摘要
高脂饮食（HFD）诱导的高脂血症是一种实验性代谢紊乱，其特征主要是血清脂质水平失调和肝脏脂质积累，伴有氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和心血管系统改变。本研究比较了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）功能化硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）与游离EGCG、亚硒酸钠（Na₂SeO₃）和Lipanthyl对HFD诱导的代谢和肝脏损伤的治疗效果。通过动态光散射、Zeta电位分析、透射电子显微镜、X射线衍射和紫外-可见分光光度法对EGCG-SeNPs进行了表征。将42只成年雄性大鼠分为6组：对照组、HFD组、HFD/Lipanthyl组、HFD/EGCG组、HFD/Na₂SeO₃组和HFD/EGCG-SeNPs组。高脂饮食诱导了明显的血脂异常、肝酶升高、心脏损伤生物标志物增加、脂质过氧化和亚硝化应激增强、抗氧化防御系统耗竭，以及Kelch样ECH相关蛋白1/核因子E2相关因子2（Keap1/Nrf2）调控轴的破坏。HFD还增加了核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平，同时改变了线粒体凋亡标志物，包括B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、细胞色素c和caspase-3。在转录水平上，HFD增加了促脂基因表达，减少了与脂肪酸氧化、代谢调控和线粒体稳态相关基因的表达。与其他测试干预措施相比，EGCG-SeNPs显示出最显著的整体改善效果，表现为改善的血脂谱、肝-心脏损伤生物标志物、抗氧化状态、炎症标志物、凋亡标志物、肝脏结构和Nrf2免疫反应性。总体而言，EGCG-SeNPs可能通过协调调节脂质代谢、氧化还原平衡、炎症和线粒体稳态来减轻HFD诱导的肝脂毒性和相关心脏压力。
1. 引言
高脂饮食诱导的高脂血症是一种普遍的代谢紊乱，其特征是血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇异常升高，同时高密度脂蛋白胆固醇减少。长期摄入富含饱和脂肪的饮食会通过增强肝脏脂质生成、损害脂质清除和促进脂肪组织功能障碍来破坏脂质稳态。这些改变导致代谢器官（特别是肝脏和血管系统）中脂质过度沉积，从而增加患代谢综合征和心血管疾病的风险。因此，高脂饮食诱导的高脂血症代表了一个具有重要临床和社会经济意义的全球性健康挑战（图1）。
高脂血症的病理后果远远超出血脂异常本身，包括动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪肝病和胰岛素抵抗。流行病学证据一致表明，高脂血症与心血管发病率和死亡率增加密切相关，特别是在暴露于不健康饮食模式和久坐生活方式的人群中。在分子水平上，高脂血症与氧化应激增强和慢性低度炎症密切相关。过量循环脂质刺激活性氧过度产生并激活促炎信号级联反应，导致炎症细胞因子和应激相关生物标志物水平升高，进一步加剧组织损伤和代谢功能障碍。
近年来，天然产物因其多方面的生物活性和良好的安全性而受到广泛关注，成为管理高脂血症的补充或替代治疗剂。许多植物化学物质通过调节脂质代谢、增强抗氧化防御和抑制炎症反应来发挥降脂作用。其中，绿茶因其促进健康的特性而广为人知，这主要归功于其高含量的多酚类儿茶素。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶中最丰富和生物活性最强的儿茶素，其化学结构富含羟基，赋予其强大的抗氧化能力。EGCG已被报道通过抑制肠道脂质吸收、抑制肝脏脂质合成以及减轻氧化应激和炎症来减轻高脂血症。
硒是一种必需微量元素，在通过掺入硒蛋白维持氧化还原平衡和调节脂质代谢方面发挥关键作用。这些硒蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶，可保护细胞成分免受氧化损伤和脂质过氧化。硒缺乏与血脂异常、氧化应激增强和炎症反应有关，而适当的硒补充已显示出对血脂谱和炎症介质的有益影响。因此，硒代表了一种具有预防和管理高脂血症潜在治疗相关性的关键微量营养素。
纳米技术的最新进展导致了硒纳米粒子（SeNPs）的开发，作为一种改善硒生物利用度和减少其毒性的创新方法。与传统硒形式相比，SeNPs表现出优越的抗氧化活性、增强的细胞摄取和改善的安全性。实验研究表明，SeNPs能有效调节脂质代谢、抑制氧化应激并在高脂血症条件下减轻炎症信号通路。此外，使用天然多酚生物合成SeNPs可能提供协同效应，进一步增强其对高脂饮食诱导的代谢紊乱的保护功效。
非诺贝特（Lipanthyl）是一种广泛使用的降脂药物，主要通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-α发挥治疗作用，从而增强脂肪酸氧化并降低甘油三酯水平。尽管具有临床效用，但非诺贝特治疗与几种限制相关，包括肝毒性、肾功能障碍以及有限的抗氧化和抗炎作用。因此，有必要探索补充性多靶点策略，这些策略不仅能改善脂质代谢，还能同时调节HFD诱导的肝脏损伤相关的氧化应激、炎症信号和线粒体功能障碍。
本研究旨在评估EGCG功能化硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）在大鼠高脂饮食诱导的高脂血症和肝脏损伤模型中的治疗效果，并与游离EGCG、亚硒酸钠和Lipanthyl进行比较。该研究还通过评估EGCG-SeNPs恢复脂质稳态、减轻肝脏氧化应激和炎症、调节Keap1/Nrf2抗氧化信号、调控脂质生成和脂肪酸氧化相关基因表达、维持AMPK/SIRT1/PGC-1α/MFN2相关线粒体稳态以及抑制细胞色素c/caspase-3相关凋亡损伤的能力，阐明其潜在保护作用的分子机制。
2. 结果
2.1. EGCG负载硒纳米粒子的表征
通过动态光散射（DLS）分析确定了EGCG-SeNPs在悬浮液中的流体动力学直径和尺寸分布。结果显示Z平均粒径为55.2 nm，单一主要峰位于56.8 nm，占100%强度（图2A）。
通过Zeta电位分析评估了纳米粒子的表面电荷和胶体稳定性。EGCG-SeNPs表现出强负Zeta电位-63.4 mV，标准偏差为6.76 mV。这种高负表面电荷表明粒子间存在强烈的静电排斥，有助于优异的分散稳定性和抗聚集性（图2B）。
通过透射电子显微镜（TEM）表征了表没食子儿茶素没食子酸酯功能化硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）的形态和尺寸。TEM显微照片显示合成的EGCG-SeNPs主要呈球形，尺寸分布相对均匀。纳米粒子看起来分散良好，聚集最少，表明EGCG提供了有效的稳定作用。根据TEM图像，估计粒子尺寸在纳米范围内，与纳米级硒粒子一致（图2C）。
EGCG-SeNPs的X射线衍射分析显示出明显的衍射特征，表明EGCG相关硒纳米粒子配方中存在结构化组织区域。观察到的衍射曲线支持合成后纳米粒子的结构修饰成功，并表明EGCG有助于硒基纳米系统的组织和稳定（图2D）。
对EGCG-SeNPs的UV-Vis光谱在基线和每月随访期间进行了记录，显示在调查期间保持了特征性吸收谱。新鲜EGCG-SeNPs在约207 nm和283 nm处表现出显著的吸收特征。在储存过程中，主要吸收最大值仅出现轻微、逐渐的偏移，从新鲜配制配方中的207 nm变为5个月后储存的203 nm，而第二个特征带几乎保持不变，仅从283 nm轻微偏移到282 nm。尽管随着时间推移观察到吸光度强度逐渐降低，但未检测到特征峰的重大位移或新光谱带的出现（图2E）。
2.2. 脂质谱研究
如图3所示，HFD喂养显著改变了血清脂质谱。与对照组相比，总胆固醇从70.41±1.98增加到153.40±4.19，甘油三酯从63.41±1.46增加到131.20±3.31，LDL-C从20.27±0.47增加到45.83±1.12，增幅分别为117.87%、106.90%和126.06%。相比之下，HDL-C从63.22±1.58降至33.39±1.56，相对于对照组减少了47.19%。
与HFD组相比，Lipanthyl给药使总胆固醇、甘油三酯和LDL-C分别降低15.34%、46.85%和45.55%，而HDL-C增加了56.11%。EGCG治疗使总胆固醇、甘油三酯和LDL-C分别降低48.10%、38.11%和50.81%，与HFD相比HDL-C增加78.99%。与Lipanthyl组相比，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）使总胆固醇和LDL-C额外降低了38.70%和9.64%，HDL-C水平高14.66%；然而，甘油三酯数值高于Lipanthyl组（p<0.05）。
亚硒酸钠治疗使总胆固醇、甘油三酯和LDL-C分别降低33.86%、25.60%和37.13%，与HFD相比HDL-C增加76.74%。与Lipanthyl相比，亚硒酸钠总胆固醇降低21.88%，HDL-C高13.21%，而甘油三酯和LDL-C数值略高于Lipanthyl组。EGCG-SeNP组与HFD相比，总胆固醇、甘油三酯和LDL-C的降幅最大，分别为54.01%、51.60%和54.68%，同时HDL-C增加了83.39%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs使总胆固醇、甘油三酯和LDL-C分别降低45.68%、8.94%和16.76%，HDL-C增加17.47%。
2.3. 肝酶测试
如图4所示，与对照组相比，HFD喂养增加了血清肝酶活性。ALT从21.14±1.26增加到46.53±2.97，AST从20.02±0.82增加到52.93±2.34，ALP从46.27±2.54增加到92.18±1.70，增幅分别为120.14%、164.45%和99.22%。
与HFD相比，Lipanthyl使ALT、AST和ALP分别降低34.57%、30.37%和39.00%。EGCG与HFD相比使ALT、AST和ALP分别降低49.59%、45.52%和41.10%。与Lipanthyl相比，EGCG的ALT和AST值分别低22.96%和21.75%，而ALP数值低3.44%（p<0.05）。
亚硒酸钠与HFD相比使ALT、AST和ALP分别降低38.20%、40.02%和36.32%。与Lipanthyl相比，亚硒酸钠的AST值低13.86%，而ALT和ALP接近或略高于Lipanthyl组。EGCG-SeNPs与HFD相比使ALT、AST和ALP分别降低56.01%、57.68%和47.82%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs使ALT、AST和ALP分别降低32.77%、39.22%和14.45%。
2.4. 心脏酶：CK-MB和肌钙蛋白（cTnI）
如图5所示，与对照组相比，HFD喂养使血清CK-MB从50.61±4.99增加到106.90±2.51，cTnI从5.30±0.12增加到13.14±0.35，增幅分别为111.24%和147.81%。
与HFD相比，Lipanthyl使CK-MB数值降低2.79%，cTnI降低31.19%。EGCG与HFD相比使CK-MB和cTnI分别降低37.83%和52.40%。与Lipanthyl相比，EGCG的CK-MB和cTnI值分别低36.04%和30.83%（p<0.05）。
亚硒酸钠与HFD相比使CK-MB和cTnI分别降低27.61%和42.07%。与Lipanthyl相比，亚硒酸钠的CK-MB和cTnI值分别低25.54%和15.81%。EGCG-SeNPs与HFD相比使CK-MB和cTnI分别降低41.63%和59.57%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的CK-MB和cTnI值分别低39.96%和41.24%。
2.5. 氧化和抗氧化生物标志物研究
如图6所示，HFD喂养破坏了肝脏氧化还原相关生物标志物。与对照组相比，MDA从1.09±0.02增加到2.01±0.06，NO从12.94±0.21增加到24.70±0.65，增幅分别为84.25%和90.92%。相比之下，GSH从12.89±0.34减少到6.07±0.40，SOD从7.11±0.20减少到3.86±0.17，CAT从8.79±0.36减少到3.73±0.16，GPx从21.86±0.45减少到11.20±0.32，降幅分别为52.92%、45.74%、57.51%和48.76%（p<0.05）。
与HFD相比，Lipanthyl使MDA和NO分别降低13.82%和15.82%，同时GSH、SOD、CAT和GPx数值略有增加，增幅分别为0.92%、9.02%、10.61%和15.71%。EGCG与HFD相比使MDA和NO分别降低38.67%和42.23%，使GSH、SOD、CAT和GPx分别增加75.75%、65.73%、88.81%和66.29%。
亚硒酸钠与HFD相比使MDA和NO分别降低34.69%和41.93%，使GSH、SOD、CAT和GPx分别增加88.43%、58.32%、86.40%和77.50%。EGCG-SeNPs与HFD相比使MDA和NO分别降低47.42%和50.97%，使GSH、SOD、CAT和GPx分别增加94.60%、97.36%、104.18%和95.00%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的MDA和NO值分别低38.99%和41.75%，GSH、SOD、CAT和GPx值分别高92.82%、81.03%、84.60%和68.52%。
2.6. 肝脏Keap1/Nrf2抗氧化信号评估
如图7所示，与对照组相比，HFD喂养使Keap1从2.26±0.14增加到6.63±0.16，增幅为193.19%。相比之下，Nrf2从20.52±0.37减少到8.16±0.17，降幅为60.23%（p<0.05）。
与HFD相比，Lipanthyl使Keap1降低15.18%，Nrf2增加31.37%。EGCG与HFD相比使Keap1降低21.73%，Nrf2增加113.73%。亚硒酸钠与HFD相比使Keap1降低32.87%，Nrf2增加120.10%。EGCG-SeNPs与HFD相比使Keap1降低66.65%，Nrf2增加149.26%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的Keap1值低60.68%，Nrf2值高89.74%。
2.7. 炎症生物标志物研究
如图8所示，与对照组相比，HFD喂养增加了肝脏炎症标志物。NF-κB从13.04±0.43增加到35.36±0.51，TNF-α从12.82±0.37增加到33.72±0.89，IL-6从12.89±0.19增加到30.56±0.69，增幅分别为171.17%、163.01%和137.02%。
与HFD相比，Lipanthyl使NF-κB、TNF-α和IL-6分别降低10.18%、5.65%和32.30%。EGCG与HFD相比使NF-κB、TNF-α和IL-6分别降低41.06%、48.67%和49.76%。与Lipanthyl相比，EGCG的NF-κB、TNF-α和IL-6值分别低34.38%、45.60%和25.80%（p<0.05）。
亚硒酸钠与HFD相比使NF-κB、TNF-α和IL-6分别降低58.48%、21.84%和39.53%。EGCG-SeNPs与HFD相比使NF-κB、TNF-α和IL-6分别降低58.14%、58.03%和54.88%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs使NF-κB、TNF-α和IL-6分别降低53.40%、55.52%和33.36%。
2.8. 肝脏脂质生成和脂肪酸氧化调控
如图9所示，HFD喂养改变了肝脏脂质代谢相关基因的表达。FASN表达从1.24±0.08增加到4.10±0.09，SREBP-1c表达从0.55±0.03增加到1.26±0.03，增幅分别为229.95%和127.80%。相比之下，PPAR-α表达从2.50±0.05减少到1.09±0.05，与对照组相比降幅为56.56%（p<0.05）。
与HFD相比，Lipanthyl使FASN和SREBP-1c分别降低43.39%和12.84%，PPAR-α增加57.27%。EGCG与HFD相比使FASN和SREBP-1c分别降低63.74%和58.99%，PPAR-α增加112.80%。与Lipanthyl相比，EGCG的FASN和SREBP-1c值分别低35.95%和52.95%，PPAR-α值高35.30%。
亚硒酸钠与HFD相比使FASN和SREBP-1c分别降低35.40%和42.42%，PPAR-α增加55.43%。EGCG-SeNPs与HFD相比使FASN和SREBP-1c分别降低69.64%和57.05%，PPAR-α增加123.02%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的FASN和SREBP-1c值分别低46.38%和50.73%，PPAR-α值高41.80%。
2.9. 凋亡活性评估
如图10所示，与对照组相比，HFD喂养改变了肝脏凋亡标志物。Bcl-2从4.51±0.08减少到1.35±0.04，降幅为70.11%。细胞色素c从75.76±1.28增加到191.80±2.15，caspase-3从0.26±0.03增加到1.18±0.03，增幅分别为153.17%和359.40%。
与HFD相比，Lipanthyl使Bcl-2数值增加5.34%，细胞色素c和caspase-3分别降低12.84%和9.00%。EGCG与HFD相比使Bcl-2增加205.93%，细胞色素c和caspase-3分别降低41.45%和58.23%。与Lipanthyl相比，EGCG的Bcl-2值高190.42%，细胞色素c和caspase-3值分别低32.83%和54.10%（p<0.05）。
亚硒酸钠与HFD相比使Bcl-2增加134.12%，细胞色素c和caspase-3分别降低54.70%和47.20%。EGCG-SeNPs与HFD相比使Bcl-2增加226.56%，细胞色素c和caspase-3分别降低57.56%和71.14%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的Bcl-2值高210.00%，细胞色素c和caspase-3值分别低51.31%和68.28%。
2.10. 线粒体稳态相关基因表达评估
如图11所示，与对照组相比，HFD喂养降低了肝脏线粒体稳态相关基因的表达。AMPK表达从2.25±0.06减少到1.00±0.06，PGC-1α从7.24±0.10减少到2.82±0.08，MFN2从10.86±0.20减少到3.37±0.12，降幅分别为55.48%、61.09%和68.99%。
与HFD相比，Lipanthyl使AMPK、PGC-1α和MFN2分别增加41.40%、45.67%和16.39%。EGCG与HFD相比使AMPK、PGC-1α和MFN2分别增加80.60%、106.96%和132.36%。与Lipanthyl相比，EGCG的AMPK、PGC-1α和MFN2值分别高27.72%、42.08%和99.64%（p<0.05）。
亚硒酸钠与HFD相比使AMPK、PGC-1α和MFN2分别增加90.80%、109.94%和141.15%。EGCG-SeNPs与HFD相比使AMPK、PGC-1α和MFN2分别增加101.40%、142.68%和192.28%。与Lipanthyl相比，EGCG-SeNPs的AMPK、PGC-1α和MFN2值分别高42.43%、66.60%和151.12%。
2.11. 组织病理学分析
组织病理学检查显示治疗组肝脏损伤逐渐改善。对照组表现出正常的肝脏结构，其特征是完整的肝小叶，组织良好的肝细胞索，中心定位的细胞核带有明显的核仁，以及在肝窦中适当分布的库普弗细胞，符合健康的肝实质。高脂饮食（HFD）给药导致严重的肝脏病理，表现为肝细胞广泛水肿变性，伴有散在的凋亡小体，表明严重的氧化应激和细胞损伤。HFD/LPL联合治疗组显示出加重的病理，包括中央静脉充血明显、血管外炎症细胞浸润广泛、小叶间出血和小叶间炎症细胞大量积聚，反映了严重的炎症反应和微血管功能障碍。相比之下，药物干预显著减轻了肝脏损伤。HFD/EGCG组表现出中度改善，特征是出血灶减少和中央静脉充血得到控制。同样，HFD/Na₂SeO₃治疗产生了类似的保护效果，尽管中央静脉结构不规则和小叶间出血持续存在。值得注意的是，HFD/EGCG-SeNP联合治疗组表现出最显著的肝保护作用，肝结构几乎完全恢复，仅有轻微的小叶间出血和最少的炎症浸润（图12）。
这些发现表明表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和硒纳米粒子对HFD诱导的肝脏损伤具有协同肝保护机制，联合治疗在保持肝脏结构完整性和预防炎症-出血并发症方面表现出卓越的功效。
2.12. 免疫组织化学分析
肝脏Nrf2表达的免疫组织化学分析显示，抗氧化转录因子活化与肝保护在各治疗组之间存在显著相关性。对照组表现出明显的Nrf2免疫反应性，与健康肝组织中的基线抗氧化防御机制一致。高脂饮食显著抑制了Nrf2表达，HFD组显示出弱免疫反应，表明Nrf2依赖的抗氧化反应元件通路激活受损，对抗氧化应激的细胞防御能力受损。这种Nrf2信号减弱与HFD处理动物中观察到的严重肝细胞损伤、水肿变性和凋亡相关。HFD/LPL和HFD/Na₂SeO₃组表现出中等Nrf2免疫染色，表明抗氧化防御通路部分恢复，但仍低于对照组水平。值得注意的是，HFD/EGCG和HFD/EGCG-SeNP治疗组均表现出与对照组相当的显著Nrf2表达，表明Nrf2介导的抗氧化信号被强烈激活。HFD/EGCG和HFD/EGCG-SeNP组中显著的Nrf2表达与优越的肝保护和最少的炎症-出血病理直接相关，而HFD/LPL和HFD/Na₂SeO₃组中中等Nrf2活化对应于中等组织学改善（图13）。
这些发现表明，EGCG和硒纳米粒子，特别是联合使用时，能有效激活Nrf2/ARE抗氧化防御通路，从而通过增强细胞保护基因表达来改善HFD诱导的肝脏氧化应激和炎症。
3. 讨论
高脂饮食（HFD）诱导的高脂血症构成了一种多因素代谢损伤，其特征是全身性血脂异常、肝脂肪变性、氧化应激、慢性炎症和凋亡激活。在本研究中，HFD喂养显著增加了血清总胆固醇、甘油三酯和LDL-C，同时降低了HDL-C，这与肝脏脂质合成和脂肪酸分解代谢不平衡一致。在转录水平上，关键脂质生成基因——FASN和SREBP-1c——显著上调，而脂肪酸氧化的主要调控因子PPAR-α被抑制。这种基因表达模式反映了一种有利于脂质积累、受损β氧化和肝脏脂质清除减少的代谢转变，创造了一个易受氧化和炎症损伤的肝细胞环境（图14）。
血脂异常状态引发了严重的氧化应激。MDA和NO水平升高表明脂质过氧化和亚硝化应激增强，而内源性抗氧化剂GSH、SOD和CAT的减少反映了肝细胞防御系统的耗竭。活性氧的过度产生机制上与脂肪酸超负荷和线粒体电子传递链功能障碍相关，这些共同导致对脂质、蛋白质和DNA的过氧化损伤。这种氧化失衡不仅损害细胞成分，还放大了氧化还原敏感转录因子如NF-κB的激活，从而促进促炎基因表达并建立氧化应激和炎症之间的前馈循环（图14）。
HFD引起的氧化失衡通过破坏Keap1/Nrf2抗氧化调控轴得到了进一步证实。Keap1水平升高，同时Nrf2减少，表明在持续脂质来源的氧化应激下内源性细胞保护反应的动员受损。这种改变与观察到的MDA和NO积累以及GSH、SOD、CAT和GPx活性的耗竭在机制上是一致的。值得注意的是，EGCG-SeNPs通过降低Keap1、恢复Nrf2水平以及改善酶性和非酶性抗氧化剂谱，最有效地纠正了这种抗氧化失衡。GPx的恢复对硒基配方特别相关，因为硒是谷胱甘肽过氧化物酶功能活性所必需的，这些酶参与过氧化物解毒和保护免受脂质氧化损伤。因此，EGCG-SeNPs似乎结合了EGCG的自由基清除特性和硒支持的抗氧化防御，这为它们优越的恢复肝脏氧化还原稳态能力提供了一个合理的解释。
MDA/NO积累与血脂谱失调之间的相关性支持了氧化应激既是脂质超负荷的后果，又是进一步肝脂失调驱动因素的假设，因为ROS可以诱导SREBP-1c激活并损害PPAR-α功能，从而加剧脂毒性。这一机制见解解释了血脂异常和氧化损伤之间的协同相互依赖性。
HFD诱导的氧化应激直接参与炎症通路。NF-κB激活导致TNF-α、IL-6和其他促炎介质的转录增加，在肝脏内建立慢性低度炎症。机制上，ROS调节IκB激酶复合物活性，促进NF-κB核转位和促炎细胞因子的转录激活。这些细胞因子反过来加剧肝脏损伤，损害胰岛素信号传导，并通过上调脂质生成转录因子进一步促进脂质积累。NF-κB的持续激活不仅导致局部组织损伤，还促进系统性炎症反应，这从升高的心脏损伤标志物CK-MB和cTnI可以看出，这突显了HFD诱导的氧化-炎症串扰的跨器官效应。
氧化和炎症损伤的进展伴随着肝脏凋亡稳态的明显紊乱。HFD降低了Bcl-2水平，同时增加了细胞色素c和caspase-3，表明线粒体相关凋亡信号增强。Bcl-2是线粒体膜稳定性的重要调控因子，而组织细胞色素c升高与线粒体凋亡通路的更大参与和下游caspase激活一致。当前结果将HFD诱导的氧化应激和受损的线粒体适应与肝细胞凋亡损伤联系起来。EGCG-SeNPs比单独的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯或亚硒酸钠更有效地恢复Bcl-2水平并抑制细胞色素c和caspase-3的升高。这种保护特性表明，EGCG-SeNPs通过恢复抗氧化能力和代谢-线粒体调控，最终限制了凋亡性肝脏损伤的进展，这与治疗组肝脏组织的改善组织学表现一致。
本研究中观察到的转录改变进一步表明，HFD相关的脂质失调伴随着肝脏代谢和线粒体适应性反应的损害。HFD显著抑制了Ampk、Sirt1、Ppargc1a（PGC-1α）和Mfn2的mRNA表达，表明能量感知能力降低、线粒体氧化编程减弱以及线粒体动力学受损。AMPK和SIRT1是肝脏脂质利用的功能互连调控因子，而PGC-1α作为下游代谢共激活因子，支持线粒体氧化能力并与PPAR-α合作促进脂肪酸分解代谢。同时，MFN2有助于线粒体融合和功能网络完整性；因此，其抑制可能促进线粒体碎片化和脂毒性应激。EGCG-SeNPs对这些转录本的显著恢复，加上PPARα的恢复和Srebf1与Fasn的抑制，支持了一个协调机制，其中该纳米制剂改善脂质稳态，同时保持线粒体适应。然而，由于这些终点是在mRNA水平上评估的，当前数据支持AMPK/SIRT1/PGC-1α/MFN2相关轴的转录调控，而不是该通路在蛋白质或磷酸化水平上的激活确认（图15）。
非诺贝特通过激活PPAR-α和增强脂肪酸氧化，在一定程度上缓解了脂质失调和氧化应激。然而，残留的氧化应激和脂质及凋亡标志物的不完全正常化突显了单一靶点药物干预在解决复杂HFD诱导病理方面的局限性。
表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）补充提供了增强的保护，其多酚结构使它能够直接清除ROS、抑制SREBP-1c介导的脂质生成，并部分抑制NF-κB驱动的炎症。这种多方面作用改善了肝脏脂质谱，恢复了抗氧化酶活性，并减少了凋亡信号。
硒补充通过支持谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）等硒蛋白的活性，提供了额外的益处，这些蛋白能解毒ROS并维持氧化还原稳态。硒还调控脂质代谢的转录调节因子，部分恢复PPAR-α活性并减少脂毒性应激。
EGCG功能化硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）表现出最深远的治疗效果。纳米粒子介导的共递送增强了生物利用度和细胞摄取，产生了氧化、炎症和脂质生成途径的协同调控。EGCG-SeNPs下调FASN和SREBP-1c，上调PPAR-α，并激活Nrf2/Keap1和SIRT1信号，恢复内源性抗氧化能力并改善氧化还原平衡。同时，NF-κB信号减弱，降低了TNF-α和IL-6水平。抗氧化和抗炎作用的结合稳定了线粒体膜，增加了BCL2表达，减少了caspase-3激活，保持了肝细胞完整性和功能结构（图15）。
除了肝脏保护外，EGCG-SeNPs还发挥心脏保护作用，使CK-MB和cTnI水平正常化。这些结果表明，系统性氧化和炎症应激的减弱减少了继发于高脂血症的心脏损伤。这些发现突显了纳米粒子策略的多器官益处，该策略同时针对血脂异常、氧化应激、炎症和凋亡。
总体而言，数据揭示了HFD诱导代谢紊乱的序列机制级联：脂质积累→ROS过度产生→NF-κB介导的炎症→凋亡激活→组织损伤。EGCG-SeNPs在多个节点进行干预，恢复脂质稳态，增强Nrf2/SIRT1依赖的抗氧化防御，抑制NF-κB驱动的炎症，并稳定线粒体凋亡途径。这种多靶点方法超越了EGCG或硒单独的作用，为HFD诱导的代谢和器官功能障碍提供了一种强效且具有转化相关性的治疗策略（图15）。
本研究有几个局限性。6周的HFD诱导期和4周的治疗窗口代表了一个相对较短的时间框架，可能无法捕捉慢性代谢适应、疾病进展或晚期治疗反应。未进行全身脂质代谢研究，限制了对脂质生成与清除途径的机制见解。本研究未确定EGCG-SeNPs给药后游离EGCG或硒的血浆浓度、组织分布或清除率。
本研究的一个主要局限是缺乏单独的空白纳米粒子或非EGCG功能化硒纳米粒子的对照组。因此，尽管EGCG-SeNPs在当前实验条件下比游离EGCG和亚硒酸钠产生更大的改善，但无法完全区分纳米粒子载体的特定贡献和EGCG功能化的独立作用。本研究主要设计用于评估EGCG-SeNPs对HFD诱导的肝脏损伤的保护效果，而不是提供完整的配方特异性安全或载体对照评估。先前的研究已报道了基于EGCG、硒和EGCG/SeNP的纳米制剂的相对生物相容性、稳定性和生物活性。
未来的研究应包括靶向或非靶向脂质组学，以评估主要脂质类别，包括脂肪酸、鞘脂、磷脂、甘油三酯、甾醇和脂质介质，以更深入地了解EGCG-SeNPs如何在HFD诱导的肝脂毒性下调节脂质代谢。
4. 材料与方法
4.1. EGCG功能化硒纳米粒子的制备与表征
表没食子儿茶素-3-没食子酸酯功能化硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）是根据Alam-ElDein等人（2026）报告的程序制备的，并根据当前实验设计进行了适当修改。将亚硒酸钠（Na₂SeO₃；10 mM；10 mL）水溶液与等体积的EGCG溶液（3.5 mg/mL；10 mL）混合。将所得混合物在室温下连续磁力搅拌12小时，使EGCG介导的硒离子还原和形成的纳米粒子通过表面包覆稳定，如图16所示。生成的EGCG-SeNPs随后用于物理化学表征和体内给药。
4.1.1. Zeta电位和粒径
EGCG合成的硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）的表面电荷和流体动力学特性分别通过Zeta电位和动态光散射（DLS）确定，使用Zetasizer Nano ZS90（Malvern Panalytical，英国马尔文）在工程学院（Capital University）进行。
4.1.2. 透射电子显微镜（TEM）
在Al-Azhar大学开罗分校进一步检查了形态特征和结构完整性。将纳米粒子悬浮液沉积在涂有碳的铜网上，TEM成像确认了合成SeNPs的纳米级尺寸和一致的结构形态。
4.1.3. EGCG-SeNPs的X射线衍射分析（XRD）
在Al-Azhar大学开罗分校评估了表没食子儿茶素没食子酸酯介导的硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）的结构特性。将干燥的纳米粒子配方进行XRD扫描，分析生成的衍射曲线以识别检测到的峰的位置、强度、半最大值全宽（FWHM）和相应的晶面间距（d-间距）。获得的衍射数据用于评估合成EGCG-SeNPs的结构组织和结晶模式。
4.1.4. EGCG-SeNPs的紫外-可见稳定性评估
在开罗Badr大学（BUC）评估了表没食子儿茶素没食子酸酯介导的硒纳米粒子（EGCG-SeNPs）的时间稳定性。新鲜制备的EGCG-SeNPs最初在200-800 nm波长范围内进行扫描，储存期间每月重复分析以监测其光学谱的变化。通过比较新鲜EGCG-SeNPs的特征吸收带位置和强度模式与储存后记录的结果来评估稳定性。
合成条件是在初步优化试验后选定的，旨在获得稳定的、均匀分散的EGCG-SeNP胶体配方。通过反应混合物的特征颜色变化和紫外-可见分光光度法、DLS粒径分析、Zeta电位测量和TEM检查来监测成功的纳米粒子形成。根据形成具有良好分散性、高表面电荷、最小聚集和可接受储存稳定性的纳米级粒子来选择最终的制备条件。由于该配方用作胶体纳米悬浮液进行表征和动物给药，因此在本研究中未计算重力干燥产品的产率。
4.2. 实验动物与实验设计
本研究旨在评估使用表没食子儿茶素（EGCG-SeNPs）绿色合成的纳米粒子在改善饮食诱导的高脂血症方面的潜在治疗效果。使用了42只成年雄性白化大鼠（250-280克），随机分配到6个实验组，每组7只动物。大鼠在受控环境条件下饲养（22±2°C，50-60%相对湿度，12:12小时光照/黑暗周期），并自由获取水和食物。动物研究方案获得开罗Badr大学生物技术学院伦理委员会批准（方案代码BUC-IACUC/BIOT/136/A/2026，批准日期为2026年2月14日）。
所有治疗，包括Lipanthyl、EGCG、亚硒酸钠和EGCG-SeNPs，均新鲜配制并通过口服灌胃每天给药一次。对照组和未治疗的HFD组通过口服灌胃接受相应的载体。
动物分组结构如下：
（1）对照组（CN，n=7）：该组动物在连续天内暴露于标准条件。第15天，该组动物接受生理盐水溶液（0.9% NaCl）连续30天。
（2）高脂饮食组（HFD，n=7）：该组动物喂食高脂饮食（HFD）诱导高脂血症6周。第15天，该组动物通过口服接受生理盐水溶液（0.9% NaCl）连续30天。
（3）标准药物组（HFD/LPL，n=7）：该组动物喂食高脂饮食（HFD）诱导高脂血症6周。第15天，该组动物每天口服给予标准药物"LPL"，剂量为200 mg/kg/天，连续30天。
（4）EGCG组（HFD/EGCG，n=7）：该组动物喂食高脂饮食（HFD）诱导高脂血症6周。第15天，该组动物每天口服给予表没食子儿茶素"EGCG"，剂量为200 mg/kg/天，连续30天。
（5）亚硒酸钠组（HFD/Na₂SeO₃，n=7）：该组动物喂食高脂饮食（HFD）诱导高脂血症6周。第15天，该组动物每天口服给予亚硒酸钠"Na₂SeO₃"，剂量为0.5 mg/kg/天，连续30天。
（6）表没食子儿茶素生物合成的硒纳米粒子组（HFD/EGCG-SeNPs，n=7）：该组动物喂食高脂饮食（HFD）诱导高脂血症6周。第15天，该组动物每天口服给予使用EGCG生物合成的硒纳米粒子"EGCG-SeNPs"，剂量为0.5 mg/kg/天，连续30天。
高脂饮食（HFD）是根据先前描述的Wistar大鼠动脉粥样硬化饮食诱导高脂血症模型制备的。简而言之，饮食由75%商用Teklad TD.02028 Western纯化动脉粥样硬化饮食补充15%猪油和10%椰子油组成。与标准实验室饲料相比，这种HFD具有更高的脂肪和热量密度，并包含胆固醇和胆酸等动脉粥样硬化成分，从而促进血脂异常、肝脏脂质沉积和肝脏损伤。对照组接受标准实验室饲料，而所有HFD组接受HFD 6周以诱导实验性高脂血症。
4.3. 功效分析和样本量证明
每组n=7只动物（总N=42）的样本量基于先验功效分析证明，该分析表明该样本量提供了>95%的统计功效来检测主要结果指标（血清总胆固醇正常化）的预期效应大小（Cohen's d≥2.0）。随后观察到的非常大的效应大小（d=3.8-5.9 across biomarkers）表明该研究对所有主要比较实现了>99%的统计功效。决定采用每组n=7平衡了检测治疗效应的统计目标与最小化使用的动物总数的伦理要求（3R原则）。在受控条件下维持的近交系实验室大鼠的生物同质性，加上对表现出一致效应的多个独立生物标志物的评估，共同支持了样本量对研究目标的充分性。
4.4. 组织采集和样本制备
在腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪（100和10 mg/kg体重，分别）诱导深度麻醉下处死动物。立即切除肝脏，仔细修剪，并用冰冻生理盐水冲洗以消除残留血液。组织分为指定用于生化、分子和免疫组织化学评估以及组织学成像的部分。
用于生化评估时，将一部分肝组织在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中匀浆，得到10%（w/v）匀浆液。将所得混合物在4500 rpm下离心12分钟，并收集上清液用于测定氧化应激生物标志物、抗氧化酶活性、炎症介质、凋亡标志物和代谢参数，包括葡萄糖和胰岛素。
用于组织病理学和免疫组织化学分析时，肝样品在10%中性缓冲福尔马林中固定，经过常规石蜡包埋处理，并切片用于后续染色和显微镜检查。
4.5. 血清采集和生化分析
让血液样本在室温下凝固15分钟，并在4°C下以3000 rpm离心以获得血清，用于评估肝酶、血脂谱、葡萄糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数。制备肝匀浆（10% w/v）在磷酸盐缓冲盐水（10 mM磷酸盐缓冲液，138 mM NaCl，2.7 mM KCl；pH 7.4）中，随后在4°C下以10,000 rpm离心10分钟。所得上清液用于测定氧化应激和炎症生物标志物。所有参数均使用商用ELISA和比色测定试剂盒，按照制造商的协议进行量化。
4.5.1. ELISA蛋白测定
使用商用大鼠特异性ELISA试剂盒，按照制造商的说明，定量血清或肝组织匀浆中的蛋白生物标志物。使用MyBioSource ELISA试剂盒（美国圣地亚哥）测定肝Keap1和Nrf2水平（目录号分别为MBS7218529和MBS752046）。使用MyBioSource ELISA试剂盒（目录号MBS744364）测定肝GPx活性。在肝组织匀浆中使用ELISA试剂盒测定炎症介质，包括NF-κB（MyBioSource，目录号MBS453975）、TNF-α（MyBioSource，目录号MBS700574）和IL-6（MyBioSource，目录号MBS2020158）。使用ELISA试剂盒评估凋亡标志物，包括细胞色素c（MyBioSource，目录号MBS700786）、Bcl-2（FineTest，目录号ER0762）和caspase-3（MyBioSource，目录号MBS261814）。
4.5.2. 肝酶活性评估
使用商用比色试剂盒测定血清ALT、AST和ALP活性。使用BioVision商用试剂盒（目录号E4325-100和E4321-100；美国米尔皮塔斯）测定ALT和AST水平。使用MyBioSource商用试剂盒（目录号MBS165203）测定ALP活性。
4.5.3. 脂质谱分析
使用大鼠特异性QuickDetect™ ELISA试剂盒（BioVision，美国；目录号K4436-100）在450 nm处测定血清总胆固醇。使用Spectrum Diagnostics GPO-PAP比色法（REF: 314 001–314 010）在546 nm处测定甘油三酯（TG）。在沉淀LDL和VLDL组分后使用Spectrum Diagnostics HDL-C试剂（REF: 266 001/266 002）测定HDL-C，而LDL-C使用Spectrum Diagnostics酶比色法（REF: 280 001/280 002）直接定量，在600 nm处测定。所有测量均按照制造商说明进行两次。
4.5.4. 氧化和抗氧化状态评估
通过测量肝匀浆中的MDA、NO、GSH、SOD和CAT来评估肝氧化应激和抗氧化能力。使用TBARS方法量化脂质过氧化。通过Griess反应测定一氧化氮代谢物。使用Elman基于的方法测定GSH水平。使用标准分光光度法测定抗氧化酶活性：SOD活性基于硝基蓝四唑盐还原的抑制；CAT活性通过监测过氧化氢降解来测量；GPx活性使用MyBioSource商用ELISA试剂盒（目录号MBS744364）评估。
此外，使用大鼠特异性ELISA试剂盒按照"ELISA蛋白测定"部分所述测定肝Keap1和Nrf2水平。
4.5.5. 炎症标志物评估
在肝组织匀浆中使用大鼠特异性ELISA试剂盒按照"蛋白测定"部分所述量化肝NF-κB、TNF-α和IL-6水平。
4.5.6. 凋亡标志物评估
在肝组织匀浆中使用大鼠特异性ELISA试剂盒如上所述测量肝细胞色素c、Bcl-2和caspase-3水平。
4.5.7. 基因表达分析
进行定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）以研究与脂质代谢和线粒体稳态相关的肝转录变化。从肝组织中分离总RNA并逆转录为互补DNA（cDNA）。评估参与从头脂质生成的基因（脂肪酸合酶（Fasn）和甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）），以及脂肪酸氧化和代谢调控标志物（过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα/PPAR-α）、AMP激活蛋白激酶（AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α））的相对mRNA表达。通过测定肝MFN2的mRNA表达进一步评估线粒体动力学。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内部参考基因进行归一化。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达。用于RT-qPCR分析的引物序列见表1。
4.6. 组织病理学检查
将肝样品固定、石蜡包埋，并用苏木精和伊红（H&E）染色，以评估整体肝结构，包括肝细胞完整性、血管变化以及变性和坏死病变。组织病理学评估侧重于识别高脂饮食诱导的改变并确定治疗后结构改善的程度。
4.7. Nrf2的免疫组织化学评估
进行免疫组织化学以评估核因子E2相关因子2（Nrf2）（目录号NBP3-13682；Novus Biologicals，美国科罗拉多州利特尔顿），这是细胞抗氧化防御和代谢稳态的关键调控因子。将石蜡包埋的肝切片脱蜡、再水化并进行抗原回收，然后与针对Nrf2的特异性一抗孵育。使用HRP标记的二抗和DAB显色剂进行检测，产生对应于阳性免疫反应的棕色细胞质和/或核信号。染色切片用苏木精复染并在显微镜下检查，以评估标记表达的定位和强度。使用半定量评分来比较实验组之间的表达水平，使能够评估治疗诱导的氧化应激和代谢调控途径的调节。使用DAB作为显色底物进行免疫反应性位点的可视化。最后，用苏木精复染切片并安装在显微镜载玻片上用于明场照明。使用ImageJ Fiji软件（版本1.52n）进行免疫组织化学染色的半定量分析，采用苏木精和DAB（H-DAB）图像去卷积，并进行后续定量分析以评估染色强度和分布。在所有实验组中以400倍放大率量化Nrf-2免疫反应性的百分比面积。
4.8. 统计分析
在应用参数统计分析之前，对所有数据集进行了正态性和方差同质性检验。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，使用Levene检验评估方差同质性。所有测量参数均满足正态分布和方差同质性的假设；因此，应用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey事后检验。Tukey检验用于控制每个测量生物标志物内实验组之间的多个成对比较。差异在p<0.05时被认为具有统计学意义。
相对于对照组的百分比变化计算为：
%差异 = (治疗值 - 对照值) / 对照值 × 100
5. 结论
总之，在当前实验条件下，EGCG功能化硒纳米粒子比游离EGCG、亚硒酸钠和Lipanthyl对高脂饮食诱导的肝脂毒性表现出更大的保护作用。EGCG-SeNPs改善了血脂异常、肝脏损伤生物标志物、氧化应激、炎症反应和线粒体凋亡标志物。这些效果与Keap1/Nrf2抗氧化轴的调控、NF-κB相关炎症标志物的抑制、脂质生成和脂肪酸氧化相关基因的调节以及AMPK/SIRT1/PGC-1α/MFN2相关mRNA表达的恢复相关。组织病理学和免疫组织化学结果进一步支持了生化和分子结果。然而，由于AMPK/SIRT1/PGC-1α/MFN2标志物是在mRNA水平上评估的，这些发现应解释为转录调控，而不是该通路在蛋白质或磷酸化水平上激活的确凿证据。需要进一步的研究使用蛋白表达、磷酸化测定和通路抑制方法来确认这一机制。
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