脑出血（ICH）是一种由脑实质内血管破裂引起的卒中类型，与高发病率和死亡率相关。约一半的ICH患者无法存活至第一年，而大多数幸存者会留下永久性残疾。因此，迫切需要更深入地了解疾病病理生理学，并开发有效的预防和治疗策略。
ICH风险随年龄增长而增加，在男性、亚洲人以及低收入和中等收入国家更为常见。遗传易感性也影响ICH风险，但迄今已识别的潜在风险位点寥寥无几。一项针对1545例ICH病例和1481例对照的全基因组关联研究（GWAS）在欧洲血统个体中识别出一个非脑叶ICH易感位点（染色体区域12q21.1）。大多数其他关于ICH的遗传研究采用了候选基因方法，并报告了与APOE基因型的强关联。在可改变的风险因素中，高血压和高收缩压已在传统观察性研究和基于血压相关遗传变异作为工具变量的孟德尔随机化（MR）研究中被发现与ICH风险增加密切相关。观察性和MR研究的证据进一步表明，吸烟和饮酒这两种相互关联的生活方式行为会增加ICH风险。其他心血管代谢和生活方式因素，如高脂血症、肥胖、2型糖尿病、体力活动和睡眠在导致ICH中的作用尚未明确。
现有的MR研究在探讨欧洲人群可改变风险因素与ICH风险潜在因果关联时，基于的病例数较少，且ICH基因型数据要么来自2014年发表的GWAS（包含1545例ICH病例和1481例对照），要么来自英国生物样本库（最多约1100例ICH病例）。在此，我们对来自三项大规模研究的全基因组基因型数据进行了荟萃分析，并利用由此获得的数据集（包含7605例ICH病例和711818例对照），通过MR分析识别ICH的可改变心血管代谢和生活方式因素。我们通过多变量MR分析，探讨了已识别风险因素的独立关联以及从风险因素到ICH的潜在代谢通路。尽管本研究的重点是揭示ICH的主要可改变风险因素，但GWAS分析的主要结果也将一并报告。
方法
数据可用性
GWAS荟萃分析的汇总统计数据可在OSF数据存储库中获取。
研究设计
图1展示了研究设计概览。我们首先对来自Finngen研究、英国生物样本库和Woo等人2014年GWAS的ICH GWAS数据进行了荟萃分析。随后，我们进行了单变量MR分析，以揭示传统心血管代谢风险因素（即肥胖相关特征、2型糖尿病和主要血糖特征、血脂特征和血压）和主要生活方式因素（即吸烟、饮酒和咖啡消费、体力活动和久坐、以及睡眠特征）与ICH风险的潜在因果关联，使用我们自己的ICH GWAS荟萃分析数据以及先前GWAS中与暴露相关的遗传变异作为工具变量。最后，我们进行了多变量MR分析，以探讨已识别风险因素与ICH之间的独立因果关联和中介通路。
数据来源
Finngen：Finngen是一个持续进行的项目，旨在通过遗传研究改善人类健康并促进治疗靶点的发现。该项目利用国家健康数据库和经过严格质量控制措施的全基因组基因型数据。简单来说，排除的相关个体、性别不确定者、非芬兰遗传血统者、高基因型缺失率或过多杂合度者。在遗传变异质量控制阶段，排除缺失率>2%、哈迪-温伯格平衡P<1×10^-6或最小等位基因计数<3的变异。我们使用了第九版Finngen GWAS汇总统计数据，包含3749例ICH病例和339914例对照。病例基于ICD代码定义：ICD-8和ICD-9的431，以及ICD-10的I61，数据来自住院、门诊和社会保险报销记录。关联检验调整了基因分型批次、年龄、性别和前十名主成分。Finngen研究已获得伦理批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。
英国生物样本库：英国生物样本库是一个数据库和研究计划，旨在支持科学发现以改善人类健康。该队列在2006年至2010年间招募了约50万英国成年人，收集了遗传数据和广泛表型信息。在本GWAS中，我们排除了缺乏遗传数据和非英国血统的个体。在样本质量控制阶段，我们移除了性别不确定者、相关个体（三级或更近）、高基因型缺失率个体以及杂合度显著偏离的个体。在变异质量控制阶段，我们移除了缺失率>10%、哈迪-温伯格平衡P<1×10^-6、最小等位基因频率<0.01的变异。ICH病例通过住院和门诊记录使用ICD代码识别：ICD-8和ICD-9的431，以及ICD-10的I61。我们的GWAS包含2311例ICH病例和370423例对照。关联估计使用REGENIE软件v2.0中的逻辑混合模型进行，并调整了基因分型批次、年龄、性别和前十名主成分。该研究获得了西北多中心研究伦理委员会的批准。所有参与者均提供了书面知情同意。
Woo等人GWAS：Woo等人GWAS的发现阶段包括了来自6项研究的欧洲血统个体。自发性ICH病例定义为新发急性神经功能缺损，伴有匹配的脑影像学显示存在脑实质内出血。排除标准包括创伤、缺血性卒中出血性转化、血管畸形、脑肿瘤和其他继发性ICH原因。对照组包括无ICH的个体，并从与病例相同的人群中招募。关于质量控制和插补程序的详细信息已在别处描述。发现阶段共纳入1545例ICH病例和1481例对照，该数据公开可用，并包含在本GWAS荟萃分析中。关联检验调整了年龄、性别和主成分。所有研究均获得了参与机构审查委员会或伦理委员会的批准。参与者本人或其法定代理人提供了知情同意。
GWAS荟萃分析
我们在固定效应模型下对Finngen、英国生物样本库和Woo等人GWAS的数据进行了荟萃分析，并评估了各研究之间单核苷酸多态性（SNP）-ICH关联估计的异质性。使用连锁不平衡（LD）评分回归量化基因组膨胀因子（λGC）。我们使用功能映射和注释全基因组关联研究来识别独立风险位点，使用1000 Genomes第3阶段数据集作为参考进行基于LD的聚类，设置阈值（GWAS显著性水平P<5×10^-8，物理距离阈值窗口>500 kb，LD阈值r²=0.6和r²=0.1）。主导SNP定义为该位点P值最小的变异。使用基因组注释的多变量分析进行基因映射。对于功能预测，工具包含了结合注释依赖耗竭（CADD）评分，该评分是量化单核苷酸变异有害性的指标。CADD评分较高的变异通常被认为更有害。当变异CADD评分超过10时，我们认为该位点可能具有有害功能影响。为了探索已识别位点的多效性效应，我们使用GWAS Catalog数据库交叉引用了我们的发现。我们应用LD评分回归评估ICH与缺血性卒中及其亚型、蛛网膜下腔出血和阿尔茨海默病之间的遗传相关性。
MR分析
为了识别ICH的潜在因果心血管代谢和生活方式风险因素，我们进行了两样本MR分析，使用先前GWAS中与暴露相关的遗传变异作为工具变量，以及来自本GWAS荟萃分析的ICH结局数据。暴露的数据来源详见补充表S1。本MR研究遵循STROBE-MR指南。我们通过选择在相关GWAS中在全基因组显著性水平（P<5×10^-8）下与每个暴露相关的SNP来构建遗传工具。对于每个暴露，我们使用1000 Genomes欧洲参考面板计算所选SNP的LD矩阵。对于高LD（r²>0.01）的SNP，我们仅保留与暴露关联最强的SNP（最小P值）。我们估计了每个暴露所用SNP的平均F统计量，以衡量遗传工具的强度。用作暴露工具变量的SNP及其汇总统计数据详见补充表S2。
我们使用乘法随机效应逆方差加权法获得主要MR估计值。为了评估这些估计值的稳健性，我们进行了敏感性分析，使用了加权中位数、MR-Egger和MR-PRESSO方法。我们使用Cochran Q值检验SNP估计值之间的异质性，并使用MR-Egger截距检验和MR-PRESSO全局检验评估水平多效性。为了探索暴露对ICH的独立和潜在中介效应，我们进行了多变量MR分析。中介效应使用公式计算：（总效应-直接效应）/总效应，中介估计的标准误使用误差传播法计算。鉴于与血脂特征相关的几个SNP位于APOE位点附近并与ICH强关联，我们对主要血脂特征进行了敏感性分析，排除了APOE位点上下±1 Mb的SNP。我们使用Benjamini-Hochberg错误发现率方法校正多重检验。所有MR分析均使用R版本4.1.1中的TwoSampleMR和MendelianRandomization包进行。
结果
GWAS结果
本GWAS荟萃分析共包含7605例ICH病例和711818例对照，结果识别出一个全基因组显著位点（P<5×10^-8），位于APOE位点（图2）。各研究的基因组膨胀因子（λGC）<1.04，荟萃分析中为1.06，表明由于人群分层或其他混杂因素导致的膨胀极小。主导变异（chr19:45411941, rs429358）在FinnGen和英国生物样本库GWAS数据的荟萃分析中，每增加一个C等位基因，ICH的优势比为1.17（95% CI, 1.11–1.20; P=6.01×10^-11）（该SNP在Woo等人GWAS中不可用，且无合适的替代SNP [LD r²>0.8]）。主导SNP的CADD评分为12.6，表明其在ICH中可能具有有害性。在GWAS Catalog数据库中的搜索揭示了APOE变异与血脂特征和阿尔茨海默病以及许多其他表型的多效性关联（补充表S3）。经多重检验校正后，ICH与所有缺血性卒中亚型和蛛网膜下腔出血显示显著遗传相关性（rg），但与阿尔茨海默病无关（补充表S4）。
MR结果
在单变量MR分析中，遗传预测的较高体重指数、内脏脂肪、舒张压、收缩压和终身吸烟指数，以及2型糖尿病的遗传易感性，在多重检验校正后与ICH风险增加相关（图3）。内脏脂肪、血压特征和2型糖尿病的SNP关联估计之间存在弱至中度异质性，但这些关联以及体重指数和终身吸烟指数的关联在敏感性分析中仍保持稳健（补充表S5）。遗传预测的较高腰臀比、甘油三酯、饮酒量和吸烟开始易感性在名义显著性水平（P<0.05）上与ICH风险增加相关（图3）；腰臀比和吸烟开始易感性的关联在敏感性分析中保持一致（补充表S5）。吸烟开始易感性的结果在使用来自排除英国生物样本库的GWAS分析的暴露效应大小估计值（β系数）的敏感性分析中保持一致（补充表S6）。遗传预测的饮酒量与ICH的关联在不同研究中存在差异，在英国生物样本库中呈显著正相关，在Woo等人GWAS中呈提示性正相关，在FinnGen中无关联（补充表S7）。我们未检测到任何血脂成分（除了与甘油三酯的边际关联）、空腹血糖、空腹胰岛素、咖啡消费、体力活动、休闲屏幕时间或任何睡眠特征与ICH的显著关联（图3）。在排除APOE位点上下±1 Mb的SNP后，血脂特征的缺乏显著关联仍然存在（补充表S8）。
多变量MR分析包括了所研究暴露的各种组合，提示遗传预测的舒张压和吸烟开始与ICH存在独立关联（补充表S9）。包含体重指数和2型糖尿病的多变量MR分析显示，体重指数的关联减弱。中介分析提示，遗传预测的体重指数与ICH的关联在很大程度上（>50%）由2型糖尿病介导（图4），尽管该分析不足以检测到显著的中介效应（补充表S10）。有提示性证据表明，吸烟开始遗传易感性与ICH的关联可能部分由舒张压（而非收缩压）和2型糖尿病介导（图4），但置信区间较宽，包括零（补充表S9）。吸烟开始和饮酒量的多变量MR分析发现，在全部三项研究的GWAS荟萃分析中，吸烟是与ICH相关的主要特征，但在英国生物样本库中，饮酒是与ICH相关的主要特征（补充表S9）。英国生物样本库中饮酒与ICH的关联在调整后减弱，并似乎在一定程度上由舒张压和收缩压介导（补充表S10）。在相互调整三种血脂特征的多变量MR分析中，血脂特征的缺乏关联仍然一致（补充表S9）。
讨论
在这项迄今为止规模最大的欧洲血统个体ICH GWAS（包含7605例病例和711818例对照）中，APOE被识别为ICH的主要遗传易感位点。我们基于本GWAS结局数据的MR分析提供了证据，表明高血压、吸烟、过度肥胖和2型糖尿病是ICH的风险因素。
APOE基因编码载脂蛋白E，在血浆和大脑的脂质代谢中起着核心作用，并且是阿尔茨海默病的强遗传风险因素。我们的GWAS和先前基于候选基因方法的研究表明，APOE位点也贡献于ICH的遗传易感性。例如，一项候选基因研究显示，APOE ε2和ε4基因型在全基因组显著性阈值下与脑叶ICH风险增加相关，而APOE ε2基因型在名义显著性水平（P<0.001）上与深部ICH风险增加相关。一项跨种族病例对照研究发现，APOE ε4基因型与白人和西班牙裔参与者脑叶ICH风险增加相关，但在黑人参与者中未发现。本GWAS荟（续上段）分析中未发现的主导APOE变异，这可能解释了该研究中APOE位点缺乏全基因组显著关联的原因。我们对所有ICH的GWAS荟萃分析未检测到其他可能风险位点（如COL4A1、COL4A2、12q21.1、1q22、GPX1、CR1、ITGAV和PRKCH）与所有ICH或其亚型具有全基因组显著关联，而这些位点曾被先前在欧洲人群中的研究提出。由于我们只研究了所有ICH，我们的发现对亚型特异性位点有所稀释。鉴于脑叶与深部ICH在组织病理学上的差异，需要进一步开展大规模、包含ICH亚型数据的GWAS来解析非APOE位点的意义。
关于可改变的风险因素，我们的MR结果证实了既往数据，将高血压和吸烟与ICH风险增加联系起来。在我们的多变量MR分析中，同时纳入舒张压和收缩压时，仅舒张压仍与ICH相关。我们的结果提供了提示性证据，即吸烟与ICH的关联可能在较小程度上由舒张压介导（不显著的约11%中介效应），而非收缩压。关于当前吸烟或持续吸烟者与舒张压水平关联的观察性研究结果不一，有报告正相关、负相关和无关联。综合来看，吸烟对血压的影响至多很小，吸烟与ICH的关联可能由舒张压以外的其他机制驱动。例如，正如我们的MR分析所提示的，吸烟-ICH关联可能部分由2型糖尿病介导。
自我报告的高量或重度饮酒（通常与当前吸烟共存）在观察性研究中与ICH风险增加相关。此外，基于中国慢性病前瞻性研究、英国生物样本库和Woo等人GWAS（非显著关联）数据的既往MR分析发现，遗传预测的饮酒量与较高的ICH风险相关。本MR分析证实了英国生物样本库中遗传预测的较高饮酒量与ICH的关联，以及Woo等人GWAS数据集中的非显著关联。英国生物样本库中饮酒与ICH的关联独立于吸烟，但似乎部分由血压介导，这符合预期，因为饮酒与血压有强关联。基于我们GWAS荟萃分析数据集得出的遗传预测饮酒量与ICH之间缺乏一致关联，这主要是由FinnGen研究中的零关联所致。这种缺乏关联可能表明，用于饮酒的遗传工具不能很好地预测FinnGen参与者中与饮酒相关的危害。
肥胖和2型糖尿病是相互关联的代谢特征，与许多慢性疾病相关，但此前这些特征与ICH关系的结果存在矛盾。涉及22个国家663例ICH病例和3000例对照的INTERSTROKE病例对照研究发现，高腰臀比与ICH风险增加相关。一致地，一项基于英国生物样本库数据的观察性分析显示，经体重指数调整的腰围与ICH风险呈正相关。此外，既往MR研究报告了遗传预测的体重指数或腰臀比与ICH的正相关。相反，在涉及712433名女性（n=2032例ICH病例）的百万女性研究中，观察到体重指数与ICH之间存在边缘性负相关。然而，该研究发现需要治疗的糖尿病与ICH风险增加31%相关。我们的MR分析发现，所有研究的肥胖指标和2型糖尿病易感性均与较高的ICH风险相关，而体重指数的关联可能主要由2型糖尿病介导。
血脂与ICH关系的发现模棱两可，而且方向与缺血性卒中（如动脉粥样硬化性）相反。INTERSTROKE研究的结果显示，高HDL胆固醇水平与较高的ICH风险相关，而高非HDL胆固醇水平与较低的ICH风险相关。在中国慢性病前瞻性研究的一项嵌套病例对照研究中，观察到LDL胆固醇每降低1 mmol/L与ICH风险增加16%相关，但在MR分析中为不显著的13%风险增加。与此一致，一项基于Woo等人GWAS中部分研究的MR研究报告了遗传预测的较高LDL胆固醇与较低ICH风险之间的显著关联。相比之下，其他基于Woo等人GWAS ICH数据的MR研究未检测到非HDL胆固醇或甘油三酯的任何关联，但其中一项研究发现，在调整非HDL胆固醇和甘油三酯的多变量MR分析中，较高的HDL胆固醇水平与ICH风险显著增加相关。一项包含英国生物样本库中1064例ICH病例的MR研究发现，遗传预测的较高HDL胆固醇和甘油三酯水平与较低的ICH风险显著相关。在我们的血脂与ICH风险MR分析中，ICH与继发性出血的混杂可能使结果偏向零。
在既往观察性研究中，体力活动与ICH风险无关，这与我们的MR结果一致。关于睡眠特征与ICH风险关系的研究很少。我们此前发现，在一个瑞典队列中，短睡眠时间（<7小时与7-9小时/天）与发生ICH的风险增加21%相关。本MR结果中短睡眠的关联为零，但估计值的精度较低，95%置信区间从0.71到1.31。我们还发现遗传预测的长睡眠或失眠与ICH无关联。与既往观察性和MR研究一致，我们未发现咖啡消费与ICH关联的证据。因此，体力活动、睡眠和咖啡消费不太可能是ICH的重要风险因素。
本研究的优势包括样本量大，并全面探索了潜在心血管代谢和生活方式风险因素对ICH的因果作用。一个缺点是未能研究ICH亚型。因此，我们可能忽略了仅与脑叶或深部ICH相关的ICH风险位点和可改变风险因素。另一个局限性是基于ICD的ICH定义以及Finngen和英国生物样本库中缺乏病例裁决。这可能通过纳入至少一定程度的编码错误病例（如继发于头部创伤、脑肿瘤、蛛网膜下腔出血和缺血性卒中出血性转化的出血）而增加了研究异质性。另一个缺点是，由于缺乏ICH的性别特异性数据，我们无法探索性别特异性关联。此外，由于我们将研究样本限制在欧洲血统个体（以减少人群分层偏倚），我们的结果可能无法推广到非欧洲人群。最后，我们没有复制样本来验证已识别的风险位点。然而，本GWAS中识别的基因组区域已在既往候选基因研究中被报道，因此我们的研究可被视为对先前发现的验证。
解释
我们的研究证实了APOE与欧洲血统人群ICH风险之间的关联。维持终生健康的血压，避免过度肥胖、2型糖尿病和吸烟，被确定为预防ICH的主要可改变风险因素。
文章信息
补充材料
STROBE-MR Checklist
表S1–S10
致谢
作者感谢Finngen、英国生物样本库研究的参与者和研究者，以及Woo等人GWAS的研究者分享汇总水平数据。英国生物样本库数据的分析是在申请号29202下进行的。Larsson博士和Yuan博士构思并设计了研究，并创建了数据可视化。Chen博士和Yuan博士进行了统计分析。Larsson博士撰写了文章初稿。所有作者都参与了数据解释，为文章提供了重要的学术见解，并批准了最终版本。
【全文结束】