的死后脑组织的独立数据集中，脑中的lysoPCs也与AD神经病理特征相关。我们的结果显示，基于生物标志物的诊断标准确定了与lysoPCs的APOE-ε4依赖性关联，lysoPCs在将神经保护性多不饱和脂肪酸运输到大脑中起着关键作用，与AD相关。
主要内容
AD是一种进行性神经退行性疾病，其特征是认知和记忆能力下降，影响全球数百万人。尽管进行了广泛研究，但关于AD潜在致病机制的许多问题仍未解答，阻碍了有效治疗策略的开发；然而，高通量组学技术的最新进展为探索AD的复杂分子景观提供了强大平台。
使用高分辨率质谱分析代谢组可以全面分析参与细胞代谢的小分子。它为研究与疾病发病机制相关的代谢改变提供了独特机会，从而有助于更好地理解AD的分子水平。AD的代谢组学研究揭示了一系列改变的代谢信号。多项研究表明AD中能量代谢途径失调，包括葡萄糖代谢异常、糖酵解减少、线粒体功能受损以及葡萄糖、乳酸和丙酮酸等代谢物水平降低。三羧酸(TCA)循环中间产物的改变也已被观察到。研究表明AD中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂水平降低，表明膜完整性和信号通路以及胆固醇代谢的紊乱。其他研究还发现AD中氨基酸代谢发生改变。某些氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和支链氨基酸）水平降低可能反映了神经递质合成、神经炎症和蛋白质稳态的紊乱。研究还显示AD患者中神经递质如乙酰胆碱、谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的水平发生改变。这些变化可能导致疾病中的认知功能障碍和突触改变。几组研究报道了AD患者全血和大脑中活性氧和氧化损伤标志物水平升高，以及抗氧化代谢物和酶的改变。这些发现表明氧化还原状态改变在AD发病机制中的作用。
鉴于代谢组学是最接近表型的组学层，它有潜力揭示有关疾病风险和进展的关键见解，并可能发现治疗靶点；然而，先前的研究并未解决代谢物和代谢途径在疾病不同阶段的作用。通过将代谢组学数据与AD的临床诊断和血浆生物标志物水平整合，我们旨在识别疾病各阶段的潜在代谢网络。
在本研究中，我们调查了代谢物与AD的临床和生物标志物支持的诊断之间的关联，使用已发表的血浆P-tau181和P-tau217诊断临界值。我们还调查了代谢物与P-tau181、P-tau217、P-tau231和Aβ42:Aβ40比值的关联。先前研究表明，脑脊液(CSF)和血浆P-tau181在临床症状出现前15-18年升高。我们对代谢组学与AD的临床和血浆生物标志物诊断相关性的分析可能有助于阐明疾病早期和中期的代谢变化。
研究结果
研究参与者
本研究共纳入717名参与者，其中150名(20.9%)被诊断为临床AD，567名为认知未受损的对照组。研究人群平均年龄为69.6±7.6岁，临床AD患者的平均年龄(73.2±8.3岁)略高于对照组(68.6±7.2岁)。三分之二为女性(65%)，这一比例在AD患者(67%)和对照组(65%)中相似。研究组中有三分之一至少有一个APOE ε4等位基因(38%)，AD患者中的比例(43%)略高于对照组(36%)。在AD患者中，58%的生物标志物呈阳性，而对照组中只有29%呈阳性。
代谢组关联研究
我们在HILIC+和C18−柱中分别检测到6,445个和5,827个代谢特征。限制在至少70%的参与者中检测到的代谢特征，分别保留3,253个和3,628个特征用于进一步分析。总体而言，442个特征与至少一种表型相关。其中，93个特征根据Schymanski量表以1级至3级置信度进行了注释。
我们确定了77个代谢特征与临床AD和生物标志物支持的AD相关（错误发现率(FDR) q值<0.05）。与生物标志物支持的AD相关的代谢物在氨基酸代谢和尿素循环途径中富集。色氨酸代谢和药物代谢（其他酶）途径由与临床AD相关的代谢物富集。与临床AD相关的顶级代谢物包括苯乙酰谷氨酰胺(q值=0.04，注释置信度1级)、十二烷酰肉碱(q值=0.01，3级)和色氨酸(q值=0.04，3级)。
与P-tau181水平相关的24个具有1级置信度注释的代谢特征中，缬氨酰-丝氨酸、肌酐和瓜氨酸位列其中。几种lysoPCs，包括lysoPC (22:6)、lysoPC (18:0)和lysoPC (20:4)在多重检验校正后与血浆P-tau181水平呈负相关。与P-tau181水平相关的代谢特征在几种必需氨基酸代谢途径中富集，包括酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和赖氨酸代谢。其他途径包括尿素循环/氨基基团代谢、硒氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢。
比较与AD及其生物标志物相关的代谢物
代谢物仅与Aβ42:Aβ40比值相关，与AD或P-tau生物标志物相关的代谢物无重叠。色氨酸与临床AD、P-tau181和P-tau217相关，而苯乙酰谷氨酰胺与临床AD和P-tau181均相关。几种源自肠道色氨酸微生物代谢的代谢物与P-tau181和P-tau217相关，包括1H-吲哚-3-甲醛(3级)、吲哚乙醛(5级)和吲哚丙烯酸(5级)。硫酸吲哚酚(1级)是一种已知的尿毒毒素，与P-tau181、P-tau217和P-tau231相关。其他与所有三种P-tau生物标志物相关的代谢物包括肌酐(1级)、亮氨酰-脯氨酸(1级)和2-氨基己二酸(1级)。携带花生四烯酸侧链的lysoPC (20:4)(3级)和携带棕榈油酸和二十二碳六烯酸侧链的磷脂酰胆碱(16:1, 22:6)(3级)与P-tau181和P-tau217均相关。
代谢物的共丰度分析
我们分别对HILIC和C18柱中检测到的代谢特征使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)对共丰度代谢特征进行聚类。WGCNA在HILIC和C18柱中分别确定了18个和15个共丰度代谢模块。然后，我们测试了每个模块与临床和生物标志物支持的AD以及血浆生物标志物水平的关联。
紫色模块与生物标志物支持的AD和P-tau181呈负相关。黄绿色模块与P-tau181、P-tau217和P-tau231水平呈负相关，黑色模块与P-tau181和P-tau217呈负相关。鲑鱼色模块与生物标志物支持的AD、P-tau181、P-tau217和P-tau231水平呈正相关。
值得注意的是，三个lysoPCs是紫色模块中的中心代谢物，它们在生物标志物阴性参与者中的丰度高于被定义为具有生物标志物支持的AD的个体。磷脂酰胆碱和lysoPCs也是黄绿色模块中的中心代谢物，并且在生物标志物阴性参与者中的丰度也高于具有生物标志物支持的AD的参与者。
溶血磷脂酰胆碱与AD生物标志物相关
代谢组关联研究(MWAS)和WGCNA均检测到lysoPCs与生物标志物支持的AD、P-tau181、P-tau217和P-tau231水平显著相关。因此，我们通过构建lysoPC主成分(PCs)来测试所有lysoPCs与临床和生物标志物支持的AD的联合关联。
分层分析显示，PC1对生物标志物支持的AD具有保护作用，而PC5对临床AD具有风险诱导作用，仅在APOE ε4非携带者中；而PC2和PC4带来的风险仅限于APOE ε4携带者。当我们使用P-tau217定义生物标志物支持的AD时，也观察到类似结果。
PC1对所有lysoPCs都有正载荷，这表明所有lysoPCs都与生物标志物支持的AD呈负相关，特别是在APOE ε4非携带者中。PC4对携带二十二碳六烯酸(DHA；lysoPC (22:6))和花生四烯酸(AHA；lysoPC (20:4))的lysoPCs有负载荷。
溶血磷脂酰胆碱和多不饱和脂肪酸在血浆和脑脊液中的相关性
我们测试了lysoPC PCs 1、2、4和5与循环多不饱和脂肪酸(PUFAs)在脑脊液和血浆中的相关性，按APOE ε4等位基因状态分层。PC1与二十碳五烯酸(EPA)和AHA的循环水平呈正相关，在APOE ε4携带者和非携带者中均如此。PC2与EPA的循环水平呈负相关，在携带者和非携带者中均如此，且仅在至少携带一个APOE ε4等位基因的携带者中与AHA呈负相关。
PC4在携带者和非携带者中与大多数测量的血浆PUFAs呈负相关，并与脑脊液中DHA的水平呈负相关。PC5在携带者和非携带者中与血浆EPA呈负相关，与血浆AHA呈正相关，并且仅在没有APOE-ε4等位基因的个体中与亚麻酸(前体)呈负相关，在该组中PC5与AD风险增加相关。
我们还发现，携带EPA和DHA的lysoPCs与它们各自在脑脊液中的PUFAs水平呈正相关，而AHA的相关性可忽略不计。这表明已知将长链PUFAs运输到中枢神经系统的lysoPCs可能以APOE ε4依赖的方式在AD生物学中发挥作用。
在WHICAP队列中溶血磷脂酰胆碱与AD生物标志物关联的复现
为验证和推广我们的发现，我们在WHICAP队列中检查了lysoPCs与临床和生物标志物支持的AD的关联。我们使用与EFIGA队列相同的方法和参数，确定了45个注释为lysoPCs的代谢特征(25个唯一特征)，用于生成PCs。我们发现PC1（所有研究的lysoPCs都有正载荷）与生物标志物支持的AD呈负相关，这种效应仅在没有APOE-ε4等位基因的个体中可见，与我们在EFIGA队列中的发现相似。
在ROSMAP队列中溶血磷脂酰胆碱的复现
为进一歩验证我们的结果并确定lysoPCs对疾病阶段的影响，我们检查了ROSMAP队列中lysoPCs与AD病理的关联。我们使用从110个脑样本中获得的代谢组学数据，测试了lysoPCs和磷脂酰胆碱与AD的病理定义、淀粉样蛋白负担、缠结密度和全局病理的关联。我们发现PC3与缠结密度增加、全局病理和AD的病理诊断呈负相关。携带PUFAs的lysoPCs中，我们仅在ROSMAP队列中检测到AHA。PC3对AHA有正载荷，尽管对PC3的贡献不大。三个PCs与淀粉样蛋白负担和tau缠结呈负相关，意味着lysoPCs和PCs在死后AD大脑中减少。这些发现与EFIGA队列中的血浆lysoPCs观察结果一致。
讨论
我们调查了代谢物与血浆生物标志物和临床诊断在加勒比海西班牙裔个体队列中的关联，以识别与AD病理特征相关的代谢途径。具体而言，我们比较了临床AD诊断和基于生物标志物的AD诊断中富集的代谢途径。由于血浆生物标志物在临床症状出现前几年就会发生变化，比较临床和基于生物标志物的诊断可以阐明先于疾病临床表现的途径，可能识别早期干预措施。
我们研究中最显著的两个发现是：当使用临床诊断与基于验证的血浆生物标志物诊断时，代谢物谱不同；溶血磷脂酰胆碱(lysoPCs)与AD相关，但在西班牙裔人群的无偏方法中，它们对AD的风险是APOE ε4依赖性的。这一发现在另一个加勒比海西班牙裔和非西班牙裔白人个体队列以及血浆和死后脑组织中得到复现。
lysoPCs与血浆P-tau181、P-tau217的定量水平以及生物标志物支持的AD（由P-tau181定义）相关。共丰度分析揭示了P-tau181和P-tau217与包含几种lysoPCs作为中心代谢物的代谢模块之间的关联，可能表明它们在疾病发病机制中的重要作用。几项研究报道AD患者大脑、脑脊液和血浆中lysoPCs水平降低。这些变化通常涉及lysoPC物种水平的降低，特别是在AD患者中结合抗炎PUFAs的lysoPCs。一些lysoPC物种已被认为促进神经毒性和炎症。它们可以诱导氧化应激，损害线粒体功能，并激活免疫细胞，导致神经元损伤和死亡。lysoPCs还参与脂质代谢失调。磷脂酰胆碱（细胞膜的主要脂质成分）的分解可以产生lysoPCs。参与此过程的酶（如磷脂酶A2(PLA2)）的紊乱已在AD中观察到，可能导致lysoPC水平改变。在ROSMAP中来自死后脑组织的额叶皮层中的进一步验证加强了lysoPCs在AD病因学中的生物学相关性。
我们在APOE ε4携带者和非携带者中观察到lysoPCs的差异效应。lysoPCs带来的风险仅限于APOE ε4携带者，而保护作用在APOE ε4非携带者中显著。先前研究表明APOE ε4携带者往往比非携带者在脑脊液、血浆和脑组织中表现出特定lysoPC物种（包括DHA和AHA）的较高水平。APOE ε4携带者中某些lysoPCs水平升高与Aβ沉积增加、tau磷酸化和神经炎症相关。
我们还发现色氨酸（一种必需氨基酸）的代谢与临床诊断和血浆P-tau231相关。尿素循环/氨基基团代谢与生物标志物支持的AD和所有P-tau生物标志物相关。酪氨酸代谢与生物标志物支持的AD、P-tau181和P-tau217相关。色氨酸是必需氨基酸，是血清素（一种参与情绪调节和认知的神经递质）合成的前体。色氨酸代谢的改变可能影响大脑中血清素的可用性，并导致AD病理生理学，特别是Aβ病理。Aβ积累可以破坏色氨酸代谢，导致色氨酸及其代谢物水平改变。相反，色氨酸代谢物（如喹啉酸）可以影响Aβ聚集和清除，可能影响疾病进展。
综上所述，这些结果表明，将生化分析与疾病生物标志物相结合对于更好地理解AD发病机制中的代谢异质性以及识别疾病生物学机制至关重要。具体而言，识别与血浆生物标志物相关的代谢途径可能表明AD病理在不同疾病阶段的潜在生物学机制。
总之，我们表明几种lysoPCs与AD早期淀粉样变性稳健相关，如P-tau181和P-tau217所测量。鉴于lysoPCs在将长链多不饱和脂肪酸运输到大脑中起着重要作用，我们的发现表明大脑中的脂肪酸代谢变化早在AD早期就已发生，并表明循环中lysoPCs/PUFAs的水平可能影响疾病发作或进展。这项研究展示了基于高分辨率质谱的非靶向代谢组学在揭示具有异常血浆生物标志物谱的参与者的生化差异以及识别疾病不同阶段的代谢扰动方面的效用。此外，在治疗干预期间，可能可以使用代谢组学分析来监测这些关键生化过程。
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