摘要
结直肠癌(CRC)仍是全球癌症相关死亡的主要原因，其发病率上升、治疗耐药性和化疗诱导的毒性突显了对更安全、更有效治疗策略的需求。纳米技术通过靶向药物递送和增强治疗效果提供了有前景的方法。本研究调查了槲皮素负载硒纳米颗粒(Qu-SeNPs)对HCT116结肠癌细胞的抗癌潜力，并直接将其效果与顺铂(CP)进行比较。据我们所知，这是首次系统比较Qu-SeNPs和CP在CRC细胞中作用机制的研究。使用UV-Vis光谱、FTIR、TEM、EDX、zeta电位和DLS进行的全面理化表征证实了稳定、分散良好的Qu-SeNPs的成功合成，其在410 nm处显示出特征峰。MTT实验表明，Qu-SeNPs以剂量依赖方式降低了HCT116细胞活力，IC50为51.19 μg/mL，而顺铂(IC50 = 17.6 μg/mL)的效力更强。形态学分析显示Qu-SeNPs处理的细胞具有明显的凋亡特征。体外药物释放谱显示顺铂在中性和酸性条件下均快速释放，而Qu-SeNPs则表现出pH响应的缓释模式。ROS动力学分析表明，顺铂在6小时引起早期ROS急剧升高，在24至48小时达到平台期；相比之下，Qu-SeNPs在48小时内导致ROS逐渐、持续增加，表明持续性氧化应激。细胞周期分析显示顺铂诱导S期和G2/M期阻滞，符合检查点介导的DNA修复，而Qu-SeNPs显著增加sub-G0/G1群体，表明诱导凋亡和检查点旁路。凋亡实验、彗星实验和DNA片段化证实了Qu-SeNPs导致的广泛细胞死亡，伴有Bax和cleaved caspase-3上调，证实了线粒体凋亡激活。Western blot分析显示顺铂显著上调Nrf-2，表明抗氧化防御激活，而Qu-SeNPs未诱导Nrf-2，暗示持续性ROS压倒了细胞抗氧化反应。总体而言，Qu-SeNPs促进检查点旁路和持续性ROS介导的凋亡，同时未能激活Nrf-2表达，表明与CP相比，这是一种克服治疗耐药性更有效的策略。总之，Qu-SeNPs在体外对CRC表现出潜在的抗癌作用；然而，需要进一步的体内研究来确认其有效性和安全性。
引言
癌症仍然是全球最重大的健康挑战之一，在世界范围内造成大量发病率和死亡率。在各种类型中，结直肠癌(CRC)是第三大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的主要原因。美国食品药品监督管理局(FDA)已批准300多种化疗药物，但由于癌症的多样性，其总体有效性仍然有限。在包括CRC在内的癌症治疗中，化疗药物经常面临多药耐药性、低特异性、靶向细胞不足和显著毒性等主要限制，所有这些都削弱了治疗效果并降低了患者预后。这促使人们需要将高疗效与降低毒性相结合的治疗方法。纳米技术通过实现靶向药物递送、改善生物利用度和可控释放，为癌症治疗提供了有前景的解决方案。特别是硒纳米颗粒(SeNPs)作为新型抗癌剂已经出现，具有强大的抗氧化、抗炎和细胞毒性特性。
顺铂(CP)是一种广泛用于各种实体瘤(包括CRC)的铂类化疗药物。它通过形成DNA加合物发挥抗癌作用，导致DNA交联、复制抑制和癌细胞凋亡，通过各种信号通路进行调控。此外，CP与蛋白质和酶相互作用，可能改变其生化功能。然而，CP的细胞毒性和凋亡活性不仅限于癌细胞，通常会对正常细胞造成不良影响，限制了其治疗窗口并降低了患者依从性。尽管CP已证明有效，但包括CP在内的铂类抗癌药物会因DNA修复增强、药物转运改变、解毒过程增强以及生存途径激活等因素而产生耐药性，这对有效治疗构成了重大挑战。鉴于这些限制，大量研究集中在寻找CP更安全、更有效的替代品上。其中，天然化合物及其衍生物因其副作用最小且作用机制多靶点而受到广泛关注。
槲皮素是一种天然存在的膳食黄酮类化合物，通过调节参与凋亡诱导、细胞周期阻滞、增殖抑制和氧化应激调节的关键细胞通路，表现出抗氧化、抗炎和抗癌特性。此外，槲皮素可以增加癌细胞对标准化疗药物的敏感性，提高其有效性和最小化相关毒性。Maurya等人报道，槲皮素通过调节PI3K/AKT通路抑制HCT116细胞的生长并促进凋亡。同时，Pratheeshkumar等人的研究结果表明，槲皮素通过靶向VEGF-R2调控的AKT/mTOR/P70S6K信号通路抑制肿瘤生长和血管生成。硒纳米颗粒(SeNPs)与其他金属纳米颗粒(如银和金)相比成本效益更高，并且由于其治疗潜力，作为抗癌药物和植物生物活性化合物的载体而受到关注。
硒纳米颗粒(SeNPs)因其高表面积与体积比、可控尺寸以及与癌细胞的选择性相互作用，已成为癌症治疗的有前景平台。它们主要通过产生ROS、诱导DNA损伤和触发癌细胞凋亡来表现出抗癌活性。此外，SeNPs对癌细胞表现出选择性细胞毒性，主要通过诱导凋亡和抑制肿瘤生长通路。从香菇多糖合成的SeNPs在结肠癌细胞中表现出细胞周期阻滞和线粒体介导的凋亡。然而，尽管有这些有希望的发现，据我们所知，尚未有研究报道比较Qu-SeNPs与CP在结直肠癌中细胞毒性剂量下的抗癌功效。
抗癌剂的体外评价需要临床相关细胞模型。HCT116是一种被广泛研究的人结肠癌(CRC)细胞系，用于研究CRC进展、分子机制和治疗反应。它密切反映了人类CRC肿瘤的关键特征，包括侵袭性生长、侵袭、转移和常见CRC相关突变，使其成为临床相关模型。由于其明确的遗传和表型特征，HCT116作为评估药物功效、耐药机制和凋亡的稳健平台，支持新型CRC疗法的临床前开发。
尽管槲皮素具有明确记录的抗氧化和抗癌特性，但它存在几个主要缺点，包括水溶性极差、肠道吸收有限、快速代谢和口服生物利用度低。这些限制显著限制了其治疗效用和一致的系统暴露。将槲皮素与SeNPs进行纳米制剂提供了一种有前景的策略，通过改善其稳定性、生物利用度和靶向递送到肿瘤组织来克服槲皮素的局限性，从而增强治疗效果。基于这一理论，我们假设槲皮素负载的SeNPs(Qu-SeNPs)将对CRC表现出强大的抗癌活性。因此，本研究旨在合成和表征Qu-SeNPs，并评估其在HCT116 CRC细胞中的细胞毒性功效和潜在分子机制，以CP作为参考化疗药物。据我们所知，这是首次比较Qu-SeNPs与CP在HCT116细胞中的抗癌潜力的研究，为纳米载体方法解决传统化疗的一些局限性提供了初步见解，并有助于开发更安全、更有效的CRC疗法。
材料与方法
试剂和材料
聚乙烯醇(PVA，99.5%)和抗坏血酸(99.5%)购自Santa Cruz Biotechnology(CA，美国)。甲醇(≥99.99%)、聚乙二醇(PEG，99.99%)、亚硒酸钠(99.99%)和槲皮素(≥95%)购自Sigma-Aldrich(MO，美国)。顺铂购自Santa Cruz Biotechnology，CA，美国。本研究中使用的所有化学品均为分析级，购自Sigma-Aldrich(MO，美国)。
纳米颗粒的合成
Qu-SeNPs通过槲皮素还原亚硒酸钠合成，槲皮素同时充当还原剂和封端剂。聚乙二醇(PEG)被用作稳定剂，遵循先前建立的方案并稍作修改。所有程序均在无菌层流罩内无菌条件下进行。具体而言，将100 mL亚硒酸钠水溶液(5.78 mM)与100 mL槲皮素甲醇溶液(16.5 mM)混合。槲皮素溶液使用0.20 μm滤器灭菌。使用移液管将亚硒酸钠溶液逐滴加入槲皮素溶液中。然后将聚乙二醇(2.0 mM)溶解在混合物中，使用磁力搅拌器在70°C下搅拌。将形成的纳米颗粒在黑暗中放置5小时，颜色从黄色变为深棕色表明Qu-SeNPs的形成。然后将形成的纳米颗粒在40°C的无菌培养皿中干燥。
合成纳米颗粒的表征
合成的纳米颗粒通过多种先进的分析方法进行了全面表征。使用Lambda-25分光光度计(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)在200-800 nm的光谱范围内进行紫外-可见(UV-Vis)光谱分析。特别关注200-300 nm区域的吸收特征，该区域中明显吸收峰的出现是成功合成硒纳米颗粒的关键指标，为了解其光学特性提供了重要见解。使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical Ltd.，英国伍斯特郡)进行动态光散射(DLS)和zeta电位测量，分析粒径分布和表面电荷。使用Spectrum 100 FTIR光谱仪(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析，以确定官能团并确认槲皮素包被的分子相互作用。使用D8 Advance衍射仪(Bruker AXS GmbH，德国卡尔斯鲁厄)进行X射线衍射(XRD)分析，确定晶体结构。使用JSM-7610F场发射SEM(JEOL Ltd.，日本东京)在20 kV下进行扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱(EDAX)分析，检查表面形态和元素组成。使用JEM-1400Plus TEM(JEOL Ltd.，日本东京)进行透射电子显微镜(TEM)分析，获得纳米颗粒形态的高分辨率图像(200-1,200,000×)。
药物释放动力学
使用透析袋技术，在生理(pH 7.4)和肿瘤模拟(pH 5.5)条件下评估Qu-SeNPs与顺铂的药物释放动力学，如Yu等人所述。冻干的Qu-SeNPs在0.1 M磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中重新配制，同时平行制备相同浓度的顺铂。将这些制剂的等体积转移到预水合透析膜(MWCO 12 kDa)中，并浸入含有0.1% Tween 80的20 mL PBS(pH 7.4或5.5)中。将整个系统在37°C下孵育，以100 rpm连续摇动。在72小时内的特定时间间隔，取出1 mL样品并补充新鲜缓冲液以维持漏槽条件。收集的样品在5000 rpm下离心2分钟，并使用0.45 μm膜过滤器过滤。使用高效液相色谱(HPLC，Agilent 1260 Infinity II，Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉)测定药物浓度，配备C18反相柱(4.6 × 150 mm，5 μm粒径)。流动相由甲醇：水(60:40，v/v)组成，含0.1%甲酸，流速为1.0 mL/min。进样体积为20 μL，在370 nm(槲皮素)和254 nm(顺铂)波长下进行检测。结果表示为在两个pH水平下随时间累积的药物释放百分比。
细胞培养
HCT116结肠癌细胞在RPMI-1640培养基中培养，培养基补充10%热灭活胎牛血清(Sigma-Aldrich，英国)、100 μg/mL链霉素(Sigma-Aldrich，英国)、50 U/mL青霉素(Sigma-Aldrich，英国)和2 mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich，英国)。在37°C、5% CO2气氛下维持最佳生长条件。使用倒置显微镜(Leica DMI 6000)定期监测细胞形态和融合度，直到达到70-80%融合度。
细胞毒性评估
将HCT116细胞以5-6 × 10³个细胞/孔的密度接种在96孔板中，加入100 μL优化培养基，并允许贴壁48小时。为检查细胞毒性剂量等效性，在48小时内评估了HCT116细胞在顺铂(0.6、1.2、2.5、5、10、20、40 μg/mL)和Qu-SeNPs(3、6、12、25、50、100、200 μg/mL)各种浓度下的细胞活力。孵育后，向每孔加入20 μL CellTiter 96 Aqueous One Solution(Promega，威斯康星州麦迪逊)，含有MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑)。将平板在37°C、5% CO2气氛下孵育2小时，允许MTS还原为甲臜，其与细胞活力成正比。使用平板读数器(SPECTRAmax PLUS384)在490 nm处测量吸光度。实验进行三次，活力根据以下公式相对于未处理对照组计算：
%细胞毒性 = 100 × (对照组吸光度 - 样品吸光度) / 对照组吸光度
细胞形态评估
基于我们的初步细胞活力实验，将细胞暴露于顺铂(18 μg/mL)和Qu-SeNPs(51 μg/mL)的细胞毒性剂量下48小时，并使用光学显微镜(Leica DM4000 B LED)观察HCT116细胞的形态。检查细胞形态变化，包括细胞收缩、脱落和融合度降低。
凋亡的流式细胞术分析
使用Annexin V-FITC和PI染色评估凋亡。使用BD LSRFortessa流式细胞仪对处理和对照细胞进行染色和分析。通过荧光信号识别早期和晚期凋亡细胞群体，并使用BD FACSDiva软件(版本8.0.1，BD Biosciences)进行分析。
检测DNA损伤的彗星实验
进行彗星实验以评估DNA链断裂。使用裂解和电泳缓冲液制备载玻片，然后用溴化乙锭染色。使用荧光显微镜(Zeiss)进行成像。使用CASP软件量化DNA损伤，并表示为彗星尾部中总DNA的百分比。
DNA片段化实验
使用商业DNA提取试剂盒从用18 μg/mL顺铂或51 μg/mL Qu-SeNPs处理48小时的细胞中提取DNA。然后将提取的DNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以评估片段化模式。使用BioRad成像系统捕获结果，以评估与未处理对照细胞相比处理对DNA完整性的影响。
ROS评估
将HCT-116细胞以0.5-1 × 10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37°C、5% CO2下孵育过夜。用顺铂(18 μg/mL)和Qu-SeNPs(51 μg/mL)处理细胞6、24和48小时。使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，10 μM；Sigma，产品号D6883)评估细胞内ROS水平。在37°C黑暗中与DCFH-DA孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞两次以去除过量染料。使用微孔板读数器(激发485 nm，发射530 nm；DeltaFlex，日本东京)测量荧光。相对于未处理对照组量化ROS水平，以确定氧化应激的倍数变化。
蛋白质印迹分析
通过蛋白质印迹评估凋亡标志物Bax、caspase-3和Nrf-2(抗氧化防御系统的关键激活剂)的蛋白质表达水平。使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液提取总蛋白，并使用Bradford法进行定量。将等量蛋白(每泳道20 μg)通过SDS-PAGE分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下使用TBST(含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水)中制备的5%脱脂奶粉封闭1小时后，膜在4°C下与一抗孵育过夜。使用的一抗包括cleaved caspase-3(Sc-22171；1:1000)、Bax(Sc-6236；1:2000)、Nrf2(Sc-518033；1:1000)和β-actin(Sc-8432；1:1000)，均购自Santa Cruz Biotechnology。经过TBST洗涤后，膜在室温下与HRP偶联的二抗孵育1-2小时。使用增强化学发光(Thermo Fisher Scientific Inc.，马萨诸塞州)可视化蛋白条带并进行数字成像。使用ImageJ软件(版本1.53t)量化条带强度，并归一化为β-actin。
统计分析
使用IBM SPSS版本29进行统计分析。应用双因素方差分析(ANOVA)后跟Tukey事后检验进行比较。使用Shapiro-Wilk检验调查数据的正态性，并根据Levene检验检查方差同质性。如果假设被违反，则使用非参数检验Kruskal-Wallis。当p < 0.05时认为结果具有显著性。
结果与讨论
Qu-SeNPs的表征
纳米硒由于其高生物利用度和低毒性而广泛用于生物医学应用。
通过视觉观察和UV-Vis光谱确认了SeNPs和Qu-SeNPs的形成(图1a，b)。使用抗坏血酸作为还原剂化学合成的SeNPs产生浅橙色溶液(图1a)，表明硒离子(Se⁴⁺)还原为元素硒(Se⁰)和后续纳米颗粒形成。使用槲皮素和PEG的SeNPs绿色合成导致从白色到深棕色的颜色转变。这一观察表明不仅发生了硒前体的还原，还发生了纳米颗粒表面与槲皮素分子的功能化。先前研究也观察到使用槲皮素时出现从白色到砖红色的转变，进一步证实了成功的纳米颗粒形成。UV-vis光谱证实了SeNPs和Qu-SeNPs的成功合成。SeNPs显示出292 nm处的尖锐表面等离子体共振(SPR)吸收峰(图1a)，这是元素硒纳米颗粒的特征。值得注意的是，Qu-SeNPs的UV-Vis光谱显示出两个不同的吸收带：一个在325 nm，表明SeNP核心的存在，另一个在410 nm，对应于槲皮素的吸收最大值(图1b)。后一峰的出现证实了槲皮素成功接合到纳米颗粒表面，可能是通过槲皮素的羟基与硒原子之间的相互作用。先前研究报道，绿色合成的SeNPs通常在296和325 nm左右显示最大吸收峰。从葡萄柚皮衍生的硒纳米颗粒在345和550 nm处显示出峰，而从葡萄柚汁合成的纳米颗粒则在350和500 nm处显示出吸收最大值。与未负载的SeNPs相比，Qu-SeNPs中的峰展宽表明纳米颗粒尺寸增加以及与槲皮素的相互作用。Qu-SeNPs表面上槲皮素的整合有望增强SeNPs的生物功能，特别是由于槲皮素明确记录的抗氧化、抗炎和抗癌特性。
FTIR分析SeNPs和Qu-SeNPs揭示了参与合成纳米颗粒稳定的官能团，证实了槲皮素作为还原剂和封端剂的作用(图1c，d)。识别出对应于N-H(伯胺)、O-H(羟基)、C=O(羧基)和芳香族化合物的特征峰。SeNPs和Qu-SeNPs均表现出三个具有轻微偏移的共同峰；SeNPs中3330 cm⁻¹的羟基峰偏移到Qu-SeNPs中的3308 cm⁻¹，而SeNPs中2021和1636 cm⁻¹的峰分别偏移到2122和1646 cm⁻¹，对应于C≡C(炔烃)和C=C伸缩振动(图1c，d)。这些偏移表明两种纳米颗粒类型之间存在共享官能团。重要的是，Qu-SeNPs显示出2950和2838 cm⁻¹处的额外峰，归因于-CH₂基团的C-H伸缩，以及1450和1015 cm⁻¹处的峰，分别对应于-CH₃基团的C-C弯曲和C-O伸缩。这些峰在SeNPs中不存在，表明槲皮素的有机部分被整合到纳米颗粒结构中。这些额外官能团的存在支持了Qu-SeNPs增强的稳定性和生物活性，证明了槲皮素在将亚硒酸钠还原为元素硒纳米颗粒中的参与。
通过SEM和EDX分别表征了Qu-SeNPs的表面形态和元素组成，如图2所示。SEM分析显示Qu-SeNPs具有从球形到不规则形状的形态，伴有明显的聚集(图2a)，可能是由于槲皮素分子的表面修饰所致。使用TEM分析Qu-SeNPs的形态和尺寸分布。如TEM图像所示(图2b)，Qu-SeNPs的尺寸范围约为80至190 nm，平均直径约为150 nm。这些观察结果与先前描述的球形硒纳米颗粒相符，这些纳米颗粒通过绿色或化学方法合成，平均直径在100至150 nm之间。
EDX元素分析确认了Qu-SeNPs中硒的存在并验证了槲皮素的整合。Qu-SeNPs中的碳和氧信号进一步证实了槲皮素的附着，与其有机性质一致。这种表面功能化增强了纳米颗粒的生物活性，包括抗氧化和促凋亡作用。
SEM和EDX提供了对Qu-SeNPs形态和组成的详细见解(图2a，c)。Qu-SeNPs表现出不规则形状和聚集，可能是由于槲皮素引起的表面变化、氢键、范德华力或干燥效应所致。槲皮素的成核和还原能力也可能在合成过程中促进了晶粒团聚。因此，SEM和EDX分析证实槲皮素修饰影响了纳米颗粒的形态和表面化学，这可能有助于增强生物功效。
合成的纳米颗粒表现出优异的稳定性和高zeta电位，得到DLS和SEM分析的支持。Zeta电位测量显示Qu-SeNPs的表面电荷为-33.7 mV(图2d)，确保了静电排斥和稳定性。这些发现表明Qu-SeNPs具有稳定的胶体特性，适合生物医学应用。动态光散射(DLS)测量显示Qu-SeNPs的流体力学直径为200±1.2 nm(PdI = 0.1)(图2e)。多分散指数(PdI)表示狭窄的尺寸分布，意味着纳米颗粒在尺寸上大多均匀。槲皮素的功能化导致颗粒尺寸增加和形状不那么均匀，可能是由于槲皮素分子与SeNPs之间的物理吸附和相互作用。类似地，使用芦丁或相同化学前体合成的SeNPs与不含芦丁或其他黄酮类接合的SeNPs相比，表现出颗粒尺寸增加。报道的平均尺寸范围分别为45至190 nm或约195 nm。尺寸在20至200 nm之间的SeNPs近年来由于其多样的生物活性而受到广泛关注。观察到的低PdI值表明狭窄的尺寸分布和高胶体稳定性。这些发现，得到zeta电位和DLS分析的支持，证实Qu-SeNPs具有稳定的胶体特性。
TEM图像(图2b)显示，Qu-SeNPs的尺寸范围约为80至190 nm，平均直径约为150 nm，而(DLS)测量显示Qu-SeNPs的流体力学直径为200±1.2 nm。在TEM和DLS测量之间观察到的纳米颗粒尺寸差异已被充分记录。TEM捕获干态核心结构，而DLS测量处于水合状态的颗粒，包括表面涂层和溶剂层。因此，TEM提供关于实际核心尺寸的准确信息，而DLS反映纳米颗粒在分散中的行为，提供关于其物理特性的互补见解。
顺铂和Qu-SeNPs的体外释放谱
顺铂的药物释放特性显示，在pH 7.4条件下，前2小时内药物总释放量为83%，2天内药物完全释放，而Qu-SeNPs在72小时内释放的药物量约为49%(图3a)。在pH 5.5条件下，顺铂和Qu-SeNPs释放的药物量分别增加到约96%和66%(图3b)。Qu-SeNPs的药物释放速率慢于顺铂，表现出缓释行为。在pH 5.5条件下，顺铂和Qu-SeNPs的药物释放速度均快于pH 7.4条件(图3)。预计Qu-SeNPs将提供最佳治疗递送，在生理条件下缓释，而在肿瘤模拟条件下增强释放，而顺铂则表现出快速释放谱。这些发现表明纳米颗粒表现出缓释特性，表明其作为抗癌剂的可控递送平台的潜在适用性。因此，纳米载体可能通过促进改善的递送效率来增强槲皮素的治疗性能。
顺铂和Qu-SeNPs对HCT116细胞的细胞毒性
在我们的研究中，顺铂用作标准且成熟的细胞毒性剂，以评估Qu-SeNPs的细胞毒性潜力。使用MTT实验在暴露48小时后评估顺铂和Qu-SeNPs对HCT116细胞的细胞毒性(图4)。两种试剂均显著降低了剂量依赖性的细胞活力。对于顺铂，活力从0.6 μg/mL时的79.5%降至36 μg/mL时的35.8%，IC50值为17.6 μg/mL(约18 μg/mL)。相比之下，Qu-SeNPs将活力从3 μg/mL时的80.4%降至200 μg/mL时的20.3%，估计IC50为51.2 μg/mL(约51 μg/mL)。这些发现与先前报道的槲皮素负载纳米颗粒的显著抗癌潜力相符，特别是在乳腺癌模型中。据报道，顺铂对2D培养物的IC50值通常在5-75 μM(约5-22.5 μg/mL)之间。在我们的研究中，顺铂的IC50确定为约18 μg/mL，这在报道的范围内，表明与先前发表的数据一致。
Qu-SeNPs的浓度范围(5、10、25、50、100和200 μg/mL)被测试以评估其剂量依赖性细胞毒性效应并确定IC50值。包括较高浓度(100和200 μg/mL)提供了饱和点和完整剂量-反应曲线的更清晰视图。与顺铂(18 μg/mL)相比，Qu-SeNPs较高的IC50(51 μg/mL)表明较慢、更渐进的细胞毒性反应。而CP，作为一种传统的小分子化疗药物，表现出在低得多的浓度下强大的细胞毒性，这与其作为DNA交联剂迅速触发凋亡的明确机制一致。Qu-SeNPs作为纳米颗粒载体，使槲皮素的逐渐释放(图3)，因此需要更高的剂量才能产生显著的细胞内效应。Qu-SeNPs的增强性能可能归因于槲皮素和硒之间的协同相互作用，这改善了生物利用度，实现了可控释放并增强了细胞摄取。在较高浓度下，CP表现出全身毒性，包括肾毒性、神经毒性、耳毒性和血液学副作用，而硒和槲皮素不仅对癌细胞表现出选择性细胞毒性，还通过减轻氧化和炎症应激来保护正常细胞。考虑到已记录的安全问题，我们的发现表明Qu-SeNPs作为纳米载体治疗策略的潜力，与传统顺铂相比，提供增强的长期功效。
基于我们的初步实验，选择顺铂的浓度为18 μg/mL(将细胞活力降至约50%)，与Qu-SeNPs在其IC50(约51 μg/mL)下进行比较。使用两种试剂在各自IC50值附近的浓度允许对它们如何诱导细胞死亡进行有意义的机制比较。虽然这不代表直接的剂量等效性，但它确保每种化合物都在产生可比细胞毒性水平的条件下进行测试。这种标准化方法为评估和比较其细胞毒性机制提供了可靠的临床前框架。
Qu-SeNPs在HCT116细胞中诱导显著的形态学改变
使用光学显微镜直接检查了顺铂和Qu-SeNPs对细胞形态的影响。未处理的HCT116细胞均匀分布在培养物中，保持正常的、均匀的多边形形状(图5a)。顺铂(18 μg/mL)和Qu-SeNPs(51 μg/mL)处理后，观察到明显的形态学变化，导致从多边形转变为圆形，伴有细胞收缩，表明凋亡变化(图5b，c)。此外，观察到明显的细胞密度降低，检测到大量漂浮细胞。值得注意的是，与顺铂处理的细胞相比，Qu-SeNPs处理的细胞中这些形态学变化更为明显(图5c)。
类似观察已在使用硒纳米复合物的研究中报道，其中处理的癌细胞显示出膜出泡、收缩和核凝聚，这是凋亡性细胞死亡的标志。
细胞周期阻滞
近年来，越来越多的关注集中在DNA修复机制在顺铂耐药性发展中的作用，强调其在癌症治疗中的临床意义。在我们的研究中，流式细胞术细胞周期分析显示顺铂处理在HCT116细胞中诱导了明显的G2/M和S期阻滞(图6b)。这一观察结果与早期发现一致，表明顺铂主要通过在S期和G2/M期引起延迟或阻滞来破坏细胞周期进展，突出了顺铂通过DNA交联和DNA损伤的作用机制。这种阻滞允许细胞停止进展并尝试DNA修复，这是许多DNA损伤剂的反应特征。相比之下，Qu-SeNPs处理的细胞表现出明显不同的谱型。观察到sub-G0/G1群体显著增加，表明广泛的DNA片段化和凋亡诱导(图6c)。同时，G0/G1和G2/M群体减少，反映了正常检查点激活的受损，通常会暂停周期以进行修复。同时，S期群体略有增加，表明受损细胞在没有适当修复机制的情况下提前进入或通过DNA合成。这种细胞周期的破坏表明Qu-SeNPs覆盖了检查点介导的阻滞，推动受损细胞通过周期，促进有丝分裂灾难和凋亡。
Qu-SeNPs可能通过破坏ATM/ATR–Chk1/Chk2信号通路发挥作用，这些通路对DNA损伤感应和检查点激活至关重要。当这些通路被破坏时，细胞失去暂停和修复损伤的能力，导致它们在DNA受损的情况下继续分裂，最终导致凋亡。DNA损伤在Qu-SeNPs中也可能触发线粒体功能障碍，激活内在凋亡通路。这个过程涉及促凋亡蛋白的上调和caspase的激活，驱动凋亡，同时绕过正常的检查点介导的阻滞。相比之下，顺铂依赖于检查点激活来暂停细胞周期，允许在启动凋亡之前进行DNA修复。这些结果表明，Qu-SeNPs通过覆盖检查点控制并推动受损细胞通过周期，采用更直接和更具攻击性的机制，从而迅速导致细胞死亡。这种机制可能使Qu-SeNPs对依赖检查点介导阻滞生存的CP耐药癌症特别有效。值得注意的是，诱导G0/G1阻滞可以增强细胞对凋亡的敏感性，为改善抗癌功效提供了一种有前景的策略。
Qu-SeNPs与顺铂在HCT116细胞中诱导更强的凋亡反应
对照细胞显示荧光强度向右偏移最小，表明更多活细胞(图7a)。凋亡和药物释放谱的比较分析突显了Qu-SeNPs相对于顺铂的增强细胞毒性潜力。顺铂(9.5%)与Qu-SeNPs(3.9%)相比，早期凋亡诱导更高，可能是由于其快速药物释放(图7b)和即时DNA损伤效应。然而，Qu-SeNPs(31.7%)与顺铂(16.1%)相比，晚期凋亡显著升高，表明更持续和渐进的细胞毒性反应(图7c)。这与Qu-SeNPs的受控释放行为相关，其在72小时内表现出较慢的pH响应药物释放(pH 7.4时为49%；pH 5.5时为66%)，而顺铂则快速释放(2小时内83%；pH 5.5时约96%)(图3)。槲皮素和硒的持续细胞内可用性可能促进癌细胞中持续的氧化和凋亡应激。Qu-SeNPs晚期凋亡的这种显著增加表明延迟但有效的细胞毒性作用，可能是由于增强的细胞摄取和硒及槲皮素的持续细胞内释放所致。这些发现与先前研究表明，用生物活性化合物对纳米颗粒进行表面功能化可以改善其治疗功效和选择性。
这些发现表明，与顺铂诱导快速凋亡不同，Qu-SeNPs可能启动更持续的凋亡反应，可能通过平衡延迟细胞毒性与增强凋亡效率提供治疗益处。这种方法可能有助于在癌症治疗中最小化全身毒性。
Qu-SeNPs比顺铂处理细胞中产生更渐进的ROS
使用DCFH-DA实验，我们观察到顺铂和Qu-SeNPs之间ROS产生的不同谱型。顺铂处理导致细胞内ROS在6小时快速增强至2.3倍，在24小时达到峰值4.0倍，然后在48小时降至2.9倍，相对于未处理对照组。相比之下，Qu-SeNPs处理的细胞表现出ROS水平的缓慢初始增加(6小时1.25倍)，随后逐渐上升，在48小时达到与顺铂相当的水平(相对于未处理对照组3.0倍)(图8)。顺铂体积小且无净电荷，因此预计通过被动扩散进入。相比之下，纳米颗粒的细胞进入显著更慢且更持续，通过能量依赖性内吞途径发生。摄取通常涉及初始结合，随后在数小时内逐渐内化，通常具有双相动力学和最终在内体或溶酶体中的隔离。顺铂的快速细胞摄取及其与线粒体和核靶标的相互作用可能导致早期ROS峰值，这与我们在凋亡发现中早期凋亡的诱导平行(图8)。然而，Qu-SeNPs显示出低早期ROS生成；这种延迟释放谱与缓慢初始释放和随时间累积的细胞内纳米颗粒解释了Qu-SeNPs中ROS的渐进增加和后期凋亡发作(图8)。槲皮素功能化的SeNPs可能会减少即时氧化应激，但不会阻止最终的纳米颗粒介导的ROS和癌细胞凋亡。这种动力学在治疗上可能是有利的，具有较慢、持续的肿瘤细胞杀伤和不同的毒性窗口，并且可能规避一些基于应激的药物耐药机制。
Qu-SeNPs与顺铂和SeNPs在HCT116细胞中增加的基因毒性效应
使用彗星实验评估了顺铂和Qu-SeNPs在HCT116结肠癌细胞中诱导的DNA损伤(图9)。未处理的对照细胞(图9a)显示致密的细胞核，彗星尾部可忽略，表明完整的基因组DNA和最小的链断裂。顺铂处理的细胞(图9b)显示出更明显的尾部延长，这与顺铂诱导DNA交联和复制应激的已知机制一致。最值得注意的是，Qu-SeNPs处理的细胞(图9c)显示出最广泛的彗星尾部，表明严重的DNA片段化。尾部长度的定量分析(图9d)证实了这些视觉观察。对照组的平均尾部长度约为2 μm，而顺铂和Qu-SeNPs处理的平均尾部长度分别为约12.3和15.7 μm。所有处理组与对照组相比均显示出统计学上显著的增加(p < 0.05)。这些数据表明，DNA损伤的治疗特异性而非剂量依赖性升级，Qu-SeNPs表现出最明显的基因毒性效应。
顺铂是一种广泛使用的化疗药物，通过形成链内和链间交联诱导DNA损伤，最终破坏DNA复制和转录。顺铂在包括结肠癌在内的各种癌症中的有效性已得到充分记录，它在本研究中作为阳性对照。Qu-SeNPs诱导的尾部长度甚至大于顺铂的事实突显了其增强的效力和更强的DNA损伤潜力。SeNPs引起的中度DNA损伤与先前研究表明硒纳米颗粒可以促进氧化应激，通过线粒体破坏和氧化还原失衡导致凋亡相符。尽管SeNPs对癌细胞具有内在细胞毒性，但其与槲皮素的功能化可能显著增强这种效应。
槲皮素是一种天然黄酮类化合物，在癌症背景下被公认为具有作为抗氧化剂和促氧化剂的双重作用。它可以通过产生活性氧(ROS)、抑制拓扑异构酶活性和调节氧化还原敏感信号通路来诱导氧化DNA损伤。当与纳米颗粒结合时，槲皮素的生物利用度、细胞摄取和保留显著改善，有助于Qu-SeNP处理中观察到的DNA片段化的显著增加。我们的发现得到了Zhou等人的支持，他们证明槲皮素包被的硒纳米颗粒通过线粒体途径在肝细胞癌细胞中增强了ROS产生并诱导了DNA损伤。类似地，Zhao等人的研究也报道，当硒纳米颗粒与植物化学物质结合用于肺癌模型时，会发生协同的基因毒性效应。
DNA片段化分析揭示Qu-SeNPs与顺铂和SeNPs在HCT116细胞中增强的凋亡活性
使用琼脂糖凝胶电泳评估DNA片段化作为对照组和处理组(顺铂和Qu-SeNPs)中凋亡的指标。对照组显示单个完整的高分子量DNA条带，表明没有DNA片段化并证实基因组稳定性(图10，第3道)。相比之下，顺铂处理的样品(图10，第1道)显示出显著的DNA片段化，以低分子量条带的可见条纹为特征，这与药物的已建立的细胞毒性和促凋亡效应一致。值得注意的是，Qu-SeNPs处理的细胞(图10，第2道)显示出增强的DNA片段化，具有明显的DNA条纹和几个不同的低分子量条带。这种模式表明增强的凋亡DNA切割，表明Qu-SeNPs制剂在几乎相同的细胞毒性浓度下诱导比顺铂更强的凋亡反应。DNA片段化是晚期凋亡的标志，其中核酸内切酶将染色质切割成核小体间片段。这种模式表明增强的凋亡DNA切割，表明Qu-SeNPs制剂诱导比顺铂更强的凋亡反应。Qu-SeNPs组中观察到的片段化与先前发现一致，即槲皮素可以通过产生ROS和线粒体通路激活来增强凋亡。此外，SeNPs通过上调凋亡标志物同时最小化全身毒性来调节凋亡是众所周知的。Qu-SeNPs中观察到的增强片段化表明更强的凋亡反应，可能归因于槲皮素和硒的协同效应。
Qu-SeNPs通过Bax和Caspase-3上调以及Nrf2抑制增强凋亡
癌细胞中凋亡的诱导仍然是抗癌药物开发的中心焦点，因为它有可能选择性地消除恶性细胞。在我们的研究中，蛋白质印迹分析显示，在顺铂和Qu-SeNPs处理的HCT116细胞中，促凋亡蛋白Bax(图11a，b)的表达增加，Bax是线粒体外膜通透性(MOMP)的关键调节剂，以及cleaved caspase-3(图11a，c)的表达增加，caspase-3是凋亡的主要执行者，以β-actin作为内部对照。密度计量量化证实，与顺铂相比，Qu-SeNPs诱导了这两种蛋白的更大上调。这种凋亡标志物的强烈诱导与我们在DNA梯状实验中观察到的广泛DNA片段化相关，其中Qu-SeNP处理产生的凋亡DNA降解比顺铂更明显，表明内在线粒体通路的激活增强。
ROS动力学数据进一步阐明了这些效应。Qu-SeNPs触发了细胞内ROS的渐进和持续积累，在48小时达到峰值，而顺铂则在48小时引起快速、短暂的ROS峰值，随后平台期或下降(图8)。这些不同的ROS谱反映了每种制剂的药物释放特性。具有快速释放特性的顺铂导致急性氧化爆发，而Qu-SeNPs表现出受控、持续的释放，维持持续的氧化应激。Qu-SeNPs的这种持续ROS产生与增加的凋亡信号和广泛的线粒体损伤相关，与升高的BAX和cleaved caspase-3水平一致。
对Nrf-2的蛋白质印迹分析(图11d，e)，Nrf-2是抗氧化防御和氧化还原稳态的主调节因子，揭示了治疗之间的显著差异。顺铂暴露显著上调了Nrf-2蛋白水平，这与其快速ROS爆发和急性氧化DNA损伤一致。相比之下，尽管产生高水平的ROS，但Qu-SeNPs未能诱导显著的Nrf-2激活。Qu-SeNPs处理的细胞无法诱导有效的Nrf-2反应可能是由于持续的氧化应激导致细胞内抗氧化剂耗尽。在没有足够的Nrf-2激活的情况下，细胞无法修复氧化损伤或中和ROS，导致不可逆的线粒体功能障碍。升高的ROS破坏线粒体膜完整性，激活Bax，导致线粒体外膜通透性(MOMP)，并将细胞色素c释放到细胞质中。这一事件启动caspase-9激活，随后caspase-3切割，进入凋亡的执行阶段。我们的蛋白质印迹发现中升高的cleaved caspase-3和Bax，以及检测到的显著sub-G0/G1群体，有力地支持了这一机制。
细胞周期分析提供了额外的见解。顺铂处理导致S期和G2/M期阻滞显著，这可能激活了检查点通路(ATM/ATR–Chk1/Chk2)以响应DNA损伤，允许细胞有时间修复受损DNA并通过Nrf-2驱动的细胞保护基因表达恢复氧化还原平衡。这种适应性反应是顺铂化学耐药的公认机制。相比之下，Qu-SeNPs处理的细胞表现出显著升高的sub-G0/G1峰，表明广泛的凋亡DNA片段化和通过不激活细胞保护而发生的不可逆细胞死亡(图3)。
虽然顺铂诱导的DNA损伤增加了ROS产生，但Nrf2的同时上调可能激活了DNA修复通路，有助于平衡ROS水平并防止持续的凋亡信号。这种相互作用可能解释了为什么尽管ROS产生初始峰值，但顺铂处理导致较少的晚期凋亡。顺铂诱导的快速但短暂的氧化应激可能允许部分DNA修复并促进细胞存活，随着时间的推移，这可能导致耐药性的发展。相比之下，Qu-SeNPs似乎绕过了通常的检查点和抗氧化防御机制，导致持续的氧化应激，最终触发完全的线粒体介导的凋亡。
Qu-SeNPs增强的促凋亡活性可能是由于槲皮素和硒的综合作用。槲皮素在癌细胞中作为促氧化剂发挥作用，通过产生持续的ROS、抑制拓扑异构酶活性和调节氧化还原敏感信号通路来促进凋亡。硒通过将其掺入硒蛋白来补充这一作用，进一步增加ROS产生并削弱细胞的抗氧化防御。这种协同作用是Qu-SeNPs与顺铂相比具有优越抗癌潜力的基础。从治疗角度看，这些发现很重要，因为基于纳米颗粒的递送系统可以改善药物生物利用度，实现靶向递送到肿瘤细胞，并与传统化疗相比潜在地减少全身毒性。
然而，这项研究有一些局限性。我们的实验仅使用单一结肠癌细胞系进行，可能无法完全代表CRC的异质性。
结论与展望
本研究证明Qu-SeNPs表现出比顺铂更强的促凋亡活性，主要通过持续的药物释放、ROS产生、抑制适应性Nrf2介导的生存反应以及强烈激活内在线粒体凋亡通路。这些发现突显了Qu-SeNPs作为下一代靶向抗癌策略的潜力，具有增强的疗效和潜在降低的全身毒性。
然而，这项工作有一定的局限性，包括其对单一结肠癌细胞系(HCT116)的依赖。为了提高这项工作的转化相关性，未来的研究应在多种CRC细胞系和体内模型中评估Qu-SeNPs，以评估肿瘤靶向效率、生物分布和毒性。需要额外的机制实验来验证我们提出的模型，包括ROS依赖性实验。此外，应进行分子相互作用研究，以确定Qu-SeNPs是否直接或间接调节关键凋亡蛋白。通过解决这些问题，可以完全阐明Qu-SeNPs的治疗机制，支持其作为下一代靶向抗癌剂的潜力。
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