摘要
两岁前的早期儿童事件对微生物组的发展和后期平衡的免疫系统至关重要。我们研究了感染易感性和抗生素治疗后微生物组的恢复力是否与早期儿童微生物群中的关键分类群相关。因此，我们对德国LoewenKIDS强化亚组中儿童的粪便样本进行了纵向微生物群分析。根据抗生素治疗的暴露情况，样本组定义为从未治疗的对照组、治疗前45-225天（pre45-225）、治疗前0-30天（pre0-30）、治疗后0-30天（post0-30）或治疗后>90天且年龄>540天（post>90）。162名儿童的1176份粪便样本纳入我们的分析，其中49名儿童接受了抗生素治疗。使用针对年龄调整的广义线性混合模型，我们发现高丰度的拟杆菌属与45-225天后接受抗生素治疗相关，而治疗前低拟杆菌属丰度与治疗后低α多样性和增加的β多样性相关。我们的数据表明拟杆菌属在易感需要抗生素治疗的感染以及早期儿童微生物组稳定性和恢复力中起关键作用。
引言
人类微生物组从婴儿期到成年期发展，与宿主的消化和免疫功能密切相关。在生命的最初几周，婴儿肠道微生物组被先锋细菌定植，包括乳杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、拟杆菌属、副拟杆菌属和普雷沃氏菌属，随后在母乳喂养期间以双歧杆菌属为主。随着儿童成长，微生物群逐渐多样化为更复杂的组成，包括更高比例的厚壁菌门和拟杆菌门。许多因素被认为会影响这一早期人类生命关键阶段的微生物组发展，包括分娩方式和早期营养（即母乳喂养与配方喂养）。
阴道分娩与5-31周龄期间拟杆菌属丰度增加相关。此外，母乳喂养停止的时间决定了双歧杆菌、葡萄球菌和链球菌丰度的降低，以及毛螺菌科丰度的增加。早期儿童微生物组的重大变化在约3岁前完成。这个时间窗口是一个关键阶段，为以后的健康和幸福奠定了基础。
在过去，严重的细菌感染如结核病、白喉、伤寒和霍乱导致全球儿童早期高死亡率。如今，工业化国家的儿科传染病包括耳朵、窦和上呼吸道其他部位的感染，大多数情况下可以通过抗生素治愈或由病毒引起。几项研究描述了早期儿童微生物组组成与儿童感染之间的关联；然而，需要更多大规模研究来涵盖与感染和抗生素使用相关的早期儿童微生物组动态变化。
抗生素治疗被认为是成人和早期儿童中微生物组的强烈影响因素，早期儿童使用抗生素与以后发展哮喘、过敏、炎症性肠病和其他炎症性疾病的增加风险相关。这些关联的潜在机制仍需澄清。早期免疫系统的训练或长期微生物组改变被认为是潜在但非排他的原因。对抗生素使用风险的认识增加，导致2012年至2021年间包括德国在内的许多工业化国家门诊抗生素消费减少，儿科抗生素消费也呈现类似趋势。
微生物组恢复力描述了在受抗生素等影响因素引起的失调后恢复原始微生物组组成和多样性的过程。不同抗生素类别在成人中的恢复时间和程度已被分析。然而，很少有研究调查早期儿童中的微生物组恢复力。我们的研究有两个目标。目标1是描述与易感需要抗生素治疗的儿童感染相关的早期儿童微生物组特征。目标2是描述与抗生素治疗后微生物组稳定性和恢复力相关的早期儿童微生物组特征。
结果
研究概述
在LoewenKIDS研究的强化亚组中纳入了286名儿童。其中，73名儿童未提供症状日记。37名儿童的16S测序未完成和/或症状日记在稿件准备时未完全收集和录入数据库，包括16名提供少于五份常规粪便样本的儿童。四名儿童因2岁前接受抗生素治疗但在提供最后一份常规粪便样本后被排除。两名儿童因症状日记中存在冲突数据被排除。八名儿童因少于五份常规粪便样本满足每份样本至少15,000个16S测序读数的标准而被排除。总共，162名儿童的1176份样本被纳入分析，其中包括113名在生命最初2年内从未接受抗生素治疗的儿童和49名至少经历一次抗生素治疗的儿童。女孩比例略高于男孩，无论是否接受抗生素暴露。在未接受抗生素的儿童中，80名（70.8%）通过阴道分娩出生，31名（27.4%）通过剖腹产出生（两名未报告），而在接受抗生素暴露的儿童中，40名（81.6%）通过阴道分娩出生，9名（18.4%）通过剖腹产出生（RR=0.66，95% CI [0.34, 1.28]）。在生命最初2年内接受和未接受抗生素的儿童之间，母乳喂养持续时间没有差异。39名儿童经历了一次，6名儿童经历了两次，1名儿童经历了三次，3名儿童经历了四次抗生素治疗。氨基青霉素（36.4%）和头孢菌素（48.5%）是最常见的抗生素类别（其他：15.2%）。抗生素治疗的原因是耳鼻喉（ENT，72.7%）、胃肠道（GI，1.5%）和泌尿生殖系统（UG，7.6%）感染（未知/其他：18.2%）。在抗生素暴露组中，开始抗生素治疗的中位年龄为417天（IQR：288-467天）。
微生物组组成概述
在0-180天龄期间，我们发现大多数儿童的微生物组以双歧杆菌属为主。一些儿童的微生物组特征为双歧杆菌属和拟杆菌属的混合，少数以埃希氏菌/志贺氏菌属、韦荣球菌属、梭菌属或链球菌属为主，这在Bray Curtis差异的主坐标分析（PCoA）中对应于松散聚类。540天龄以上的儿童的微生物组组成在PCoA图中更紧密地聚集在一起。在540天龄以上从未治疗的对照组与接受抗生素并属于样本post>90组的儿童之间，未观察到微生物组组成的差异（置换方差分析，p=0.6）。虽然540-851天龄的微生物组仍含有高丰度的双歧杆菌属，但拟杆菌属、布劳特菌属和粪杆菌属也普遍存在且丰度高。普雷沃氏菌属的流行率低。然而，该属在一部分儿童中达到高丰度，这与双歧杆菌属或拟杆菌属或两者都低丰度相关。
抗生素治疗前后的微生物组变化（目标1 & 2）
我们探索了抗生素治疗前后与从未治疗的对照组相比的微生物组多样性指数差异。在pre45-225组和从未治疗的对照组样本之间未观察到Shannon指数或BC±45的差异。虽然统计上不显著，但在pre0-30组（可能与症状或前症状条件重合）中Shannon指数高于从未治疗的对照组（β=0.40，95% CI [-0.0086, 0.81]，p=0.055）。同时，在BC±45方面未观察到明显差异。在post0-30组中，Shannon指数降低（β=-0.24，95% CI [-0.45, -0.027]，p=0.027），而BC±45非显著增加（β=0.036，95% CI [-0.0043, 0.076]，p=0.08）与从未治疗的对照组相比。在post>90组样本与从未治疗的对照组之间未观察到Shannon多样性和BC±45差异。
我们还探索了四个组（pre45-225，pre0-30，post0-30，post>90）与从未治疗的对照组相比，20个最常见属的丰度差异。我们在pre45-225组中观察到拟杆菌属丰度更高（eβ=1.49，95% CI [1.13, 1.97]，padj=0.048）和粪杆菌属丰度更低（eβ=0.53，95% CI [0.39, 0.73]，padj=0.0026）。在pre0-30组中，我们发现[Ruminococcus]-gnavus group（eβ=0.25，95% CI [0.094, 0.64]，padj=0.027）、链球菌属（eβ=0.17，95% CI [0.058, 0.51]，padj=0.015）和韦荣球菌属（eβ=0.17，95% CI [0.061, 0.49]，padj=0.015）的丰度降低。然而，与其他组相比，pre0-30组中拟杆菌属（eβ=1.94，95% CI [0.97, 3.86]，padj=0.16）和罗氏菌属（eβ=2.84，95% CI [1.27, 6.35]，padj=0.057）的丰度有所增加，尽管不显著。在post0-30组中，肠球菌属丰度增加（eβ=2.79，95% CI [1.64, 4.77]，padj=0.0019），而罗氏菌属丰度降低（eβ=0.37，95% CI [0.23, 0.59]，padj=0.00075）与从未治疗的对照组相比。值得注意的是，与从未治疗的对照组相比，在post>90组中未发现显著变化。然而，在这个时间段中，肠球菌属的略微增加仍然存在。
虽然pre0-30组中改变的分类群丰度可能受到感染的影响（抗生素最常见的指征），但我们试图进一步了解pre45-225时间框架中拟杆菌属和粪杆菌属改变的丰度。已知拟杆菌属丰度在阴道分娩与剖腹产出生的儿童之间存在差异。我们的数据证实了与阴道分娩出生的儿童相比，剖腹产出生的儿童在生命第一年中拟杆菌属丰度降低。这种差异在第二年消失。与母乳喂养持续时间高于中位数的儿童相比，母乳喂养持续时间低于中位数的儿童在大约0.5至1岁期间表现出拟杆菌属丰度的轻微且暂时性增加。
然而，在调整"分娩方式"和"母乳喂养持续时间"变量后，与从未治疗的对照组相比，在pre45-225组中观察到拟杆菌属丰度增加52%（eβ=1.52，95% CI [1.05, 2.19]，p=0.027）。相比之下，粪杆菌属丰度与"分娩方式"无关，甚至与"母乳喂养持续时间"呈负相关（eβ=0.83，95% CI [0.73, 0.95]，p=0.0081）。与从未治疗的对照组相比，pre45-225组中粪杆菌属丰度降低了74.1%（eβ=0.26，95% CI [0.17, 0.40]，p<0.001），表明低粪杆菌属丰度与随后45-225天内的抗生素治疗相关。分娩方式与组因子（即pre45-225与从未治疗的对照组）之间的强烈正交互作用进一步表明，这种关联在阴道分娩出生的儿童中比剖腹产出生的儿童中更为稳健。
确定微生物组恢复力（目标2）
我们使用post>90组中Shannon指数和BC±45作为指标，探索了可能影响早期儿童抗生素治疗后微生物组稳定性和恢复力的因素。未发现Shannon指数或BC±45与post>90样本中的"分娩方式"、"抗生素类别"、"症状类型"或'母乳喂养持续时间'之间的关联。包含所有因素的完整模型显示出类似结果。
为了调查微生物组组成模式是否预测了抗生素治疗后的长期稳定性或恢复力，我们将pre45-225样本中20个最常见细菌属的相对丰度与同一批儿童的post>90样本中的Shannon指数和BC±45相关联。我们发现pre45-225样本中拟杆菌属（eβ=1.92，95% CI [1.35, 2.72]，padj=0.0047）和布劳特菌属（eβ=2.05，95% CI [1.38, 3.03]，padj=0.0047）的较高丰度与post>90样本中的较高Shannon多样性相关。在pre45-225组和BC±45之间未发现20个最常见属中任何一个与post>90组之间存在显著关联。在从未治疗的对照组中，这些属与晚期（年龄>540天）的Shannon指数无关，表明拟杆菌属和布劳特菌属并非与高Shannon指数相关。然而，从未治疗的对照组具有与pre45-225组不同的年龄分布。
为了控制可能性，即特定年龄范围内的拟杆菌属或布劳特菌属丰度与>540天龄的Shannon指数相关，我们将从未治疗的对照组样本分为四个等大小的年龄范围（3-215，215-427，427-639和639-851天龄）。早期年龄范围（3-215天）中高布劳特菌属丰度与后期时间框架中的较高Shannon指数相关，而拟杆菌属则未发现这种关联。
虽然上述尝试针对pre45-225组中的年龄进行了调整，但无法针对post>90组中的年龄进行调整。我们接受了这一限制，因为post>90组被定义为>90天无抗生素治疗且年龄>540天，其中年龄对Shannon指数和BC±45的影响适中。然而，我们也对拟杆菌属和布劳特菌属丰度对微生物组稳定性的影响感兴趣，以及在治疗结束后的短时间内（即post0-30组样本中的Shannon指数和BC±45）的恢复力，其中年龄影响更强。
因此，我们将数据集分为具有低或高拟杆菌属丰度的儿童（对一个孩子所有样本中的拟杆菌属丰度进行中位数划分）或类似地，分为低或高布劳特菌属丰度。
具有低拟杆菌属丰度的所有儿童在所有采样时间点的中位年龄为368天（IQR：168-566天）。与对照组相比，这些儿童在post0-30组中表现出显著降低的Shannon指数（β=-0.42，95% CI [-0.73, -0.10]，p=0.0094）以及显著增加的BC±45（β=0.065，95% CI [0.0053, 0.13]，p=0.033），而在高拟杆菌属丰度的儿童中未观察到Shannon指数或BC±45的改变（中位年龄为373天（IQR：182-578天））。
具有高布劳特菌属丰度的所有儿童在所有采样时间点的中位年龄为389天（IQR：188-582天）。虽然在高布劳特菌属丰度儿童的post0-30样本中观察到Shannon指数显著降低（β=-0.24，95% CI [-0.47, -0.0025]，p=0.048），但与低布劳特菌属丰度儿童相比，差异不明显，反映了图3中post0-30样本中整体Shannon指数降低。
我们的观察表明，早期儿童中低拟杆菌属丰度与抗生素治疗后的低α多样性和高BC±45相关，这无法通过拟杆菌属丰度与α多样性或BC±45之间的抗生素无关关联来解释。
普雷沃氏菌在微生物群相关感染风险、稳定性和恢复力中的作用（目标1 & 2）
由于高丰度的拟杆菌属以前与工业化时代生活方式相关联，我们调查了普雷沃氏菌的作用，据报道它与这种生活方式呈负相关。由于普雷沃氏菌的流行率低，这与以前的报告一致，这使得该属未能达到20个最常见属的纳入标准。因此，它未显示在图4-7的主要结果中。然而，普雷沃氏菌在非阴性样本中达到高丰度。
为了分析四个治疗组（pre45-225，pre0-30，post0-30，post>90）与从未治疗的对照组相比普雷沃氏菌丰度的差异，我们应用了包括治疗组作为独立变量的零膨胀负二项混合模型。pre45-225组被用作未来感染的代理。我们发现与从未治疗的对照组相比，pre45-225组中普雷沃氏菌的相对丰度降低了64%，pre0-30组中降低了77%（eβ=0.36，95% CI [0.15, 0.86]，p=0.022，以及eβ=0.23，95% CI [0.07, 0.75]，p=0.015）。
为了调查普雷沃氏菌丰度对微生物组稳定性和恢复力的影响，我们将数据集分为具有低或高普雷沃氏菌丰度的儿童（对一个孩子所有样本中的普雷沃氏菌丰度进行中位数划分）。具有高于中位数普雷沃氏菌丰度的所有儿童在所有采样时间点的中位年龄为353天（IQR：146-539天）。在这些儿童中，与从未治疗的对照组相比，post0-30样本中观察到较低的Shannon指数（β=-0.49，95% CI [-0.80, -0.18]，p=0.0020）和非显著轻微增加的BC±45（β=0.048，95% CI [-0.014, 0.11]，p=0.13）。相比之下，在具有低于中位数普雷沃氏菌丰度的儿童中，post0-30样本与从未治疗的对照组之间未观察到差异。
讨论
在这项针对162名儿童的纵向出生队列研究中，我们追踪至2岁，旨在将早期儿童微生物组内细菌分类群的相对丰度及其整体状态与儿童感染的发生、微生物组稳定性和抗生素治疗后的恢复力相关联。我们观察到早期儿童中微生物组组成的改变及其对抗生素治疗的反应，这在此前已有描述。
抗生素治疗后30天内，我们观察到与从未治疗的对照组相比Shannon指数降低，β多样性略有但不显著增加，肠球菌属丰度增加，以及罗氏菌属丰度降低，这与早期报告一致。我们的数据还表明这些变化通常是短期的。
我们确定拟杆菌属为与儿童感染易感性和抗生素治疗后肠道微生物组稳定性和恢复力相关的关键属。我们还表明，高普雷沃氏菌属丰度与低儿童感染发生率和抗生素治疗后低微生物组稳定性和恢复力相关，表明拟杆菌属与普雷沃氏菌属富集的社区类型存在差异模式。
在抗生素治疗后30天内，我们观察到Shannon指数降低，与从未治疗的对照组相比β多样性略有但不显著增加，肠球菌属增加和罗氏菌属丰度降低。这些结果与氨苄西林治疗期间α多样性降低的报告一致，β-内酰胺治疗后社区结构改变和肠球菌属增加，以及使用氨基青霉素或头孢丙烯治疗后罗氏菌属减少。Zimmermann等人对不同抗生素的影响进行了更详细的综述。
我们的数据还表明这些变化通常是短期的。虽然很少有研究评估长期β-内酰胺影响，但当前文献主要报告短期可逆影响，与克林霉素、环丙沙星或大环内酯等药物的长期影响相反。大多数儿童在我们的研究中治疗时年龄超过6个月，我们对长期影响的定义（≥90天无抗生素且年龄>540天）与上述研究相比更为严格。因此，我们观察到的有限长期影响与先前报告一致。
在抗生素治疗前225至45天，我们观察到拟杆菌属丰度较高和粪杆菌属丰度较低。由于这一时期在治疗前几个月，这些模式不太可能由活跃感染驱动，而可能反映了与感染易感性相关的微生物组特征，这些感染大多数是耳鼻喉感染。我们探索了潜在因素：分娩方式和母乳喂养持续时间可能与粪杆菌属相关，但不能解释拟杆菌属关联。
先前的病例对照研究将拟杆菌属主导的微生物组与更高的细支气管炎风险相关联，并报告拟杆菌属在混合上呼吸道感染中存在。拟杆菌属相关的免疫调节功能可能解释了这些观察结果，包括短链脂肪酸的产生，特别是抑制中性粒细胞呼吸爆发的琥珀酸，这是对通常引起耳鼻喉感染的细胞外细菌病原体的重要防御策略，以及拟杆菌属鞘脂代谢，可能通过CD1d调节不变自然杀伤T（iNKT）细胞。据我们所知，这是第一项将肠道高拟杆菌属丰度与后来儿童呼吸道或听觉感染相关联的纵向研究。未来工作应通过宏基因组学表征拟杆菌属菌株以确定因果关系。
我们只观察到抗生素治疗后微生物组的轻微短期变化，在post>90组中未观察到明显改变。为了探索微生物组恢复力是否取决于症状类型、抗生素类别、分娩方式或母乳喂养持续时间，我们分析了每个因素。只有胃肠道症状与较低的晚期Shannon指数相关，尽管这不确定，因为它只是一个病例。微生物组稳定性和恢复力通常在拟杆菌属丰富的社区中更高，而拟杆菌属低的社区恢复更慢。早期儿童中拟杆菌属低的微生物组通常表现出较低的α多样性。这支持我们的观察，即拟杆菌属丰度可能标记了更有能力进行抗生素后恢复的社区。
机制研究表明，某些拟杆菌属菌株可以稳定肠道屏障或产生β-内酰胺酶，保护其他分类群免受抗生素影响。Chng等人确定了"恢复相关细菌"（RABs），包括几种拟杆菌属物种，这些物种在治疗前就已经富集并通过代谢粘液的碳水化合物活性酶促进恢复。小鼠研究表明RABs可以加速微生物组恢复并暂时为抗生素敏感分类群占据生态位。这一原理似乎在不同扰动中保持不变，包括儿童中的β-内酰胺抗生素和霍乱感染成人中的阿奇霉素。双歧杆菌长亚种婴儿亚种在母乳喂养期间丰富，同样减轻了抗生素引起的扰动。总体而言，这些数据表明微生物组稳定性和恢复力取决于关键分类群的存在，包括拟杆菌属和相关的RABs，这些分类群适应宿主营养源，如早期生活中的母乳低聚糖和随后的粘液。
在我们的研究中，拟杆菌属高丰度是稳定和弹性微生物组以及增加儿童感染易感性（大多数是耳鼻喉系统）的最强且统计上最稳健的预测因子。在我们的研究中，这种"高拟杆菌"社区类型还以高α多样性、布劳特菌属丰度和普雷沃氏菌属低流行率和丰度为特征。西方生活方式，包括摄入高热量/低纤维食物、室内停留、卫生环境、减少身体活动、减少阳光暴露和医疗干预，导致了微生物组的适应，由于跨代继承而变得稳定。
最显著的适应包括拟杆菌属丰度上升和普雷沃氏菌属流行率和丰度下降。一些研究还报告了布劳特菌属和瘤胃球菌属丰度的增加。
一方面，高拟杆菌属丰度促进儿童感染可能在过去具有进化劣势，而如今，由于更好的健康、营养和卫生标准、疫苗接种和抗生素治疗的可用性，这些感染已失去了大部分以前的威胁。另一方面，包括抗生素引起的那些在内的高频率失调事件依赖于拟杆菌属对西方型微生物组的稳定作用。
这项研究的优势在于在定义明确的儿童群体中频繁的粪便采样结合全面的元数据。同时，相对较小的病例数和使用16S rRNA扩增子测序而非宏基因组测序是限制因素。虽然排除了相当数量的儿童，但性别、分娩方式、抗生素治疗频率和类型以及症状在包括和排除的儿童之间是可比的（对于有症状日记的儿童）。
关于抗生素使用指征的数据不得不基于父母的报告重建，大多数情况下基于医生在就诊当天给出的"诊断"。由于没有关于致病病原体的数据，可能存在在某些情况下不需要抗生素治疗的情况。这可能限制了微生物群组成与后续感染之间关联的统计能力。未需要抗生素治疗的儿童感染在本研究中未被考虑，因此存在于从未治疗的对照组和抗生素治疗组的所有观察阶段中，可能会导致数据中无法解释的变异性。
普雷沃氏菌属的特殊分布未被负二项模型完美反映，即使包括零膨胀部分，样本量的逻辑模型统计能力也太低（数据未显示）。因此，普雷沃氏菌属的结果虽然有趣，但必须谨慎解释。
我们的数据显示，拟杆菌属对早期儿童微生物组的稳定性和恢复力很重要，并与儿童感染易感性增加相关。
方法
研究设计
LoewenKIDS研究是一项来自德国五个研究地区（布伦瑞克、汉诺威、哈雷（萨勒）、慕尼黑和不来梅）的观察性出生队列研究，已在详细描述。该研究已在Clinicaltrials.gov注册（标识符：NCT02654210）。简而言之，参与者（n=782）于2015年至2018年间招募，并从出生开始进行观察，前6年采用强化研究方案。父母每天记录呼吸道和胃肠道症状的日记，以及日常用药信息，如抗生素。问卷在6个月、1岁和此后每年提供给父母。本研究仅限于来自亚队列（n=286）的数据，其中父母在儿童生命最初2年内每年四次收集常规粪便样本。当儿童有胃肠道症状（腹泻或呕吐）时，父母还收集症状性粪便样本，但当前分析中排除了症状性样本。排除了少于五份常规粪便样本的参与者、无法获取症状日记的参与者、在提供最后一份常规粪便样本后接受抗生素治疗的参与者，或症状日记中关于抗生素治疗信息矛盾的参与者。
未在生命最初2年内接受抗生素的儿童样本被归类为从未治疗的对照组。在生命最初2年内至少接受一次抗生素治疗的儿童样本分为四组，根据与抗生素治疗事件的时间关系：首次抗生素剂量前45-225天（pre45-225）、首次抗生素剂量前0-30天（pre0-30）、抗生素治疗结束后0-30天（post0-30）或无任何抗生素治疗>90天且年龄>540天（post>90）。后者代表微生物组组成相对稳定的年龄范围（post>90）。
从问卷和症状日记中提取数据
关于分娩方式的信息按参与者报告使用。问卷包含关于母乳喂养持续时间（"任何母乳喂养"、"主要是母乳喂养"和"纯母乳喂养"）的三个项目，以月为单位。为了将三个项目组合成一个指标，首先对它们的值使用均方根方法进行单独缩放，以协调不同的值范围。从中计算平均值，使所有项目对数据的贡献相等。最后，计算z分数，报告为组合母乳喂养值（bf.z-score）。
父母被要求在症状日记的自由文本栏中报告药物。报告了活性成分或商品名。我们提取了抗生素药物的数据，并将其分类为氨基青霉素、头孢菌素和"其他"。定义每天接受抗生素治疗的间隔为抗生素治疗事件。
16S rRNA基因测序
在RNAsepar（Biosepar，Simbach，德国）中的样本由父母通过邮政寄送到位于布伦瑞克（德国）的亥姆霍兹感染研究中心，在那里分装并在-80°C下储存直至进一步分析。使用DNA提取试剂盒（ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA Kit，Zymo Research，Irvine，CA，US）从样本中提取DNA。随后，使用针对515F-806R区域的引物扩增16S rRNA基因的V4区域。引物包含Illumina适配器、垫和连接序列，反向引物还包含Golay条形码。使用Illumina MiSeq仪器上的v2（2×250 bp）化学对扩增子进行测序。
数据分析
使用R Studio与R版本4.2.2分析数据。使用epitools包（版本0.5-10.1）计算相对风险。使用phyloseq版本1.40.0分析微生物组数据。将数据稀释至每样本15,000次读取。将少于五个足够质量样本的儿童数据从进一步分析中排除。使用vegan包（版本2.6-2）计算Shannon多样性和Bray–Curtis差异（BC）。通过取样本与所有年龄在较年轻或较年长45天范围内的从未治疗对照组样本之间的算术平均值，计算每个样本与年龄匹配的从未治疗对照组的平均BC（BC±45）。使用adonis2函数计算置换方差分析，同样使用vegan包（版本2.6-2）。使用pheatmaps包（版本1.0.12）制作热图。
使用受限对数似然方法的线性混合效应模型（nlme包版本3.1-153的lme函数）分析Shannon多样性和BC±45。将年龄作为固定因子包括在内，使用5次多项式，将参与者ID作为随机因子。我们报告β系数，描述Shannon多样性或BC±45的绝对值的估计差异。使用NBZIMM 1.0包拟合零膨胀负二项混合模型，考虑到微生物组测序数据由于低于检测限丰度和原始栖息地（即肠道）中分类群的绝对物理缺失的组合而零膨胀的事实。
对于Shannon指数和BC±45，将年龄包括为固定效应，使用5次多项式，将参与者ID包括为随机因子。在非收敛模型中，使用年龄的4次多项式。我们报告这些模型的指数变换β系数（eβ），描述分类群丰度的估计倍数变化。对于图4和补充图2中的插图，通过log10(计数+1)变换丰度。使用错误发现率（fdr-）调整校正多个分类群的比较（在padj中指示调整值）。对于图5，使用stats包（版本4.2.2）拟合Loess模型。为了定义低vs高丰度的微生物组子集（对于图7和补充图3），从图4（拟杆菌属和布劳特菌属）和补充图2（普雷沃氏菌属）中描述的模型中提取随机效应残差。
这些代表了一个参与研究的儿童中分类群通常与整体模型拟合的差异程度，即在整个年龄范围内并考虑个体样本的分组因素。将具有给定分类群低于中位数残差的儿童分组到低丰度子集中，而具有高于中位数残差的儿童分组到高丰度子集中。
使用performance包（版本0.9.2）的r2_nakagawa命令为所有模型计算边际和条件R2值。在某些情况下，由于无值组，无法估计边际和条件R2，这些情况下未提供信息（补充表7）。使用nlme包（版本3.1-153）计算所有模型的置信区间。
伦理批准和同意参与：马丁·路德·哈勒-维滕贝格大学（编号2016-04）、汉诺威医学院（编号6794）和慕尼黑路德维希·马克西米利安大学（编号445-15）的伦理委员会批准了该研究。父母获得了关于队列研究目标的详细信息，并提供了书面知情同意。
【全文结束】