乌干达HIV感染者和非感染者中B细胞亚群与亚临床冠状动脉疾病的相关性
背景
HIV-1感染者心血管疾病风险增加，这与慢性炎症、免疫失调和抗逆转录病毒治疗有关。B细胞调节免疫反应，但它们在HIV相关动脉粥样硬化中的作用尚不明确。
方法
在一项横断面研究中，我们在乌干达招募了40名HIV感染者和60名非感染者，按年龄和心血管疾病风险进行1:1.5匹配。通过质谱流式技术分析外周血单核细胞，以定义免疫细胞亚群。使用冠状动脉CT血管造影通过节段狭窄评分量化冠状动脉疾病。我们采用多变量障碍回归模型来评估免疫细胞簇、动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分、HIV感染状态和性别的效应量。
结果
中位年龄为60岁，不同HIV感染状态间无差异。HIV感染者中CCR7−幼稚B细胞的比例低于非感染者（中位1.5% vs 1.8%；校正后P值 = .03）。在所有参与者中，较高比例的CCR7−幼稚B细胞（比值 = 0.55，P = .02）、CXCR3+CX3CR1+B细胞（比值 = 0.54，P = .03）和浆母细胞（比值 = 0.57，P = .003）与较低的节段狭窄评分相关。HIV阳性状态与近3倍更高的节段狭窄评分相关（P < .01）。在分层分析中，经典单核细胞（CD14+CD16−）与HIV感染者中更高的节段狭窄评分相关。当经典单核细胞处于中位数时，较高的CCR7−幼稚B细胞在HIV感染者中具有保护作用（比值 = 0.55，P = .02）。
结论
这项探索性研究表明，HIV感染者中幼稚B细胞频率较低与亚临床动脉粥样硬化的差异相关。然而，本研究无法推断其机制。
心血管疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，在HIV-1感染者中负担更高。这种风险增加是由传统心血管疾病风险因素、抗逆转录病毒治疗相关的代谢效应和持续性免疫激活共同驱动的。尽管有效的抗逆转录病毒治疗，HIV感染者仍表现出残留的炎症和免疫失调，这 contributes to 动脉粥样硬化。
虽然T细胞和单核细胞在HIV感染者动脉粥样硬化中的作用已被广泛研究，但B细胞作为血管炎症的关键调节因子正日益受到认可。幼稚B细胞在慢性HIV感染期间减少，已被证明能分泌具有动脉保护作用的IgM抗体，清除氧化脂质并减少泡沫细胞形成。记忆B细胞和B细胞-单核细胞相互作用也可能 contribute to 加速斑块形成的促炎通路。
大多数研究B细胞在动脉粥样硬化中作用的研究是在小鼠模型中进行的，可用的人类数据有限。本研究旨在评估乌干达HIV感染者和非感染者中B细胞亚群与冠状动脉疾病严重程度之间的关联。我们假设HIV感染者的免疫失调，特别是幼稚B细胞的减少，与心血管疾病风险增加相关。
方法
研究设计和参与者
这是对mUTIMA（乌干达HIV对心肌和动脉粥样硬化影响研究）数据进行的横断面二次分析，该研究是一项于2017年至2019年间进行的前瞻性队列研究。本亚分析包括100名完成了冠状动脉CT血管造影的参与者，其中40名正在接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者，按1:1.5的比例与60名年龄相似且具有共同心脏代谢风险因素的非感染者进行匹配。原始队列的初始基线检查方法和结果已先前发表。
患者知情同意声明
mUTIMA研究获得了克利夫兰大学医院机构审查委员会、联合临床研究中心研究伦理委员会和乌干达国家科学技术委员会的批准。本研究的所有参与者均提供了知情同意，包括对储存样本进行未来分析的同意。范德比尔特机构审查委员会批准了对去标识化样本的质谱流式分析。
数据收集
收集了人口统计学数据、临床参数和心血管风险标志物。糖尿病和高血压定义为自我报告或医疗记录诊断或为此病症使用药物。10年动脉粥样硬化性心血管疾病风险使用2013年针对“其他”种族类别的合并队列方程进行估算。
冠状动脉CT血管造影
冠状动脉CT血管造影按照先前发表的方法进行。节段受累评分通过计数可检测到动脉粥样硬化的冠状动脉节段数量来确定，无论管腔狭窄程度如何。使用18节段模型，由于技术限制无法评估的节段，当其数量不多时假设为正常。节段严重程度评分通过根据管腔阻塞程度对每个病变节段分配权重来同时考虑冠状动脉疾病的范围和严重程度。权重范围从1（<25%阻塞）到5（完全闭塞）。节段严重程度评分通过将这些权重相加所有受累节段计算得出，最高可能得分为90。这些评分共同提供了冠状动脉疾病负担和严重程度的综合评估。有34名参与者的节段严重程度评分非零，其中HIV感染者11/40，非感染者23/60。
飞行时间质谱流式技术
我们使用质谱流式技术评估了免疫细胞类型。将冷冻保存的外周血单核细胞解冻、洗涤并重悬于染色培养基中，然后用金属偶联抗体面板标记，如先前发表所述。数据在Helios CyTOF上采集，根据制造商说明进行调谐，并使用EQ珠子进行标准化。
原始CyTOF FCS文件在附加样本运行日期后导出。使用五通道亮珠在原始FCS文件集上标准化标记强度，无需使用premessa R包的normalizer工具进行连接。使用CyTOF高斯波形参数去除低质量事件。不包括双联体，包括B细胞复合物。文件在TIME上门控以去除流体堵塞，并进行修整以排除不稳定的开始/结束期。去除了来自同位素质量重叠的CD4与CD8拖尾事件，同时忽略了罕见的+16氧化伪影。DNA门控排除了碎片，珠子排除确保了校准珠的完全去除。在FlowJo中对活的CD45+细胞进行门控。
每个亚群被导出用于独立分析。排除了非信息性标记。文件被连接、转换，并进行批次校正。使用统一流形逼近与投影进行可视化，Leiden聚类定义了群体。计算了聚类丰度，并在按HIV感染状态分层的组间进行比较。
统计分析
HIV感染者和非感染者之间的基线特征使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量，使用Pearson卡方检验比较分类变量。连续变量以中位数和四分位距报告，分类变量以频率和百分比报告。
结果变量节段严重程度评分范围从0到21，66%的参与者得分为零。零的过多和正值的偏态需要使用障碍回归模型。障碍模型将存在任何狭窄的二元过程与正值的条件分布分开。这比标准模型允许更准确和可解释的推断。这种方法明确解决了零膨胀和效应量的异质性，使其非常适合这种数据结构。
使用多变量障碍回归来估计免疫细胞簇、动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分、HIV感染状态和性别与节段严重程度评分之间的关联。免疫细胞簇进行平方根转换以改善正态性和模型拟合。为了评估关联是否因HIV感染状态或动脉粥样硬化性心血管疾病风险而异，我们纳入了交互项。我们还测试了幼稚B细胞是否改变了其他簇的效应。
连续预测因子的效应估计报告为比较上四分位数与下四分位数的节段严重程度评分比值，以及从障碍模型计数部分得出的95%置信区间和P值。使用森林图可视化效应量，并绘制了预测节段严重程度评分与动脉粥样硬化性心血管疾病风险或免疫细胞簇的关系图，包括总体和按HIV感染状态分层。
所有P值均为双侧，在比较不同HIV感染状态的免疫细胞簇时进行了多重比较校正。分析在R中执行，柱状图在GraphPad Prism中生成。
结果
人口统计学和临床参数
中位年龄为60岁，未观察到基于HIV感染状态的显著差异。女性占HIV感染者的62%和非感染者的57%。糖尿病在HIV感染者中比非感染者更普遍（82% vs 63%；P = .04）。他汀类药物使用率低（6%），各组间比率相当。HIV感染者的中位最低CD4+细胞计数为146 cells/mm3，中位抗逆转录病毒治疗持续时间为13年。大部分（86%）实现了完全病毒抑制（<20 copies/mL），没有HIV感染者的病毒载量>254 copies/mL。约25%的参与者使用蛋白酶抑制剂，7%使用整合酶链转移抑制剂，7%接受阿巴卡韦。HIV感染者的中位CD4+细胞计数为508 cells/mm3。两组在BMI和腰围方面无临床或统计学显著差异。HIV感染者的中位总胆固醇水平较高（224 mg/dL），但与非感染者（195 mg/dL，P = .10）相比无统计学显著性。
与HIV感染者相比，非感染者的幼稚B细胞比例显著更高
为了确定免疫细胞的差异，我们使用统一流形逼近与投影可视化了高维数据。以CD45+细胞为分母，我们区分了所有参与者血液样本中的CD8+ T细胞、单核细胞、CD4+ T细胞、NK细胞、gd T细胞、MAIT细胞、ILCs、NKT细胞和B细胞。在本研究中，我们重点关注B细胞亚群。热图显示了B细胞标记的差异表达。簇35由B细胞-T细胞-单核细胞复合物组成。其余簇由它们表达的额外标记定义。浆母细胞具有高CD38表达（簇45）。簇18由CD27+记忆B细胞组成，簇41由过渡性B细胞组成，簇25由CXCR3+CX3CR1+B细胞组成，其余为幼稚B细胞（簇1、16）。按HIV感染状态分层时，HIV感染者中CCR7−幼稚B细胞（簇16，P = .011）、记忆B细胞（簇18，P = .032）、B-T-单核细胞复合物（簇35，P = .0059）和浆母细胞（簇45，P = .017）的中位百分比较低。
HIV感染状态和动脉粥样硬化性心血管疾病风险独立塑造B细胞与节段严重程度评分的关联
为了研究B细胞亚群在冠状动脉疾病严重程度中的作用，我们使用障碍回归模型评估了它们与节段严重程度评分的关联。对于所有亚群，我们评估了HIV感染状态和动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分之间是否存在交互作用。我们将性别和糖尿病状态纳入模型，因为HIV感染者和非感染者之间的糖尿病患病率存在统计学差异。CCR7+幼稚B细胞（簇1）与节段严重程度评分的关联取决于动脉粥样硬化性心血管疾病风险的水平，但无统计学显著性（P = .098）。所有其他B细胞亚群的动脉粥样硬化性心血管疾病-节段严重程度评分曲线形状相似，节段严重程度评分与CXCR3+CX3CR1+B细胞（簇25，P = .026）和与T细胞和单核细胞复合的B细胞（簇35，P = .042）之间存在显著关联。然而，HIV阳性状态和非感染者中的动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分是节段严重程度评分的强独立风险因素。
幼稚B细胞簇和浆母细胞与节段严重程度评分呈负相关，而HIV感染状态和非感染者中的动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分与节段严重程度评分呈正相关。具体来说，CCR7−幼稚B细胞（簇16，比值0.55；P = .022）存在负相关，但CCR7+幼稚B细胞（簇1，比值0.76；P = .23）没有。有趣的是，浆母细胞（簇45）也与节段严重程度评分呈负相关（簇45，比值0.57；P = .003）。有一小簇B细胞位于CCR7+幼稚B细胞和记忆B细胞之间，即CXCR3+CX3CR1+B细胞（簇25）。这些细胞也与显著较低的节段严重程度评分相关（比值0.54；P = .031），并表现出动脉粥样硬化性心血管疾病依赖性关系，动脉粥样硬化性心血管疾病-节段严重程度评分关联因HIV感染状态而异（交互作用P = .04）。记忆B细胞（簇18，比值0.85；P = .43）与节段严重程度评分无关。其他亚群，包括过渡性B细胞和T-B细胞复合物，也不显著。
总之，HIV阳性状态和非感染者中的动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分是节段严重程度评分的强独立风险因素。在非感染者中，CCR7−-幼稚B细胞（簇16）、浆母细胞（簇45）与节段严重程度评分存在显著负相关，与HIV感染状态或动脉粥样硬化性心血管疾病风险无关。CXCR3+CX3CR1+B细胞（簇25）表现出与节段严重程度评分的动脉粥样硬化性心血管疾病依赖性关系。
CD57−GPR56+CX3CR1+CD8+记忆T细胞调整强化了记忆B细胞与节段严重程度评分之间的负相关关系
簇10，一个CD57−GPR56+CX3CR1+CD8+记忆T细胞亚群，以及其他亚群，在HIV感染者中的比例显著高于非感染者（中位2.1 vs 1.4，校正P < .01）。考虑到抗原呈递细胞（如B细胞和单核细胞）与T细胞的相互作用关系，我们评估了簇10是否调节记忆B细胞亚群（簇18）、CD14+单核细胞-B细胞复合物（簇35）与节段严重程度评分之间的关联。在所有参与者中，记忆B细胞（簇18）与较低的节段严重程度评分相关（比值 = 0.64；P = .052），而HIV阳性状态与较高的节段严重程度评分相关（比值 = 2.59；P = .041）。非感染者中的动脉粥样硬化性心血管疾病评分也与节段严重程度评分显著相关（比值 = 1.04；P = .004）。在所有参与者中，CD14+单核细胞-B细胞复合物（簇35）与节段严重程度评分也存在负相关，但不显著（比值 = 0.54；P = .096）。
在HIV感染者中，记忆B细胞簇18与节段严重程度评分之间的关联不显著（比值 = 0.58；P = .086）。然而，在非感染者中，簇18与较低的节段严重程度评分相关（比值 = 0.49；P = .032）。矛盾的是，在HIV感染者中糖尿病与较低的节段严重程度评分相关，但在非感染者中则不然。T细胞-单核细胞-B细胞复合物（簇35）在HIV感染者中与较低的节段严重程度评分相关（比值 = 0.27；P = .001），但在非感染者中则不相关（比值 = 0.49；P = .236）。在动脉粥样硬化性心血管疾病风险较高的个体中，簇18比例增加与节段严重程度评分降低相关（上四分位数，P = .028），但簇35则不然（上四分位数，P = .997）。在模型中纳入CD57−GPR56+CX3CR1+CD8+记忆T细胞（簇10）揭示了一个显著的负相关关系，特别是在非感染者中。这表明记忆B细胞对血管疾病负担的贡献可能被CX3CR1+CD8+T细胞的影响所掩盖，并且记忆B细胞对节段严重程度评分的影响是情境依赖的。
CCR7−幼稚B细胞（簇16）与非感染者中较低的节段严重程度评分相关
在整个队列中，节段严重程度评分随着簇16的增加而降低，这一趋势在所有动脉粥样硬化性心血管疾病风险水平中均一致，表明动脉粥样硬化性心血管疾病与簇16之间无有意义的交互作用（比值 = 0.42；P = .84）。森林图显示簇16与节段严重程度评分呈负相关（比值 = 0.35；P = .031），而HIV阳性状态与节段严重程度评分呈正相关（比值 = 2.91；P = .038）。
在HIV感染者中，CCR7−幼稚B细胞（簇16）与降低的节段严重程度评分无显著关联（比值 = 0.54；P = .15）。动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分与簇16之间无交互作用（比值 = 0.92；P = .12）。在非感染者中，幼稚B细胞与降低的节段严重程度评分显著相关（比值 = 0.22；P = .003）。在模型中纳入簇10并未改变簇16与节段严重程度评分之间的关系。CCR7−幼稚B细胞比例增加与非感染者中节段严重程度评分降低显著相关，该关联受到动脉粥样硬化性心血管疾病风险的修正（交互作用P = .02）。相比之下，在HIV感染者（交互作用P = .07）或整个队列（交互作用P = .41）中未观察到显著交互作用，这表明幼稚B细胞的保护作用可能在HIV背景下被减弱。
在HIV感染者中，幼稚B细胞对节段严重程度评分的保护性关联在经典单核细胞的背景下显现
单核细胞和CD8 T细胞都已被牵涉到动脉粥样硬化性心血管疾病的发病机制中。本队列中大多数CD8+ T细胞簇，包括簇9（CD8中央记忆T细胞）和簇11（CD8幼稚细胞），在HIV感染者中的比例显著高于非感染者。较高的CD4:CD8比值与HIV感染者中冠状动脉疾病风险降低相关。我们研究了CD8+中央记忆T细胞（簇9）和幼稚B细胞（簇16）在不同四分位数比较之间是否存在任何交互作用。在每个免疫细胞簇的高频率（四分位数3，Q3）与低频率（四分位数1，Q1）之间比较交互作用。此外，我们评估了按四分位数（Q1–Q3）分组的幼稚B细胞（簇16）的修正效应。因此，对于3个簇（CD8 T细胞-9和11；以及单核细胞-7），每一行代表T细胞和单核细胞簇与幼稚B细胞簇16的特定高/低频率组合。
在所有参与者中，较高比例的幼稚B细胞（簇16）与节段严重程度评分呈显著负相关。当簇9（CD8 T细胞）设定在中位数时，幼稚B细胞增加（Q3 vs Q1）与节段严重程度评分降低45%相关（比值 = 0.55, 95% CI: 0.32–0.94, P = .028），表明更好的临床结局。当簇7（经典单核细胞）保持在中位数时，簇16水平与节段严重程度评分无关联（比值 = 0.64, 95% CI: 0.35–1.16, P = .139）。最后，当簇11（幼稚CD8+ T细胞）保持在中位数时，较高的簇16水平与节段严重程度评分降低52%相关（比值 = 0.48, 95% CI: 0.27–0.84, P = .010），再次显示一致的保护作用。
在HIV感染者中，簇9（CD8中央记忆T细胞）在所有四分位数中均与节段严重程度评分呈负相关。当它们设定在中位数时，幼稚B细胞与节段严重程度评分之间的关系不显著（比值 = 0.65, 95% CI: 0.26–1.64, P = .36）。另一方面，簇7的所有四分位数均与节段严重程度评分呈正相关。当经典单核细胞保持在中位数时，较高水平的簇16与较低的节段严重程度评分相关（比值 = 0.55, 95% CI: 0.33–0.92, P = .022）。当幼稚CD8+ T细胞（簇11）保持在中位数时，幼稚B细胞与节段严重程度评分无显著关联（比值 = 0.81, 95% CI: 0.43–1.53, P = .51）。然而，在HIV感染者中，幼稚B细胞与幼稚CD8+ T细胞之间的交互作用显著（交互作用P = .020），表明幼稚B细胞与节段严重程度评分的关联随幼稚CD8+ T细胞的频率而变化，尽管在中位数时未见效应。
在非感染者中，高幼稚B细胞与显著较低的节段严重程度评分相关，除非在模型中纳入经典单核细胞。总体而言，数据表明较高频率的幼稚B细胞主要与非感染者中的有利结局（较低节段严重程度评分）相关。在HIV感染者中，这种保护性关联仅在考虑经典单核细胞时才明显，而在CD8+ T细胞的背景下则未观察到。相反，经典单核细胞本身始终与较高的节段严重程度评分相关。
讨论
在这项探索性研究中，我们观察到HIV感染者和非感染者之间循环B细胞亚群的差异，并且几个免疫群体与亚临床冠状动脉疾病的测量指标存在关联。尽管接受了长期抗逆转录病毒治疗，与HIV阴性者相比，感染者的幼稚、记忆和CXCR3+CX3CR1+B细胞亚群以及浆母细胞的频率较低。虽然这些发现与先前对HIV相关B细胞改变的描述一致，但尚未研究其对HIV感染者心血管疾病的影响。几个B细胞亚群与节段严重程度评分表现出不同的关联。幼稚B细胞和浆母细胞可能具有保护作用，如与节段严重程度评分的负相关所示。在HIV感染者中，当包含经典单核细胞时，幼稚B细胞与节段严重程度评分之间的负相关更清晰，表明单核细胞驱动的炎症可能掩盖了B细胞的保护作用。总之，我们观察到B细胞亚群与节段严重程度评分之间的负相关在非感染者中最强，而在HIV感染者中，这种关系主要是在模型中包含经典单核细胞时才可检测到。
幼稚B细胞表达的IgM已被牵涉到清除氧化脂质和抑制炎症级联反应中。我们发现幼稚B细胞频率与节段严重程度评分呈负相关，尤其是在动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分较高的个体中。这些发现具有假设生成性，并激励未来的研究确定幼稚B细胞相关的免疫特征是否与已确立的心血管风险因素相互作用。
CCR7通过其配体CCL19/CCL21引导淋巴细胞归巢到次级淋巴组织，并支持B细胞进入淋巴结，与CXCR4/CXCR5一起。CCR7+幼稚B细胞可能反映了淋巴归巢、生发中心胜任的表型，而CCR7−幼稚B细胞可能更倾向于循环，并由慢性炎症塑造。除了经典的淋巴归巢外，人类B细胞上的CCR7表达是变化的，慢性HIV感染会扰乱这一轴；研究报告了耗竭/组织样记忆B细胞中CCR7减少和更广泛的运输受体破坏。在这种情况下，CCR7−幼稚B细胞与HIV感染者冠状动脉疾病测量指标之间的负相关可能反映了慢性HIV感染期间B细胞运输的更广泛破坏，但这种关系仍是探索性的，需要在更大规模的研究中进行验证。
细胞间复合物是动态的细胞相互作用，可能 contribute to 炎症，据报道在患有糖尿病的HIV感染者中增加，可能 contribute to 心脏代谢疾病的发病机制。单核细胞的作用在本研究中值得注意：在HIV感染者中，经典单核细胞与节段严重程度评分呈正相关，这与单核细胞活化和HIV血管功能障碍之间的既定联系一致。相比之下，涉及B细胞的细胞间复合物在HIV感染者中与节段严重程度评分呈负相关；这一观察结果很有趣，但其生物学相关性仍不清楚。
传统的动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分仍然有价值，但未能捕捉到免疫失调。先前的研究表明，这些模型可能低估慢性炎症状态下的风险。综上所述，这些发现表明，HIV感染者和非感染者之间的免疫谱不同，与亚临床冠状动脉疾病测量指标存在独特的关联模式。然而，鉴于样本量适中、亚组设计以及对照组异质性临床特征，这些观察结果无法确定因果关系或方向性。相反，它们指出了值得进一步研究的领域，特别是在HIV背景下幼稚B细胞、单核细胞驱动的炎症和血管疾病三者之间的关系。
结论
幼稚B细胞与冠状动脉疾病负担呈负相关，尤其是在具有高风险动脉粥样硬化性心血管疾病的非感染者中。另一方面，经典单核细胞与HIV感染者中更高的节段严重程度评分相关。这些结果表明，免疫分析可以增强预测模型。需要更大队列、详细机制评估的纵向研究来阐明这些关系，并评估免疫表型是否可以补充HIV中现有的心血管风险分层方法。
局限性
虽然这些发现为HIV感染者中B细胞亚群的变化及其对心血管风险的潜在贡献提供了有价值的见解，但应考虑几个局限性。首先，动脉粥样硬化性心血管疾病风险评分虽然被广泛使用，但可能无法捕捉风险因素的全谱，特别是在HIV中，传统风险预测模型可能低估心血管事件。尽管我们对关键混杂因素进行了调整，但未测量的因素，如炎症生物标志物、抗逆转录病毒治疗持续时间和生活方式影响，仍可能 contribute to 观察到的关联。相对较小的样本量以及纳入了具有现有心脏代谢风险因素的非感染者，限制了我们将HIV感染状态的影响与共享合并症分开的程度。因此，研究结果应被解释为假设生成性的。此外，本研究是观察性的；无法进行因果推断。未来的研究需要使用机制方法和纵向设计来进一步探讨免疫细胞亚群在HIV相关心血管风险中的作用。
补充数据
补充材料可在Open Forum Infectious Diseases在线获取。包含由作者提供以惠及读者的数据，发布材料未经编辑，由作者全权负责，因此问题或意见应联系通讯作者。
注释
资金来源. 本研究部分由美国国家心肺血液研究所、多丽丝·杜克慈善基金会和宝来惠康基金资助。内容由作者全权负责，不一定代表资助方的官方观点。
【全文结束】