摘要
线粒体DNA(mtDNA)驱动的先天免疫信号传导在阿尔茨海默病(AD)等神经系统疾病中维持慢性神经炎症，但这一通路在小胶质细胞中的调控机制尚不清楚。本研究中，我们确定组蛋白乙酰转移酶KAT7(HBO1)是一个核心表观遗传调节因子，将染色质重塑与线粒体免疫激活联系起来。在5×FAD小鼠和人类AD脑组织的小胶质细胞中，KAT7及其组蛋白标记H3K14ac水平升高。整合转录组学和表观基因组学分析显示，KAT7激活Cmpk2的转录，这是一种对mtDNA合成至关重要的线粒体激酶。KAT7的缺失降低了Cmpk2的表达，损害了mtDNA复制和释放，从而抑制了cGAS-STING和NLRP3信号传导。重要的是，小胶质细胞特异性删除KAT7和KAT7的药理学抑制都能减轻细胞质mtDNA诱导的神经炎症，减少淀粉样β蛋白负担，恢复突触可塑性，并改善5×FAD小鼠的认知功能。综上，这些发现揭示了一个维持小胶质细胞致病性的表观遗传-线粒体轴，并确立KAT7作为AD的一个有希望的治疗靶点。
引言
阿尔茨海默病(AD)是痴呆症最常见的病因，影响全球数千万人，并带来日益增长的社会和经济负担。它在神经病理学上以细胞外淀粉样β(Aβ)斑块和过度磷酸化tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结为特征。然而，数十年来针对这些标志性蛋白的研究仅取得了有限的临床效益，表明AD发病机制中存在其他机制。越来越多的证据表明，慢性神经炎症是AD的核心疾病机制。全基因组关联研究已将许多AD风险位点与小胶质细胞通路联系起来，突显了作为脑内免疫细胞的小胶质细胞在AD中的关键作用。虽然小胶质细胞最初通过清除错误折叠蛋白来保护大脑，但其慢性激活会驱动它们转变为促炎状态，表现为过度细胞因子产生和稳态功能丧失。这种适应不良状态助长了炎症和神经退行性变的自我延续循环。
线粒体功能障碍越来越被认为是慢性小胶质细胞炎症的关键驱动因素。在衰老和AD大脑中，小胶质细胞表现出细胞质中线粒体DNA(mtDNA)水平升高，它作为一种强大的损伤相关分子模式发挥作用。细胞质mtDNA被环状GMP-AMP合成酶(cGAS)感知，cGAS产生第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)来激活STING(干扰素基因刺激物)。该通路的激活促进TBK1(TANK结合激酶1)和IRF3(干扰素调节因子3)的磷酸化，导致I型干扰素诱导和促炎细胞因子的释放。小胶质细胞中持续的cGAS-STING激活维持了一种适应不良的炎症状态，推动AD进展。值得注意的是，该信号通路的基因或药理学抑制减轻了小胶质细胞激活并缓解了AD相关病理，凸显了其致病作用。然而，调控小胶质细胞中这种由细胞质mtDNA引发的炎症级联反应的上游机制在很大程度上仍不清楚。
表观遗传调控为基因表达提供了关键的控制层，使短暂刺激能够转化为持久的转录程序。在这些机制中，组蛋白乙酰化发挥着关键作用：组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化通常放松染色质结构并促进转录。这使组蛋白乙酰转移酶(HATs)，也称为赖氨酸乙酰转移酶(KATs)，处于转录重编程的核心；然而，它们对小胶质细胞炎症和AD发病机制的贡献仍知之甚少。通过基因表达谱分析，我们确定KAT7(也称为HBO1)，是HATs MYST家族的成员，是神经炎症的关键表观遗传调节因子。通过将组蛋白乙酰化与小胶质细胞中线粒体DNA合成和cGAS-STING激活联系起来，我们的工作揭示了一种先前未被认识的驱动慢性神经炎症的表观遗传机制，并强调KAT7是AD的一个有希望的治疗靶点。
结果
5×FAD小鼠模型和人类AD脑组织中小胶质细胞KAT7复合物的表达上调
为确定组蛋白乙酰化表观遗传调节因子在小胶质细胞激活过程中是否发生改变，我们分析了小鼠原代小胶质细胞的公共RNA-seq数据，发现编码KAT7复合物支架亚基的Jade2在脂多糖(LPS)刺激下被选择性上调。我们接着对LPS处理的BV2细胞(一种小鼠小胶质细胞衍生细胞系)进行了RNA-seq，也观察到LPS处理后Jade2表达增加，而其他HAT复合物的表达基本保持不变。这些发现通过qPCR和蛋白质印迹分析得到了进一步验证。鉴于神经炎症是AD的标志，我们检查了在此背景下KAT7复合物的表达和活性是否也升高。为此，我们使用CD11b微珠从6个月大的5×FAD小鼠(一种携带五种家族性AD突变的特征明确的AD模型)中分离出小胶质细胞。qPCR分析显示，与年龄匹配的野生型(WT)对照组相比，5×FAD小鼠小胶质细胞中Kat7及其两个支架亚基Jade2和Brpf2的表达增加。RNAscope分析进一步显示Kat7和Jade2在小胶质细胞中特异性上调，而在神经元或星形胶质细胞中未上调。为将这些发现扩展到人类，我们分析了来自AD患者和健康对照者的死后上额回组织的公共RNA-seq数据集(GSE125050)。虽然KAT7及其其他亚基的表达未改变，但支架JADE2和BRPF3在AD患者的小胶质细胞中上调。由于KAT7复合物蛋白的合适抗体不可用，我们利用KAT7是细胞中H3K14乙酰化(H3K14ac)的主要酶这一事实，对脑切片进行抗H3K14ac抗体免疫染色。一致地，与WT对照相比，5×FAD小鼠中小胶质细胞H3K14ac水平显著升高，而在神经元或星形胶质细胞中未观察到变化。重要的是，与健康对照相比，死后人类AD脑组织中小胶质细胞的H3K14ac信号也显著增强。总之，这些结果表明KAT7复合物及其组蛋白乙酰化标记的上调伴随着小胶质细胞激活，暗示KAT7参与神经炎症和AD发病机制。
KAT7调控小胶质细胞中LPS和Aβ诱导的炎症反应
为研究KAT7在神经炎症中的作用，我们使用CRIPSR-Cas9技术生成了Kat7敲除(KO)BV2小胶质细胞，并采用LPS刺激作为炎症激活的成熟模型。Kat7缺失显著降低了LPS诱导的iNOS表达和促炎细胞因子IL-6的分泌。相反，野生型KAT7的过表达增强了IL-6的产生，而催化失活突变体(KAT7-E508Q)则无法做到这一点，表明KAT7的酶活性对其促炎功能是必需的。我们接着研究了支架亚基JADE2在神经炎症中的作用。JADE2的过表达增加了KAT7蛋白水平，表明JADE2稳定了KAT7复合物。此外，JADE2以依赖于其与KAT7相互作用的方式促进促炎因子的表达。为在原代细胞中验证这些发现，我们培养了新生小鼠的小胶质细胞，并用Kat7特异性siRNA转染它们。同样，Kat7敲低显著减弱了LPS诱导的IL-6产生。类似地，使用WM-3835(一种有效的KAT7小分子抑制剂)对KAT7进行药理学抑制，以剂量依赖方式抑制了LPS诱导的Nos2和Il6表达。除了LPS外，我们还进一步询问KAT7是否调控由聚集的Aβ驱动的炎症。用寡聚Aβ42处理原代小鼠小胶质细胞强烈诱导了促炎细胞因子IL-6和IL-1β的产生，而WM-3835显著减弱了这一效应，支持KAT7在介导Aβ诱导的炎症反应中的作用。这些结果确立KAT7是小胶质细胞对LPS和聚集Aβ炎症反应的关键驱动因子。
整合转录组和表观基因组分析揭示CMPK2是KAT7的关键转录靶点
为阐明KAT7调控神经炎症的分子机制，我们进行了RNA-seq，分析WT和Kat7 KO BV2细胞在LPS处理前后的转录组变化。使用调整后的p值<0.05和|log2倍数变化|>1作为阈值，我们确定了WT细胞中LPS刺激响应上调的1,074个基因。Kat7的缺失减弱了其中110个基因的诱导。基因本体论(GO)分析显示，这些KAT7依赖性基因在与干扰素信号传导和炎症反应相关的通路中显著富集。相比之下，在WT细胞中被LPS下调的276个基因中，只有5个被Kat7缺失逆转，表明KAT7对LPS诱导的转录抑制影响最小。鉴于KAT7主要负责H3K14乙酰化(一种与转录激活相关的组蛋白标记)，我们接着进行了CUT&Tag(靶向切割和标签化)分析，以绘制全基因组H3K14ac分布。基因组分布分析显示，大多数差异H3K14ac峰位于启动子区域：WT_LPS与WT细胞之间为38%(6,121个峰)，KO_LPS与WT_LPS细胞之间为40%(5,776个峰)。在LPS刺激后WT细胞启动子区域H3K14ac富集增加的基因中，有244个在Kat7 KO细胞中乙酰化减少。RNA-seq和CUT&Tag数据集的整合分析确定了17个基因作为LPS刺激下KAT7的潜在直接转录靶点。有限的重叠可能反映了应用的严格阈值。使用KAT7和H3K14ac抗体(以H3K23ac抗体作为阴性对照)进行qPCR和定量染色质免疫沉淀(qChIP)验证确认了分析结果。值得注意的是，在KAT7调控的基因中，Cmpk2(胞苷/尿苷单磷酸激酶2)是LPS刺激下Kat7* KO细胞中抑制最显著的基因之一，突显其作为关键下游靶点的地位。重要的是，Cmpk2也被寡聚Aβ42在原代小鼠小胶质细胞中强烈诱导，而Kat7敲低显著减弱了这种诱导。总之，这些发现确定Cmpk2是KAT7的直接转录靶点，并表明它在小胶质细胞对LPS和Aβ刺激的炎症反应中充当共享的下游效应因子。
KAT7通过CMPK2依赖性mtDNA合成驱动小胶质细胞先天免疫信号传导
CMPK2编码一种线粒体核苷酸单磷酸激酶，作为关键的限速酶，确保dNTP前体的可用性，并在巨噬细胞激活期间驱动线粒体DNA(mtDNA)合成的显著上调。CMPK2依赖性mtDNA合成促进了mtDNA向细胞质的释放，随后激活cGAS-STING信号通路和NLRP3炎症小体。鉴于KAT7调控小胶质细胞激活过程中的Cmpk2表达，我们测试了它是否调节mtDNA复制、释放和下游先天免疫反应。我们首先进行了5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)标记，它优先掺入新合成的mtDNA，在非增殖原代小鼠小胶质细胞中呈现为明亮的细胞质点状。Kat7敲低损害了LPS诱导的mtDNA复制，这种效应被野生型CMPK2挽救，但催化失活的CMPK2突变体(CMPK2-D330A)未能做到这一点，表明KAT7促进LPS响应的CMPK2依赖性mtDNA合成。为评估mtDNA释放，我们用LPS启动小胶质细胞，然后用ATP处理，这是一种诱导线粒体应激并触发先天免疫的常用方法。使用针对线粒体D-loop区域的特异性引物对细胞质部分进行qPCR分析，显示对照小胶质细胞中mtDNA水平升高，表明从受损线粒体中释放增加。值得注意的是，Kat7敲低降低了细胞质mtDNA水平。一致地，它导致TBK1(Ser172, p-TBK1)和IRF3(Ser396, p-IRF3)磷酸化减少，以及IL-1β产生减少，表明cGAS-STING激活和NLRP3炎症小体信号传导减弱。重要的是，CMPK2过表达在Kat7缺陷细胞中恢复了细胞质mtDNA水平和先天免疫信号传导，而催化失活突变体则未能做到这一点。总之，这些结果表明KAT7协调CMPK2依赖性mtDNA合成和释放，确立其作为小胶质细胞激活过程中先天免疫通路的关键表观遗传调节因子。
小胶质细胞特异性Kat7缺失减轻5×FAD小鼠的神经炎症、减少Aβ病理并改善认知功能
鉴于我们在AD中观察到小胶质细胞KAT7复合物表达升高，以及它在体外调控神经炎症中的关键作用，我们假设KAT7通过驱动细胞质mtDNA诱导的先天免疫信号传导促进AD发病机制。为验证这一点，我们使用高效的单链DNA插入CRISPR(Easi-CRISPR)方法生成了Kat7条件性敲除小鼠。Kat7的外显子2两侧由loxP位点包围，其缺失导致移码突变，从而实现功能性敲除。这些小鼠与Cx3cr1-CreER小鼠杂交，以实现小胶质细胞特异性敲除(Kat7 cKO)，随后与5×FAD小鼠育种。在2月龄时给予他莫昔芬，以避免干扰小胶质细胞发育，并在6月龄时进行生化、病理和行为评估。从小胶质细胞中分离出的Kat7 cKO小鼠显示出Kat7的有效敲除。值得注意的是，在5×FAD小胶质细胞中显著上调的Cmpk2，被Kat7缺失降低。鉴于KAT7在mtDNA合成和释放中的作用，我们通过qPCR分析评估了细胞质mtDNA水平，发现它们在5×FAD小胶质细胞中升高，但在Kat7 cKO; 5×FAD小鼠中显著减弱。相应地，作为cGAS-STING通路关键介质的TBK1和IRF3的磷酸化在Kat7缺陷小胶质细胞中显著降低，促炎细胞因子IL-1β和IL-6的水平也降低。进一步分析显示，在Kat7 cKO; 5×FAD小鼠中，小胶质细胞激活受到抑制，这由海马中Iba1阳性小胶质细胞数量减少和Iba1及磷酸化p65(p-p65)蛋白水平降低所证明，p-p65是cGAS-STING信号下游的关键NF-κB效应物。这些结果表明小胶质细胞Kat7缺失抑制了5×FAD小鼠的神经炎症。
越来越多的证据表明，小胶质细胞驱动的神经炎症促进Aβ沉积并破坏突触活动，最终导致认知能力下降。为确定Kat7缺失是否减轻Aβ病理，我们对6月龄5×FAD小鼠的脑切片进行了硫黄素S(TS)染色。小胶质细胞特异性Kat7 cKO小鼠在多个脑区(包括皮层和海马)表现出Aβ斑块负担的显著降低。为评估突触可塑性，我们进行了场电位记录，测量急性海马切片中Schaffer侧支-CA1突触的长时程增强(LTP)。5×FAD小鼠特征性的LTP缺陷通过小胶质细胞Kat7缺失得到显著改善。我们接着使用Morris水迷宫评估海马依赖的空间学习和记忆。与突触功能恢复一致，Kat7 cKO; 5×FAD小鼠在训练期间表现出加速学习，并在探测试验中表现出更好的记忆保留，在目标象限中花费更多时间，并更频繁地穿越原平台位置，与5×FAD对照组相比。值得注意的是，各组之间的游泳速度相当，排除了运动缺陷作为混杂因素。总之，这些结果表明小胶质细胞Kat7缺失减少了Aβ积累，恢复了突触功能，并改善了5×FAD小鼠的认知表现。
KAT7的药理学抑制减轻5×FAD小鼠的神经炎症、减少Aβ负担并改善认知功能
为确定KAT7的药理学抑制是否能提供对AD的保护，我们首先检查了KAT7抑制剂WM-3835在用寡聚Aβ42处理的原代小鼠小胶质细胞中的作用。与我们的敲低结果一致，WM-3835处理抑制了Aβ诱导的Cmpk2上调，并显著降低了CMPK2依赖性mtDNA合成。在评估KAT7抑制的体内作用之前，我们检查了Kat7缺失是否影响大脑功能，考虑到其在神经元中的表达及其在神经干细胞分化和皮层发育中的重要作用。我们使用CamKII-Cre生成了兴奋性神经元特异性Kat7 cKO小鼠，该方法在2-3周龄时开始诱导缺失。与胚胎期Kat7缺失小鼠不同，这些cKO小鼠健康、有活力且可育。对急性切片中海马CA1锥体神经元的电生理记录显示，微型兴奋性突触后电流(mEPSC)幅度和频率正常，Schaffer侧支-CA1突触的LTP也完整，表明突触传递和可塑性得以保留。这些结果表明，在成熟神经元中KAT7缺失是可耐受的。然后，我们在体内评估了WM-3835的治疗潜力。5月龄5×FAD小鼠通过渗透泵接受WM-3835的脑室内(ICV)输注，持续四周。治疗后分析证实了强大的靶点参与，表现为全脑H3K14ac水平显著降低。值得注意的是，WM-3835显著减少了小胶质细胞增生，降低了细胞质mtDNA水平，并减弱了小胶质细胞中cGAS-STING通路的激活。与这些效应一致，WM-3835治疗还显著减少了海马和皮层中的Aβ斑块负担。在行为上，接受WM-3835治疗的5×FAD小鼠在Morris水迷宫中表现出改善的空间学习和记忆，训练期间习得更快，在探测试验中表现更佳。这些认知益处与小胶质细胞特异性Kat7 cKO小鼠中观察到的非常相似。总之，我们的结果表明KAT7的药理学抑制减轻了小胶质细胞激活，减少了Aβ病理，并改善了5×FAD小鼠的认知功能，为WM-3835作为AD潜在治疗策略提供了临床前证据。
讨论
细胞质mtDNA作为一种强大的驱动因素，通过激活先天免疫信号传导引发神经炎症。本文中，我们将组蛋白乙酰转移酶KAT7确定为小胶质细胞中这种mtDNA引发的炎症级联反应的关键上游调节因子。在机制上，KAT7在小胶质细胞激活期间促进Cmpk2启动子上的H3K14乙酰化，从而增强Cmpk2表达，增加mtDNA合成和释放，并推动下游炎症反应。多条证据表明该通路在AD中活跃。首先，KAT7复合物及其组蛋白标记H3K14ac在5×FAD小鼠和人类AD脑组织的小胶质细胞中升高。其次，Aβ寡聚体诱导原代小胶质细胞中的Cmpk2表达和mtDNA复制，这一过程部分依赖于KAT7的表达或活性。第三，5×FAD小鼠小胶质细胞中Cmpk2表达和细胞质mtDNA水平升高，这两者在Kat7缺失后均降低。最后，小胶质细胞特异性Kat7缺失和药理学抑制都抑制了先天免疫信号传导和神经炎症，导致5×FAD小鼠中Aβ负担减少和认知功能改善。因此，我们的发现揭示了一种表观遗传-线粒体轴，该轴在机制上将Aβ沉积与慢性免疫激活联系起来。破坏这种自我延续的循环为AD及相关神经退行性疾病提供了一种潜在的治疗策略。
小胶质细胞激活需要广泛的代谢重编程，以满足增加的生物能量和生物合成需求。KAT7介导的CMPK2上调(一种mtDNA复制的关键酶)可能有助于满足这些需求。然而，虽然对维持小胶质细胞激活至关重要，但过度的mtDNA复制使线粒体容易受到应激诱导的mtDNA释放，从而放大先天免疫信号。值得注意的是，类似的CMPK2-mtDNA通路在炎症期间驱动巨噬细胞中的cGAS-STING和NLRP3激活，突显了其在髓系谱系先天免疫中的保守作用。未来研究将需要直接定义CMPK2及其下游mtDNA复制在神经炎症和AD中的作用。值得注意的是，最近的一项研究表明，CMPK2在缺血性中风期间的小胶质细胞中也上调，促进神经炎症和脑损伤。因此，KAT7-CMPK2通路可能代表了一种通用机制，小胶质细胞通过该机制将代谢重编程与不同慢性炎症条件下的先天免疫激活联系起来。
神经元中的组蛋白乙酰化长期以来与学习和记忆相关，AD小鼠模型和患者中已报道了几种改变的组蛋白乙酰化标记。然而，单个组蛋白修饰在AD中的功能相关性仍不明确。本文中，我们显示KAT7依赖的H3K14ac在WT小鼠和健康对照的小胶质细胞中较低，但在AD脑组织中显著且特异性升高。功能研究进一步揭示了KAT7在5×FAD小鼠中的小胶质细胞特异性致病作用。这些发现强调了以细胞类型特异性方式检查组蛋白乙酰化和其他表观遗传修饰的重要性。值得注意的是，KAT7还涉及衰老和细胞衰老，它通过增强细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p15INK4b的转录来促进细胞周期停滞。在老年小鼠中下调Kat7可减少肝细胞衰老，缓解肝脏炎症，并延长寿命。鉴于其在AD和衰老环境中的有益作用，KAT7抑制可能代表一种有希望的策略，以减轻神经退行性变并促进全生命周期的大脑弹性。
我们的数据确立CMPK2为KAT7的关键靶点，但其他下游基因(包括几种干扰素响应基因)也可能有助于慢性神经炎症。虽然KAT7最著名的是催化H3K14ac，但它还介导其他组蛋白酰化，如丙酰化和巴豆酰化，并可以修饰替代组蛋白位点和非组蛋白底物。这些活性可能进一步多样化其调节功能，并塑造激活小胶质细胞的转录景观。无论如何，KAT7的药理学抑制有望抑制所有这些活性，提供一种统一策略来削弱其在AD中的促炎作用。虽然本研究中使用的5×FAD模型再现了强大的Aβ病理，但它不发展tau病理(人类AD的定义特征)。因此，未来使用tau蛋白病或混合病理模型的研究对于充分阐明KAT7在AD发病机制中的作用将是必不可少的。尽管如此，我们的发现确定了KAT7-CMPK2轴作为小胶质细胞线粒体免疫的关键调节因子，将表观遗传控制与神经炎症和AD进展联系起来。这些见解突显了表观遗传-线粒体轴不仅对AD，而且对其他以慢性神经炎症为特征的神经系统疾病来说都是一个有希望的治疗靶点。
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