摘要
本研究旨在确定三氯蔗糖-6-乙酸酯（人工甜味剂三氯蔗糖的结构类似物）的毒理学和药代动力学性质。三氯蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖制造过程中的中间体和杂质，近期商业三氯蔗糖样品中发现含有高达0.67%的三氯蔗糖-6-乙酸酯。在啮齿动物模型中的研究发现，三氯蔗糖-6-乙酸酯也存在于粪便样本中，其水平相对三氯蔗糖高达10%，表明三氯蔗糖在肠道中也可能被乙酰化。采用MultiFlow®分析（一种高通量基因毒性筛选工具）和检测细胞遗传学损伤的微核试验均表明三氯蔗糖-6-乙酸酯具有基因毒性。通过MultiFlow®分析，其作用机制被归类为致断裂（产生DNA链断裂）。每日单次三氯蔗糖增甜饮料中三氯蔗糖-6-乙酸酯的含量可能远超基因毒性毒理学关注阈值（TTCgenotox）的0.15微克/人/天。采用RepliGut®系统使人体肠道上皮暴露于三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖，并进行RNA-seq分析以确定这些暴露诱导的基因表达。三氯蔗糖-6-乙酸酯显著增加了与炎症、氧化应激和癌症相关的基因的表达，其中金属硫蛋白1G基因（MT1G）表达量最高。人体横结肠上皮的跨上皮电阻和通透性测量表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖均损害肠屏障完整性。三氯蔗糖-6-乙酸酯还抑制了细胞色素P450家族的两个成员（CYP1A2和CYP2C19）。总体而言，三氯蔗糖-6-乙酸酯的毒理学和药代动力学发现对三氯蔗糖本身的安全性和监管状态提出了重大健康关切。
关键词：三氯蔗糖；三氯蔗糖-6-乙酸酯；基因毒性；基因表达；肠屏障
引言
背景：发现与合成
三氯蔗糖是一种氯化人工甜味剂，在全球范围内作为糖替代品用于成千上万的食品、饮料和药品中。三氯蔗糖的甜味是在伦敦女王伊丽莎白学院发现的，作为化学修饰蔗糖用于可能工业应用计划的一部分。一个结构修饰是新型二糖果糖-半乳糖的氯化版本，其中三个羟基被氯原子取代，化学名称为1,6-二氯-1,6-二脱氧-β-D-呋喃果糖基-4-氯-4-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷。该化合物最初称为三氯半乳蔗糖，但后来被命名为三氯蔗糖。三氯蔗糖的甜度大约是蔗糖的385至650倍，具体取决于应用。制造过程包括从蔗糖经多步合成三氯蔗糖-6-乙酸酯，随后脱酰基产生三氯蔗糖。三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖的化学结构见图1。制造过程中生成的三氯蔗糖-6-乙酸酯中间体作为杂质保留在商业来源的三氯蔗糖中。
（图1：三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖的化学结构）
历史安全声明
三氯蔗糖在北美、欧洲和亚洲获得监管批准，并建立了可接受每日摄入量水平。监管批准和ADI的建立基于20世纪80年代和90年代初在大鼠、小鼠、狗、兔和人类中进行的史研究，最终部分于2000年发表。这些历史研究对三氯蔗糖提出了以下6项声明，并构成了其监管批准的理由：
- 体内稳定性：在肠道中不变地通过。
- 肠道微生物群：对肠道微生物群无影响。
- 肠屏障：对肠道组织无影响。
- 生物蓄积：不生物蓄积。
- 代谢：对代谢无影响，包括血糖或胰岛素。
- 生物学/毒理学影响：无基因毒性，无相关生物学显著后果，且热稳定。
基于这些历史声明，JECFA和SCF为人类设定了每天每公斤体重15毫克的ADI。美国FDA设定的ADI较低，为每天每公斤体重5毫克。
与历史安全研究相矛盾的独立研究
然而，自监管批准以来的许多科学研究调查并不证实关于三氯蔗糖生物命运或安全性的6项早期历史声明中的任何一项。
体内稳定性
在三氯蔗糖剂量的大鼠的尿液和粪便中发现了两种乙酰化三氯蔗糖生物转化产物，这一发现与三氯蔗糖稳定且以原形（即未代谢）排泄的声明不一致。更丰富的乙酰化代谢物被鉴定为三氯蔗糖-6-乙酸酯，其对三氯蔗糖暴露的生物学后果的相对贡献尚未确定。
肠道微生物群
在批准的ADI水平内摄入三氯蔗糖的人类和/或动物被发现在胃肠道中破坏微生物组。怀孕和哺乳期小鼠的母体摄入也影响了其后代的微生物组。在三氯蔗糖增甜的饮料中也检测到了哺乳期妇女母乳中的三氯蔗糖，表明其被哺乳婴儿摄取。
肠屏障
三氯蔗糖也影响肠道组织。三氯蔗糖摄入诱导了组织病理学变化，包括淋巴细胞渗入肠上皮、腺体紊乱和上皮瘢痕形成，增加了克罗恩病样回肠炎中细菌渗入回肠固有层，提高了派尔斑中CD3+T细胞、CD19+B细胞和IgA+浆细胞的百分比，显著增加了粪便胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶水平，降低粪便β-葡萄糖醛酸酶，引发回肠和结肠中的淋巴细胞聚集，并促进了炎症和结肠炎相关结直肠癌风险。此外，母体摄入三氯蔗糖抑制了后代肠发育，破坏屏障功能，并诱导潘氏细胞缺陷。体外研究表明，三氯蔗糖增强了生物膜形成以及细菌侵入肠上皮细胞，并破坏了肠道上皮模型中的紧密连接和屏障功能。
生物蓄积
三氯蔗糖被发现在大鼠脂肪组织中生物蓄积，在停止40天喂养期后两周仍存在，尽管它已从尿液和粪便中消失。一项体外研究报告称，三氯蔗糖增加了培养脂肪细胞中的脂质积累和脂肪细胞分化基因的表达。
代谢
某些人类受试者在液体或胶囊中摄入三氯蔗糖后，观察到血浆中的葡萄糖和/或胰岛素浓度改变，当伴随碳水化合物或其他非热量甜味剂时也是如此。妊娠期母体摄入三氯蔗糖影响了后代的代谢，包括下调肝脏解毒机制和改变细菌代谢物。其他研究报告说，三氯蔗糖可能影响肠促胰岛素激素，包括胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP），以及钠依赖性葡萄糖共转运蛋白-1（SGLT-1）。此外，三氯蔗糖被证明会削弱甲状腺功能。在美国和欧洲获得监管批准的水平下长期摄入三氯蔗糖也会改变粪便代谢组、肝脏蛋白质组，并诱导参与首过代谢的两种肠蛋白的表达，即P-糖蛋白（P-gp）和细胞色素P450（CYP3A4）。
生物学/毒理学影响
自监管批准以来，其他独立研究调查报道了包括基因毒性和癌症风险在内的毒理学发现。从产前开始在整个生命周期内通过饲料给予三氯蔗糖诱导了雄性小鼠的造血性肿瘤，如白血病。在结直肠癌小鼠模型中检测到三氯蔗糖处理后结直肠肿瘤数量和大小显著增加。四项使用彗星试验的不同研究发现三氯蔗糖损伤了DNA。三氯蔗糖还增强了大肠杆菌的抗菌素耐药性和突变频率。此外，用甘油或脂质加热三氯蔗糖发现产生氯丙醇，这是一类潜在有毒化合物，这一发现得到后续研究的支持，这些研究也报告了三氯蔗糖在温和温度条件下的热不稳定性，并伴有有害多氯化合物的生成。
进行额外安全性研究的理由
目前尚未确定自监管批准以来报道的不良生物学发现是由于三氯蔗糖本身、乙酰化三氯蔗糖（例如三氯蔗糖-6-乙酸酯）还是两者共同暴露所致。三氯蔗糖-6-乙酸酯的暴露可能发生在三氯蔗糖摄入期间，或由三氯蔗糖在肠道中代谢产生。近期商业三氯蔗糖样品中残留的三氯蔗糖-6-乙酸酯含量各不相同，最高达0.67%。McNeil Specialty Products Company在向美国FDA提交的食品添加剂请愿书中承认了三氯蔗糖批次中三氯蔗糖-6-乙酸酯的存在。然而，在三氯蔗糖剂量的大鼠粪便中三氯蔗糖-6-乙酸酯相对于三氯蔗糖的浓度显著高于商业三氯蔗糖样品中的量，粪便三氯蔗糖-6-乙酸酯水平高达10%。粪便样品中三氯蔗糖-6-乙酸酯与三氯蔗糖比率的显著升高可能是由于肠道共生菌对三氯蔗糖的乙酰化作用。已知肠道中的共生菌会乙酰化外源性化合物。此前Labare和Alexander注意到包括细菌在内的微生物在污水和土壤样品中代谢三氯蔗糖。此外，Sun等人报道了一种解淀粉芽孢杆菌既能乙酰化也能脱乙酰化三氯蔗糖。总体而言，这些发现表明，生物学上对三氯蔗糖-6-乙酸酯的暴露可能来自于摄入商业不纯的三氯蔗糖，也来自于肠道中三氯蔗糖的乙酰化作用。
尚未知道三氯蔗糖-6-乙酸酯暴露的潜在不良健康影响，因为该化学品尚未单独使用一套毒性测试来评估人类风险。对科学文献（包括政府网站、化学数据库、专利文献和科学出版物）进行全面和系统的搜索，未发现任何关于三氯蔗糖-6-乙酸酯基因毒性和细胞毒性的明显信息。
进行的其他研究
在本报告中，进行了8项实验以筛选三氯蔗糖-6-乙酸酯及其结构母体三氯蔗糖（对照）的毒理学和药代动力学性质。这8项实验采用了以下测试：
- 体外MultiFlow®分析，一种快速高通量筛选工具，预测致断裂性和非整倍体性，用于确定基因毒性潜力。
- 在胸苷激酶6细胞中进行传统的体外哺乳动物细胞微核试验，以评估潜在的细胞遗传学/染色体损伤。
- 采用计算机模型Applier Leadscope®程序检测具有潜在诱导基因突变的化学结构特征。
- 进行传统的细菌反向突变试验（Ames试验）以评估致突变性潜力。
- 使用RepliGut®系统评估人体横结肠的跨上皮电阻和通透性，以研究肠屏障的潜在损伤和完整性。
- 利用RNA-seq研究基因表达，并鉴定人体肠上皮中差异表达的基因。
- 进行肝微粒体稳定性试验以评估潜在的肝脏生物转化。
- 进行细胞色素P450抑制研究以评估对解毒酶的潜在钝化作用，从而可能引起药物-药物相互作用。
这些毒理学和药代动力学测试在独立的分析实验室中进行，这些实验室是根据其在特定体外技术方面的专业知识选定的。进行这一系列多项检测是因为没有单个测试能够明确识别化合物的众多潜在毒理学和药代动力学性质。
方法
测试物品
8项实验中使用了两种测试物品，三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖，以确定其毒理学和药代动力学性质。三氯蔗糖-6-乙酸酯由江苏药明康德制药科技有限公司合成。三氯蔗糖-6-乙酸酯结构符合要求，纯度为99.7%，经1H NMR谱、质谱和高效液相色谱-蒸发光散射检测器认证。用于几项研究中的对照和比较的三氯蔗糖购自Sigma-Aldrich。它含有0.5%的三氯蔗糖-6-乙酸酯，由HPLC-MS/MS测定，这与商业食品级三氯蔗糖一致。
实验1：TK6细胞中的体外MultiFlow® DNA损伤试验
采用快速高通量流式细胞术分析在人体TK6细胞中评估三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖的基因毒性潜力。这一DNA损伤筛选工具根据两种致断裂敏感生物标记物（γH2A×和p53）和两种非整倍体敏感生物标记物（p-H3和多倍体）的增加预测化合物是致断裂剂、非整倍体剂还是非基因毒性物质。该试验由BioReliance按照其方案进行。使用高性能数学算法根据已建立的全球评估因子预测作用模式，这些因子为每种生物标记物提供了指示显著倍增长的阈值。
实验2：TK6细胞中的体外哺乳动物细胞微核试验
在TK6细胞中进行微核试验以确定暴露于三氯蔗糖-6-乙酸酯的细胞胞质中是否存在微核。微核是由DNA断裂（致断裂剂）或由数值染色体畸变（非整倍体剂）诱导的小型核外结构。微核频率的升高是细胞遗传学/染色体损伤的生物标记物。该微核试验由BioReliance按照OECD指南进行。
实验3：Leadscope®计算机模型评估致突变潜力
采用定量结构活性工具Leadscope®，基于化学结构预测三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖的基因毒性潜力。该模型利用基于ICH M7的大型致突变毒理学数据库，生成计算结构-活性预测。
实验4：细菌反向突变试验（Ames
实验4：细菌反向突变试验（Ames Test）
细菌反向突变试验由BioReliance根据OECD指南进行。该经典致突变性试验用于评估三氯蔗糖-6-乙酸酯、三氯蔗糖和/或其代谢物在存在和不存在外源代谢活化系统（S9）的情况下，在沙门氏菌TA98、TA100、TA1535、TA1537菌株和大肠杆菌WP2 uvrA菌株的基因座上诱导反向突变的潜力。
实验5：人体横结肠上皮的跨上皮电阻和通透性评估
采用高通量体外肠干细胞平台筛查三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖对人体横结肠的影响。该试验由Altis Biosystems进行。RepliGut®系统由在transwells上生长的极化肠细胞组成，模拟正常肠屏障功能。在两次独立试验中评估了三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖对跨上皮电阻和通透性的影响。跨上皮电阻是单层电阻的测量值，是屏障功能和紧密连接完整性的间接指标。色谱分析显示，在RepliGut®系统中，三氯蔗糖并未转化为三氯蔗糖-6-乙酸酯。
实验6：横结肠的RNA-seq和基因表达
利用RNA-seq分析转录组，并确定由于暴露于三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖而导致的基因表达变化。差异基因表达分析用于确定人体横结肠中由三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖诱导的、相对于对照的基因表达变化。总共有12,553个基因在低丰度过滤后进行了分析。
实验7：用于半衰期测定的肝微粒体稳定性试验
进行微粒体稳定性试验以确定两种测试物品在含有包括细胞色素P450在内的膜结合代谢酶的肝微粒体存在下的体外半衰期。该试验旨在使用辅酶NADPH测定5种不同物种中的I相代谢。
实验8：人肝微粒体中细胞色素P450外源性解毒酶的抑制
进行细胞色素P450抑制试验以确定三氯蔗糖-6-乙酸酯或三氯蔗糖是否是代谢外源性和内源性化合物的CYP酶的抑制剂。根据美国FDA的建议，选择CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5进行评估。
结果
实验1：TK6细胞中的体外MultiFlow® DNA损伤试验
MultiFlow®试验结果表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯在+S9和-S9条件下均表现出典型的致断裂特征。在+S9处理中，由于3个连续浓度的三氯蔗糖-6-乙酸酯的倍数升高达到或超过了24小时γH2A×和24小时核p53生物标记物的GEF阈值，因此做出致断裂判定。在无S9的24小时处理中检测到致断裂判定，因为在2个连续浓度中倍数升高超过了4小时核p53和24小时核p53的阈值，且一个浓度超过了24小时γH2A×的阈值。因此，有S9代谢活化时三氯蔗糖-6-乙酸酯的致断裂性出现在比无S9活化时更低的浓度下。三氯蔗糖-6-乙酸酯未显示非整倍体特征。
对浓度高达3980 µg/ml的三氯蔗糖进行的MultiFlow®试验显示，在TK6细胞中，无论有无S9，均无明显的基因毒性预测。然而，在未活化的处理中，从994 µg/ml开始有4个连续递增浓度的三氯蔗糖导致γH2A×（DNA断裂标记物）升高超过2倍。
实验2：TK6细胞中的体外哺乳动物细胞微核试验
体外哺乳动物细胞微核试验的结果表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯在无S9的27小时处理中呈阳性，但在有S9时未呈阳性。即在无S9条件下，三氯蔗糖-6-乙酸酯升高了微核频率，这是细胞遗传学/染色体损伤的生物标记物。当合并评估所有细胞群体（单核、双核和多核）时，在27小时无S9处理中，1000 µg/ml浓度下微核频率显著升高。对500、750和1000 µg/ml这三个最高浓度的Cochran-Armitage趋势检验显示，在该浓度范围内存在显著的浓度依赖性升高，且微核频率超出历史溶剂对照限值。数据表明三氯蔗糖-6-乙酸酯具有基因毒性，这与MultiFlow®试验结果一致。
本研究未对三氯蔗糖本身进行微核试验，因为之前监管评估期间提交的微核试验结果不明确，且MultiFlow®试验也未呈阳性。
实验3：Leadscope®计算机模型评估致突变潜力
Leadscope®定量结构活性工具的共识预测表明三氯蔗糖-6-乙酸酯可能具有致突变性，并可能诱导可遗传的永久性遗传变异。Leadscope®还就三氯蔗糖-6-乙酸酯中作为活性/主要部分或相关分子片段的仲烷基卤化物发出了细菌突变警报。该程序建议使用标准沙门氏菌和/或大肠杆菌菌株进行细菌反向突变试验以进行后续研究。对三氯蔗糖的这些发现不明确。
实验4：细菌反向突变试验（Ames Test）
细菌反向突变试验的数据表明，根据研究方案的条件和标准，三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖均为阴性（无致突变性）。三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖和/或其代谢物在存在和不存在外源代谢活化系统的情况下，均未在4株沙门氏菌或大肠杆菌WP2 uvrA菌株中诱导反向突变。这些结果未能证实Leadscope®的计算机预测，表明三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖无致突变性。这些观察结果表明，尽管三氯蔗糖-6-乙酸酯在MultiFlow®和微核试验中均具有基因毒性，但其引发的DNA损伤可能不会导致细胞子代中的永久性改变，因为它不具有致突变性。
实验5：人体横结肠上皮的跨上皮电阻和通透性评估
在无细菌存在的情况下，三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖均在毫摩尔浓度下改变了人体结肠上皮单层的跨上皮电阻和通透性。结果表明，用三氯蔗糖-6-乙酸酯单次处理24小时导致的跨上皮电阻降低始于5 mM，并在10 mM时完全崩溃。在10 mM三氯蔗糖-6-乙酸酯暴露后，对40 kDa FITC-葡聚糖的相对通透性显著增加。对于三氯蔗糖，跨上皮电阻的降低始于40 mM，并在80 mM时完全崩溃。在80 mM和160 mM三氯蔗糖孵育后，对40 kDa FITC-葡聚糖的相对通透性显著升高。
实验6：横结肠的RNA-seq和基因表达
三氯蔗糖-6-乙酸酯与对照相比：34个基因差异表达，其中23个被鉴定。与对照相比，在三氯蔗糖-6-乙酸酯样品中，有16个被鉴定基因的表达显著增加。其中三个基因MT1G、SHMT2和ATF3的倍数变化异常大，分别为253.82、81.23和54.49。
三氯蔗糖与对照相比：仅有两个蛋白编码基因差异表达。COX10在三氯蔗糖中的表达高于对照。FAM166A在三氯蔗糖中的表达低于对照。
三氯蔗糖与三氯蔗糖-6-乙酸酯相比：有186个基因差异表达。FDFT1基因在三氯蔗糖中相对于三氯蔗糖-6-乙酸酯表现出最大的表达变化，上调30.93倍。
三方比较：鉴定出464个差异表达基因。在“细胞组分”下的7个基因本体类别中存在过表达。
实验7：用于半衰期测定的肝微粒体稳定性试验
肝微粒体稳定性试验的结果显示，三氯蔗糖-6-乙酸酯在五种物种的微粒体中被肝脏部分提取，而三氯蔗糖则非常稳定（半衰期大于180分钟）。后续在人肝微粒体中的研究得到三氯蔗糖-6-乙酸酯的半衰期为37.6分钟（无论有无NADPH），三氯蔗糖的半衰期大于180分钟（无论有无NADPH）。数据表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯的提取不需要NADPH。
实验8：人肝微粒体中细胞色素P450外源性解毒酶的抑制
发现三氯蔗糖-6-乙酸酯是人肝微粒体中CYP1A2和CYP2C19的抑制剂，而对CYP2C9、CYP2D6或CYP3A4/5未检测到显著抑制。三氯蔗糖对任何CYP450酶均无明显抑制效应。在初次研究和重复研究中，CYP1A2的平均半数抑制浓度值分别为42.9 µM和65.1 µM，CYP2C19的平均半数抑制浓度分别为89.3 µM和46.3 µM。
讨论
本研究中进行的实验发现，三氯蔗糖-6-乙酸酯具有基因毒性，其作用机制被归类为致断裂（诱导DNA链断裂）。此外，人体肠上皮暴露于三氯蔗糖-6-乙酸酯以及三氯蔗糖本身会在毫摩尔浓度下损害紧密连接并损伤肠屏障功能。人体肠道组织的转录组（通过RNA-seq确定）注意到三氯蔗糖-6-乙酸酯显著增加了与炎症、氧化应激和癌症相关的基因表达。三氯蔗糖-6-乙酸酯还在低微摩尔浓度下抑制了CYP450家族的两个成员，这可能会干扰内源性和外源性化学物质（包括药物）的代谢。
三氯蔗糖的杂质和代谢物三氯蔗糖-6-乙酸酯在MultiFlow®高通量试验以及标准微核试验中被发现对类淋巴母细胞具有基因毒性。在MultiFlow®试验中，无代谢活化时三氯蔗糖-6-乙酸酯的最低观察基因毒性浓度为1.607 mM，而有代谢活化时最低观察水平为803 µM。代谢活化导致更低的观察浓度这一发现表明三氯蔗糖-6-乙酸酯可能转化为额外的DNA反应性代谢物。利用MultiFlow®试验得出的结论是，其作用机制是致断裂（诱导DNA链断裂）。这些关于三氯蔗糖-6-乙酸酯基因毒性的观察结果得到了哺乳动物细胞微核试验中细胞遗传学/染色体损伤的证实。
三氯蔗糖-6-乙酸酯基因毒性潜在的不良健康影响尚未在存档科学出版物中得到解决。此外，自这种甜味剂进入食品供应以来，制造商似乎没有进行系统的上市后健康影响监测。表16提供了摄入单一三氯蔗糖增甜饮料后可能发生的三氯蔗糖-6-乙酸酯暴露水平的三个示例。
虽然一些监管机构认为不存在可接受的基因毒性暴露水平，但其他机构评估了与潜在暴露和作用模式相关的基因毒性风险。在饮食中含量较低的化学品，建议的基因毒性毒理学关注阈值为0.15 µg/人/天。表16中的数据表明，含三氯蔗糖饮料的单份服务可能含有超过该TT Cgenotox四到五个数量级的三氯蔗糖-6-乙酸酯水平。
然而，由于重复给药、肠道中三氯蔗糖生物转化为三氯蔗糖-6-乙酸酯以及生物蓄积的可能性，实际暴露量可能远超表16中的水平。每日重复给药会增加对三氯蔗糖-6-乙酸酯的暴露，因为据报道，在停止摄入三氯蔗糖后，这种杂质在体内可持续存在至少11天。尽管本研究表明该化合物在肝脏中被部分提取，但三氯蔗糖-6-乙酸酯在体内的持久性仍然存在。已证明肠道中存在三氯蔗糖向三氯蔗糖-6-乙酸酯的生物转化，使商业三氯蔗糖样品中的百分比提高了大约20倍。此外，三氯蔗糖-6-乙酸酯比三氯蔗糖本身更具亲脂性，这可能通过增强肠道吸收和跨细胞屏障转运而有利于生物蓄积。
先前对三氯蔗糖基因毒性的质疑已经提出，但显然未调查三氯蔗糖-6-乙酸酯对这些效应的贡献。三氯蔗糖在彗星试验中发现引发DNA损伤，我们目前发现三氯蔗糖-6-乙酸酯具有基因毒性可能部分解释了先前关于三氯蔗糖的这些观察结果。从胎儿第12天开始在整个生命周期内饮食性接触三氯蔗糖，被发现引发了雄性小鼠中显著的剂量相关性恶性肿瘤发病率升高和显著的剂量相关性造血性肿瘤发病率增加。三氯蔗糖暴露从产前开始产生造血性肿瘤的机制尚不清楚，但像三氯蔗糖-6-乙酸酯这样的化合物能轻易扩散通过胎盘的脂质膜和哺乳母亲的乳腺组织，并可能随时间推移而生物蓄积。
最近的流行病学研究发现，结直肠癌和其他消化系统癌症的早发性在许多中等和高收入国家迅速增加，这种人类癌症发病率的升高与饮食选择和菌群失调有关。结直肠癌的全球增长与全球范围内也在增加的炎症性肠病负担同步。三氯蔗糖消费被认为是动物模型中炎症性肠病的致病因素以及结直肠癌的风险因素，但三氯蔗糖-6-乙酸酯对此发现的潜在贡献尚不清楚。
目前体外研究对人体横结肠上皮跨上皮电阻和通透性的评估发现，在无细菌存在下，三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖都在毫摩尔浓度下破坏胃肠上皮紧密连接和粘膜屏障功能。单次24小时接触40 mM三氯蔗糖后，跨上皮电阻发生显著崩溃，这仅比欧盟目前批准用于单一糖浆型食品补充剂（2400 mg/kg，即6 mM）中的三氯蔗糖浓度高6.7倍。增强的肠道通透性（肠漏）使得微生物和代谢物进入体内，这在炎症性肠病、慢性肝病以及结直肠癌的发病机制中起着重要作用。此外，肠道通透性升高，加上数天内反复摄入和滞留结肠内容物，可能增加肠腔内浓度、吸收和全身暴露于三氯蔗糖和三氯蔗糖-6-乙酸酯，长期导致生物蓄积和毒性。
先前的研究表明，除了三氯蔗糖和三氯蔗糖-6-乙酸酯与紧密连接直接相互作用外，其他因素也在三氯蔗糖暴露引起的肠屏障破坏中起作用。这些因素包括肠道微生物群的菌群失调以及与氧化应激相关的炎症和促炎细胞因子的升高。这些研究不支持美国FDA监管批准的食品添加剂请愿书中“三氯蔗糖既不抑制需氧也不抑制厌氧微生物”的历史声明。
从目前无细菌情况下人体横结肠的研究中得出的另一个结论是，Bornemann等人观察到的三氯蔗糖向三氯蔗糖-6-乙酸酯的生物转化是由细菌介导而非宿主代谢介导的。因此，Bornemann等人报道的粪便样本中三氯蔗糖-6-乙酸酯与三氯蔗糖比例的升高很可能源于细菌代谢，而非宿主肠上皮中乙酰辅酶A的代谢。
本研究中RNA-seq和基因表达分析表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯上调了横结肠中与对有害化学物质和条件的生物反应相关的基因表达。MT1G无论在哪一个比较中都表现出最大的变化。三个额外基因SHMT2、ATF3和CHST3也显著高表达。其他一些基因的表达增加也与某些组织中的癌症有关。仅有COX10和FAM166A两个基因在三氯蔗糖和对照样本之间差异表达。
关于药代动力学，肝微粒体中的半衰期研究表明，三氯蔗糖-6-乙酸酯在一定程度上被肝脏提取，在人中的效果强于大鼠，但三氯蔗糖-6-乙酸酯的吸收和代谢尚未完全定性。该提取似乎不涉及人肝微粒体中的I相代谢，因为它不依赖于NADPH。尽管三氯蔗糖-6-乙酸酯的提取率高于三氯蔗糖，但在停止三氯蔗糖摄入后，三氯蔗糖-6-乙酸酯在尿液中检测到的时间比三氯蔗糖长5天。这可能归因于三氯蔗糖-6-乙酸酯更强的亲脂性，因而具有更高的生物蓄积潜力。
对人肝微粒体外源性解毒酶的研究发现，三氯蔗糖-6-乙酸酯是CYP450家族两个成员（CYP1A2和CYP2C19）的抑制剂。抑制这些酶可能潜在地影响药物的生物利用度和内源性底物的水平。未发现三氯这里接着上一段的结尾，完成讨论部分最后关于药代动力学的段落，以及结论部分。
抑制这些酶可能潜在地影响药物的生物利用度和内源性底物的水平。未发现三氯蔗糖对CYP450酶有任何明显的抑制效应。抑制CYP1A2和CYP2C19可能会减少内源性和外源性化学物质的代谢，并可能引发潜在的不良代谢效应。
CYP1A2代谢许多内源性化合物，如视黄醇、褪黑素、类固醇（包括雌二醇）、雌激素、尿卟啉原和花生四烯酸。抑制CYP1A2可能会潜在增加雌二醇水平，而雌二醇与乳腺癌之间存在关联。抑制CYP1A2也可能会升高咖啡因（CYP1A2的底物）的血浆水平，可能加剧焦虑、睡眠问题甚至高血压。三氯蔗糖-6-乙酸酯抑制CYP1A2还可能会潜在增加作为CYP1A2底物的药物的血浆浓度。代表性的CYP1A2底物包括阿洛司琼、阿西替尼、咖啡因、氯氮平、氟他胺、夫罗曲普坦、褪黑素、美西律、米氮平、奥氮平、雷沙吉兰、他克林、茶碱、替扎尼定和氨苯蝶啶。三氯蔗糖-6-乙酸酯抑制CYP2C19可能会潜在升高CYP2C19底物的血浆浓度。已知受CYP2C19抑制剂显著影响的其他代表性底物包括阿布昔替尼、大麻二酚、卡立普多、西洛他唑、西酞普兰、氯巴占、氯吡格雷、地西泮、埃索美拉唑、美沙酮、奥美拉唑、苯妥英和托法替布。
三氯蔗糖-6-乙酸酯对CYP1A2和CYP2C19的抑制作用是在无细菌存在下在人肝微粒体中体外观察到的。然而，三氯蔗糖-6-乙酸酯还可能产生额外的药代动力学效应，包括抑制或诱导，因为在体内，肠道菌群和炎症众所周知会改变CYP450代谢酶和转运蛋白的表达和活性。此外，有报道称氧化应激会诱导细胞色素P450 3A4以及转运蛋白P-糖蛋白，并且在三氯蔗糖摄入12周后，有体内研究报道了CYP3A4和P-gp两者都被诱导。
结论
本研究进行的8个项目为大量且不断增长的科学文献增添了新的内容，这些文献报告了归因于三氯蔗糖暴露的不良生物学影响。在本次研究中，三氯蔗糖-6-乙酸酯，一种三氯蔗糖的杂质和代谢物，被发现具有基因毒性，其作用模式为致断裂，与诱导DNA断裂相关。在无肠道细菌存在下，将肠上皮体外暴露于毫摩尔浓度的三氯蔗糖-6-乙酸酯和三氯蔗糖均会损害肠屏障功能的完整性。三氯蔗糖-6-乙酸酯诱导了肠上皮中与炎症、氧化应激和癌症相关的基因表达，包括MT1G和SHMT2。三氯蔗糖-6-乙酸酯还阻断了代谢内源性和外源性化合物的细胞色素P450家族的两个成员（CYP1A2和CYP2C19），这可能导致不良的毒理学暴露。这些发现对三氯蔗糖继续存在于食品供应中提出了健康和安全关切，并表明需要对其监管状态进行审查。
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