血清微生物组相关代谢物——包括短链脂肪酸和吲哚衍生物——预测动脉瘤性蛛网膜下腔出血后的结果和迟发性脑缺血：一项双时间点LC–MS研究

摘要

背景： 迟发性脑缺血（DCI）仍然是动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）后预后不良的主要决定因素。越来越多的证据表明，肠道微生物群衍生的代谢物，包括短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸相关的吲哚化合物，可调节神经炎症和脑血管脆弱性。然而，它们在aSAH后的时间动态和临床相关性尚未得到充分表征。

方法： 在这项前瞻性观察性研究中，我们在三级神经重症监护中心连续纳入了80例aSAH患者。在出血后第1天和第9天，使用LC–MS定量检测了血清中SCFAs（丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸）和色氨酸衍生代谢物（色氨酸、吲哚-3-丙酸[IPA]、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸）的浓度。使用改良Rankin量表（mRS）评估3个月时的功能结局，并根据共识标准诊断DCI。使用非参数统计、ROC分析以及针对已确定的临床混杂因素进行调整的多变量逻辑回归分析关联性。

结果： 3个月预后不良（mRS 4–6）的患者在第1天表现出显著较低的丙酸、异丁酸和异戊酸水平，两个时间点的色氨酸持续降低，以及第9天IPA浓度显著降低。DCI与两个时间点的色氨酸和丙酸水平降低以及第9天IPA的显著降低相关。色氨酸和丙酸对结局和DCI表现出极佳的区分性能（AUC最高达0.99）。在多变量模型中，低第1天丙酸和低第9天IPA独立预测不良结局，而第9天色氨酸、IPA和丙酸独立预测DCI。

结论： aSAH后肠道微生物群衍生代谢物的不同时间变化与功能结局和DCI密切相关。SCFAs和色氨酸相关代谢物——特别是丙酸、色氨酸和IPA——成为aSAH后继发性脑损伤的有前景的生物标志物和潜在机制性介质。

1 引言

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）是一种破坏性的脑血管事件，约占所有脑卒中的5-10%，但对发病率和死亡率的贡献却不成比例（1）。流行病学分析显示，28天死亡率接近25-30%，在幸存者中，近一半从未恢复到发病前的功能水平（1, 2）。除了最初的出血，继发性并发症在患者结局中起着关键作用。其中，迟发性脑缺血（DCI）仍然是最具临床意义的晚期后遗症，显著恶化神经功能恢复和长期预后（3）。近年来，越来越多的关注指向肠-脑轴作为与急性脑损伤相关的神经炎症和神经血管过程的关键调节因子（4, 5）。肠道微生物群及其代谢物——包括短链脂肪酸（SCFAs；如丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸）和色氨酸衍生的吲哚化合物（例如，吲哚-3-丙酸（IPA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乳酸（ILA）和色氨酸本身）——已成为脑血管脆弱性和卒中后恢复的潜在贡献者（4-7）。SCFAs已知可增强肠道屏障、发挥抗炎作用并调节全身免疫反应，从而影响神经损伤的严重程度和轨迹（4-8）。缺血性卒中的临床和实验研究表明，产SCFA细菌的丰度降低和粪便SCFA水平降低与更严重的神经功能缺损和较差的90天结局相关（7, 8）。相反，在动物模型中移植富含SCFA的微生物群可增强卒中后的神经行为恢复，支持微生物群衍生代谢物在神经保护中的因果作用（9）。肠道微生物群介导的色氨酸代谢紊乱通过影响肠-脑轴在缺血性卒中病理学中发挥重要作用，靶向关键的色氨酸代谢途径及其代谢物可能提供有前景的治疗途径（10），因为吲哚-3-丙酸（IPA）作为一种特别有前景的神经保护性色氨酸代谢物，通过抗氧化、抗炎、受体介导和神经营养机制发挥作用，从而破坏肠道-炎症-大脑循环，并可能延迟或减轻神经退行性和缺血性脑疾病（11）。Klepinowski等人证明，aSAH后发生脑血管痉挛或迟发性脑缺血的患者表现出肠道微生物群多样性的早期改变——特别是产丁酸盐的分类群减少——提示与这些并发症相关的微生物特征（12）。最近的一项研究发现，与未破裂动脉瘤患者相比，破裂颅内动脉瘤患者表现出显著不同的肠道微生物组成，包括产SCFA细菌分类群和相关代谢途径的转变（13）。综上所述，这些观察结果强调了肠道微生物群、其代谢产物和脑血管疾病过程之间生物学上合理且临床相关的相互作用。在此背景下，我们的研究旨在使用液相色谱-质谱联用（LC–MS）——一种将色谱分离与质谱检测相结合的分析平台，用于灵敏和特异性地定量代谢物——在aSAH后的两个时间点（第1天和第9天）定量检测血清中关键SCFAs和色氨酸衍生代谢物（IPA、色氨酸、吲哚乙酸、吲哚乳酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸）的水平。通过表征其时间谱及其与临床结局的关联，我们试图探索它们在aSAH和DCI病理生理学中作为生物标志物或机制性介质的潜在作用。基于先前将肠道微生物群衍生代谢物与神经炎症、血管功能障碍和卒中后恢复联系起来的证据，我们提出了先验假设，即循环中SCFAs和微生物群衍生色氨酸代谢物——特别是丙酸、色氨酸和IPA——水平的降低将与aSAH后3个月不良功能结局相关。此外，我们假设这些代谢物的早期改变将预测DCI的后续发展，反映了失调的肠-脑-免疫轴导致继发性脑损伤。

2 材料和方法

2.1 参与者与研究设计

本前瞻性观察性研究的机构伦理批准在患者入组前已获得（IV/8468-1/2021/EKU，2021年10月27日；BM/4629-1/2024），并在参与前获得了所有患者或其法定代表人的书面知情同意。2023年9月至2025年7月期间，在我们三级神经重症监护中心连续诊断为aSAH的成年患者被纳入。纳入标准为：（i）年龄≥18岁；（ii）通过非增强头颅CT确认aSAH，并通过CTA或DSA验证颅内动脉瘤；（iii）在发病后24小时内确诊。排除标准包括：创伤性SAH、妊娠、入院延迟（发病后>24小时）、未治疗动脉瘤、动静脉畸形相关出血、缺乏知情同意，或存在潜在慢性全身性疾病——包括恶性肿瘤、肝或肾功能不全、慢性肺病、炎症性肠病或任何已知的慢性胃肠道疾病。其他排除标准包括入院时存在慢性或急性感染，以及初始出血事件后发生再破裂或临床恶化。对于所有符合条件的患者，系统收集了全面的临床数据，包括人口统计学特征、血管危险因素、临床表现、神经功能严重程度评分（WFNS和改良Fisher量表）、放射学发现以及住院期间进行的所有神经重症监护干预措施，如机械通气、脑室外引流或腰大池引流以及减压手术。还记录了入院时的实验室参数——包括C反应蛋白、肌酐、白细胞计数和中性粒细胞-淋巴细胞比率。在预先指定的两个时间点采集用于代谢组学测量的血样：第1天（D1），在出血急性期（在发病后24小时进行动脉采血）；第9天（D9），对应于DCI风险最高时期（在发病后216±4小时内进行动脉采血）。使用LC–MS分析定量检测血清中短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸衍生的吲哚代谢物水平。所有患者在指标事件后随访3个月，通过结构化的电话或面对面评估，由经过正式mRS认证且对生物标志物数据不知情的训练有素的评估员进行。未进行正式的预先样本量计算。本研究设计为一项前瞻性探索性观察性研究，患者入组基于在我们三级神经重症监护中心预定招募期间内的连续纳入。在研究计划时，关于aSAH中循环SCFA和吲哚代谢物效应量的先前数据不足以进行可靠的功效估计。因此，样本量反映了研究期间内符合条件的患者总数。

2.2 临床定义、数据收集方法和结局评估

在入院时和整个急性住院期间，前瞻性地收集所有入组患者的临床数据。系统记录了人口统计学变量、血管危险因素（高血压、糖尿病、缺血性心脏病、吸烟史）和临床表现特征——包括发病时意识丧失。初始神经功能严重程度使用世界神经外科学会联合会（WFNS）量表进行评估，而蛛网膜下腔出血范围使用改良Fisher（mFisher）量表进行分级。动脉瘤位置、放射学发现以及需要神经外科或神经重症监护干预措施——如腰大池引流、脑室外引流（EVD）、机械通气和减压开颅术——均从临床图表和影像报告中提取。入院时获得的实验室参数包括C反应蛋白、肌酐、白细胞计数和中性粒细胞-淋巴细胞比率。主要临床结局是3个月时的功能状态，使用改良Rankin量表（mRS）评估，良好结局定义为mRS 0-3，不良结局定义为mRS 4-6。迟发性脑缺血（DCI）根据Vergouwen等人（3）提出的2010年共识标准定义为：（i）出现新的局灶性神经功能缺损或格拉斯哥昏迷量表评分下降至少2分，持续≥1小时，且在临床和放射学评估后不能归因于再出血、脑积水、癫痫发作、代谢紊乱、感染或其他可识别原因；和/或（ii）在随访CT或MRI上出现新的脑梗死，该梗死未出现在治疗后的即刻扫描中，且不能归因于手术并发症或其他原因。在没有临床恶化或放射学确认的梗死的情况下，有症状的脑血管痉挛不足以诊断DCI。诊断由至少两名对生物标志物数据不知情的经验丰富的神经重症监护医师达成一致。这些结局类别用于所有后续的代谢物浓度比较分析。还记录了住院期间感染并发症的发生情况。用于代谢组学分析的血样在aSAH后第1天（D1）和第9天（D9）获取。在进行LC–MS分析之前，根据标准化方案处理并储存血清。定量检测的代谢物包括短链脂肪酸（丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸）和吲哚衍生的色氨酸代谢物（吲哚-3-丙酸、色氨酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-乳酸）。

2.3 基于LC–MS的代谢物测定

液相色谱-质谱联用（LC–MS）是一种分析技术，它将化合物的色谱分离与基于质量的检测相结合，能够在复杂生物样品中精确定量小分子代谢物。短链脂肪酸（SCFAs）和吲哚衍生物按照已建立的方法（14）进行定量，并进行了若干修改。将人血清样品在4°C下使用Genie 2涡旋仪（Scientific Industries, Bohemia, NY, USA）在持续振荡下解冻30分钟。将60微升血清与420微升冰冷的甲醇（Supelco 1.06035）在1.5 mL微量离心管中混合以沉淀蛋白质。样品在1000 rpm下涡旋10分钟，然后在4°C下以15,000 rpm离心10分钟以获得血清提取物。将60微升所得上清液在冰上与30微升0.2 M 3-NPH和30微升0.12 M EDC混合。反应在40°C下孵育25分钟，不振荡，然后在4°C下以15,000 rpm离心10分钟。将澄清的上清液转移至HPLC小瓶（VP91, Zhejiang Aijiren Technology Inc., Qujiang, Quzhou, Zhejiang, China）中，并用PTFE/硅胶隔垫（SC9291, Zhejiang Aijiren Technology Inc.）密封。SCFAs在Waters HSS T3色谱柱（1.7 μm, 2.1 × 100 mm）上进行分离，使用Waters ACQUITY Premier UPLC串联Waters TQS-Micro三重四极杆质谱仪。流动相A由LC–MS级水（VWR 83645.320）和0.1%甲酸（Sigma 5.33002）组成，流动相B由0.1%甲酸的2-丙醇（VWR 84881.320）：乙腈（VWR 83640.320）溶液组成。进样量为3 μL，流速为0.3 mL/min。LC梯度程序如下：0-0.2 min，0% B；0.2-0.7 min，0-15% B；0.7-2 min，15% B；2-6 min，15-30% B；6-12 min，30-72% B；12-12.4 min，72-100% B；12.4-14 min，100% B；14-14.1 min，100-0%# 全文：

2.4 统计分析

所有统计分析均使用 IBM SPSS Statistics 版本 25 （IBM Corp., Armonk， NY, United States）和 GraphPad Prism 版本 10 （GraphPad Software， LLC, San Diego， CA, United States）进行。使用直方图、Q-Q 图和 Shapiro-Wilk 检验检查连续变量的分布特征。由于大多数生化和临床参数呈现非正态分布，因此除非另有说明，否则在整个分析中均应用非参数检验。使用列联表统计对分类变量进行分析。双侧 p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。基线人口统计学和临床特征被总结为：正态分布变量的平均值 ± 标准差（SD），非正态分布数据的中位数和四分位距（IQR），以及分类变量的频率和百分比。使用以下方法进行组间比较（3 个月功能结局良好 vs. 不良）：对于近似正态分布的连续变量，采用独立样本 t 检验；对于非正态分布的连续数据（例如，WFNS、mFisher 评分、炎症标志物），采用 Mann-Whitney U 检验；对于分类变量（例如，高血压、糖尿病、动脉瘤位置、DCI），酌情采用卡方检验或 Fisher 精确检验。比较了第 1 天和第 9 天测量的 SCFAs 和吲哚衍生代谢物的血清浓度在临床亚组之间的差异。对于每种代谢物，由于非参数分布和方差不齐，使用 Mann-Whitney U 检验分析组间差异（良好 vs. 不良结局；DCI 与无 DCI）。结果以带有中位数、IQR 和完整数据范围的箱线图形式呈现。使用标准符号表示统计学显著性（p < 0.05；p < 0.01；p < 0.001；p < 0.0001）。考虑到生物标志物比较的数量，应用了 Benjamini-Hochberg 程序的错误发现率（FDR）校正作为敏感性分析。为了评估单个代谢物对预测（i）3 个月不良结局和（ii）迟发性脑缺血（DCI）发展的区分性能，对每个时间点（第 1 天和第 9 天）的每种代谢物进行了 ROC 曲线分析。对于每个 ROC 模型，计算了以下内容：曲线下面积（AUC）及其 95% 置信区间（DeLong 方法），由 Youden 指数定义的最佳截止值处的灵敏度和特异性，以及 AUC 显著性检验的相应 p 值。ROC 分析针对每种代谢物分别以单变量方式进行的，未针对临床协变量进行调整。仅在多变量逻辑回归模型中对已建立的临床预测因子进行了调整。为了评估选定代谢物与临床结局之间的独立关联，构建了针对以下指标的多变量逻辑回归模型：3 个月功能结局（良好 vs. 不良），以及 DCI 的发生。每个模型都包括了基于已知预后相关性预先选择的临床协变量，以控制混杂因素：结局预测模型（表 1）：年龄、WFNS 分级和感染状态。DCI 预测模型（表 2）：年龄、高血压和改良 Fisher 评分。对于每种代谢物（在单独的模型中分析）：计算了每单位代谢物浓度增加的比值比（OR）和 95% 置信区间（CI），Wald χ² 统计量评估了预测因子的显著性。模型性能由 Nagelkerke R² 总结，反映了解释的方差。为了评估两个时间点 SCFAs 和吲哚衍生代谢物之间的相互关系，计算了 Spearman 秩相关系数。相关矩阵以热图形式可视化，使用从 −1 到 +1 的颜色梯度。检查了第 1 天和第 9 天水平之间的自相关，以评估代谢物模式的时间稳定性。

3 结果

3.1 患者特征

共有 131 名患者接受了资格筛选。其中，患者因以下原因被排除：创伤性蛛网膜下腔出血（n = 4），入院延迟（n = 6），动静脉畸形相关出血（n = 1），慢性全身性疾病（n = 12），慢性阻塞性肺疾病（n = 3），慢性胃肠道疾病（包括炎症性肠病、乳糜泻相关疾病和胃炎；n = 4），生物标志物采样不完整（n = 11），失访（n = 6），治疗前动脉瘤再破裂（n = 1），以及慢性感染或未明确的免疫性疾病（包括肾盂肾炎；n = 3）。排除后，80 名患者被纳入最终分析。所有纳入的患者均接受了血管内治疗；没有患者接受开颅夹闭术。整个队列的平均年龄为 58 ± 11 岁，良好结局组患者稍年轻（56 ± 9 岁），而不良结局组为 60 ± 13 岁。女性占研究人群的 74%，良好组占 64%，不良组占 84%。所有患者中高血压占 56%，糖尿病占 11%，后者在结局不良的患者中更常见（18% vs. 5%）。吸烟率为 49%，各结局组比例相当。缺血性心脏病占队列的 50%，良好组占 43%，不良组占 57%。发病时意识丧失占所有患者的 35%。基线临床严重程度在组间差异显著：良好组的中位 WFNS 评分为 1（IQR 1-2），不良组为 4（IQR 2-5）；而中位改良 Fisher 评分分别为 2（IQR 2-3）和 3（IQR 3-4）。炎症标志物显示出显著差异，良好组的中位 C 反应蛋白水平为 7 mg/L（IQR 2-13），不良组为 29 mg/L（IQR 9-73）；中性粒细胞-淋巴细胞比率分别为 4.2（IQR 3-7）和 9.1（IQR 5-12）。在接受抗生素治疗的感染患者中（n = 31），抗生素治疗在 D1 采样后中位 7 天开始（IQR 7-8；范围 4-10）。需要脑室外引流（10% vs. 71%）和机械通气（7% vs. 82%）在不良结局组中更为常见，并且该组的迟发性脑缺血和感染也更为普遍（分别为 53% 和 68%）（表 1）。

3.2 SCFAs、IPA 和色氨酸代谢物与 aSAH 后 3 个月结局的关联

图 1 显示了根据 3 个月功能结局，D1 和 D9 时短链脂肪酸（SCFAs）、IPA 和色氨酸的血清浓度。对于 IPA（图 1A），Fav-D1 和 Unfav-D1 之间未出现显著差异（ns），而 Fav-D9 的浓度显著高于 Unfav-D9（p < 0.0001）。色氨酸（图 1B）水平在 Fav-D1 组显著高于 Unfav-D1 组（p < 0.0001），并且在 Fav-D9 和 Unfav-D9 之间也观察到类似强烈的差异（p < 0.0001）。丙酸（图 1C）水平在不良结局组中第 1 天显著降低（p < 0.001），而在 D9 未观察到差异。异丁酸（图 1D）在组间也存在差异，不良组在 D1（p < 0.05）和 D9（p < 0.0001）浓度均较低。相比之下，丁酸（图 1E）在两个时间点均未显示出显著差异。异戊酸（图 1F）在不良结局组中 D1 显著降低（p < 0.05），而第 9 天水平在组间无差异。戊酸（图 1G）和己酸（图 1H）在第 1 天或第 9 天均未显示出显著差异（所有 p > 0.05）。吲哚乙酸（图 1I）水平在两个时间点组间均无显著差异（两个比较均标记为 ns）。同样，吲哚乳酸（图 1J）在第 1 天或第 9 天，Fav 和 Unfav 组之间也未显示出显著差异（两个比较均为 ns）。

ROC 分析显示，色氨酸（图 2A，B）在两个时间点均提供了出色的区分性能。在第 1 天，色氨酸的 AUC 达到 0.990（95% CI：0.97-1.00，p < 0.0001），灵敏度为 97.5%，特异性为 97%。同样，在第 9 天，其 AUC 仍保持高位 0.980（95% CI：0.94-1.00，p < 0.0001），同样具有 97.5% 的灵敏度和 97% 的特异性。第 9 天测量的吲哚-3-丙酸（图 2C）的 AUC 为 0.873（95% CI：0.79-0.95，p < 0.0001），伴随 90.5% 的灵敏度和 75.8% 的特异性。第 1 天的丙酸（图 2D）表现出中等 AUC 0.734（95% CI：0.62-0.85，p < 0.001），灵敏度和特异性分别为 82.5% 和 59.5%。第 1 天的异丁酸（图 2E，F）的 AUC 为 0.688（95% CI：0.57-0.81，p < 0.005），灵敏度为 67.5%，特异性为 59.5%，而在第 9 天，其 AUC 增加到 0.780（95% CI：0.68-0.88，p < 0.001），灵敏度为 73.2%，特异性为 65.6%（图 2）。

多变量逻辑回归模型——包括年龄、WFNS 分级和感染状态作为协变量——评估了选定代谢物与 aSAH 患者 3 个月结局的关联。第 1 天的丙酸与 3 个月结局显著相关（OR = 0.49，95% CI 0.29-0.81；Wald χ² = 7.6；p = 0.006；R² = 0.68）。第 9 天测量的 IPA 显示出与结局的强关联（OR = 0.09，95% CI 0.02-0.38；Wald χ² = 10.7；p = 0.001；R² = 0.70）。第 1 天的色氨酸显示出接近显著的关系（OR = 0.53，95% CI 0.28-1.00；Wald χ² = 3.8；p = 0.051；R² = 0.64）。其他代谢物——如第 1 天（OR = 0.95，p = 0.842）和第 9 天（OR = 0.67，p = 0.01）的异丁酸，以及第 1 天的异戊酸（OR = 0.28，p = 0.026）——显示出与 3 个月结局的关联性不同，Nagelkerke R² 值范围为 0.64 至 0.67（表 2）。

在 3 个月结局的增量价值分析中，将第 1 天丙酸添加到基线临床模型（包括 WFNS、年龄和协变量）中显著改善了模型拟合（Δχ² = 13.45，df = 1，p < 0.001）。区分度从单独临床模型的 AUC 0.862（95% CI 0.770-0.954）增加到加入丙酸后的 0.916（95% CI 0.845-0.986）。模型校准仍然可接受（Hosmer-Lemeshow p = 0.142）。这些发现表明，第 1 天丙酸提供了超越已建立临床严重程度测量的增量预后价值。

在使用 Benjamini-Hochberg 程序进行错误发现率（FDR）校正后，主要的关联（第 1 天丙酸、第 1 天和第 9 天色氨酸以及第 9 天 IPA）仍然具有统计学意义。

3.3 SCFAs、IPA 和色氨酸代谢物与 aSAH 后 DCI 的关联

代谢物分析揭示了发生 DCI 的患者和未发生 DCI 的患者之间不同的浓度模式（图 3）。IPA 水平（图 3A）在 D1 无显著差异（ns），而在 D9 观察到 DCI 患者显著降低（p < 0.0001）；相应地，IPA 在 D1 表现出中等预测性能（AUC = 0.672），在 D9 表现出显著更高的准确性（AUC = 0.812）（图 3F，G）。色氨酸浓度（图 3B）在 DCI 患者中 D1（p < 0.0001）和 D9（p < 0.001）均显著降低，其 ROC 曲线（图 3J，K）在两个时间点均表现出出色的区分能力（D1 AUC = 0.823，D9 AUC = 0.824）。丙酸（图 3C）同样显示出强烈的组间差异，在无 DCI 的患者中 D1（p < 0.001）和 D9（p < 0.0001）水平升高；其预测性能（图 3H，I）在两个时间点均保持一致的高水平（D1 AUC = 0.762，D9 AUC = 0.811）。相比之下，异戊酸（图 3D）仅在 D1 显示出显著差异（p < 0.05），而在 D9 无差异（ns），而其预测能力（图 3L）在 D1 保持中等（AUC = 0.664）。己酸（图 3E）遵循类似模式，在 D1 时 DCI 患者中显著降低（p < 0.01），但在 D9 无差异，D1 的 AUC 为 0.737（图 3M）。色氨酸和丙酸成为区分 DCI 和非 DCI 患者的最强指标，其持续的组间差异和高 AUC 值支持了这一点，而 IPA 在较晚的时间点显示出改善的预测价值。

同样，对于 DCI，关键的关联（第 1 天和第 9 天色氨酸、第 9 天丙酸和第 9 天 IPA）在 FDR 校正后仍然显著。

另一个多变量逻辑回归模型——包括年龄、高血压和 mFisher 评分作为协变量——评估了几种代谢物与 aSAH 患者发生迟发性脑缺血（DCI）的关联。第 1 天测量的 IPA 与 DCI 无显著关系（OR = 0.55，95% CI 0.17-1.82；Wald χ² = 0.9；p = 0.329；R² = 0.34），而第 9 天的 IPA 与 DCI 显著相关（OR = 0.13，95% CI 0.02-0.86；Wald χ² = 4.5；p = 0.034；R² = 0.50）。第 1 天的色氨酸水平与 DCI 无关（OR = 0.87，p = 0.731），而第 9 天的色氨酸水平显示出强关联（OR = 0.02，95% CI 0.01-0.05；Wald χ² = 6.7；p < 0.001；R² = 0.43）。第 1 天的丙酸未达到统计学显著性（OR = 0.66，p = 0.108），而与其第 9 天水平形成对比，后者与 DCI 显著相关（OR = 0.51，95% CI 0.32-0.81；Wald χ² = 8.2；p = 0.004；R² = 0.52）。此外，第 1 天的异戊酸（OR = 0.31，p = 0.048；R² = 0.41）和第 1 天的己酸（OR = 0.24，p = 0.017）也与 DCI 的发生显著相关（表 3）。在 DCI 预测的增量价值分析中，将色氨酸（第 9 天）添加到基线临床模型显著改善了模型拟合（Δχ² = 18.68，df = 1，p < 0.001）。区分度从单独临床模型的 AUC 0.783（95% CI 0.645-0.921）增加到加入生物标志物后的 0.909（95% CI 0.830-0.989）。模型校准仍然可接受（Hosmer-Lemeshow p = 0.645）。这些发现表明，在已建立的临床预测因子之外，存在显著的增量预后价值。在 22 名发生 DCI 的患者中，从发病到 DCI 的中位时间为 9 # 全文：

在第 9 天出现 DCI，五例在第 9 天，十例在第 9 天之后。

3.4 aSAH 患者第 1 天和第 9 天吲哚衍生代谢物和 SCFAs 的相关性结构

热图展示了在两个时间点（D1 和 D9）测量的吲哚衍生代谢物和短链脂肪酸的相关性结构。所有代谢物在 D1 和 D9 之间均观察到强的正自相关，特别是对于吲哚-3-丙酸 (IPA) (IPA_D1–IPA_D9)、色氨酸 (Trp) (Trp_D1–Trp_D9)、吲哚乙酸 (IAA) (IAA_D1–IAA_D9) 和吲哚乳酸 (ILA) (ILA_D1–ILA_D9) 的系数较高。在 D1 测量值中，Trp_D1 和 IPA_D1 之间，以及 ILA_D1 和 IAA_D1 之间存在显著的正相关，表明吲哚代谢途径内的协调变异性。在短链脂肪酸中，D1 时戊酸 (VA) 和异戊酸 (iVA) 之间（VA_D1–iVA_D1）、丁酸 (BA) 和 VA 之间（BA_D1–VA_D1）以及己酸 (CA) 与 VA 和 iVA 之间（CA_D1–VA_D1; CA_D1–iVA_D1）存在显著的正相关。一些 SCFA 关系在 D9 时保持一致，包括 VA_D9 和 iVA_D9、BA_D9 和 VA_D9 以及 CA_D9 与 VA_D9 和 iVA_D9 之间的强相关性（图 4）。

为了探索早期代谢物改变与全身炎症激活之间的关系，进行了补充的 Spearman 相关性分析。D1 色氨酸水平与入院炎症标志物（CRP：ρ = −0.423，p < 0.001；NLR：ρ = −0.421，p = 0.001）呈显著的中度负相关。相比之下，炎症标志物与 D1 丙酸之间未观察到显著相关性（CRP：ρ = −0.119，p = 0.340；NLR：ρ = −0.108，p = 0.405）。

4 讨论

我们的研究揭示了 aSAH 后肠道微生物群衍生代谢物的独特时间变化，这些变化与功能结局和 DCI 的发展密切相关。3 个月预后不良的患者在第 1 天表现出较低的丙酸、异丁酸和异戊酸水平，同时两个时间点的色氨酸浓度持续降低，而 IPA 在第 9 天显著降低。相比之下，良好结局的特点是两个采样点的色氨酸水平均较高，且第 9 天 IPA 水平较高。DCI 与第 1 天和第 9 天色氨酸和丙酸水平显著降低，以及第 9 天 IPA 显著降低相关，而异戊酸和己酸的早期降低进一步区分了发生 DCI 的患者。ROC 分析确定色氨酸和丙酸是结局和 DCI 的最强区分因子，而 IPA 在第 9 天获得预测强度。逻辑回归表明，较低的 D1 丙酸和较低的 D9 IPA 独立预测不良功能结局，而 D9 IPA、色氨酸和丙酸——以及 D1 异戊酸和 D1 己酸——是 DCI 的独立预测因子。相关性分析显示代谢物谱随时间稳定，并且在 SCFA 和吲哚代谢途径内均存在协调聚类。

血清色氨酸水平在不良结局组和 DCI 组中在两个时间点均持续较低，显示出极佳的区分准确性，并且第 9 天水平在调整临床协变量后独立预测 DCI。重要的是，主要的关联在 FDR 校正后仍然显著，支持了研究结果的稳健性。

我们的研究小组先前已证明，aSAH 后预后不良的患者表现出显著较低的血清色氨酸水平和较高的犬尿氨酸水平（16）。我们的研究结果通过证明特定的 Trp 相关和 SCFA 代谢物独立预测 aSAH 后的功能结局和迟发性脑缺血，补充了先前将微生物群衍生的色氨酸代谢紊乱与神经血管脆弱性联系起来的证据（17），从而强化了一个共同的病理生理轴，其中受损的微生物代谢信号导致了早期脑损伤及其迟发性并发症。Kofler 等人（18）的研究和我们的研究结果强调了色氨酸耗竭是 SAH 的一个关键生物学后果，但它们与不同的临床表现相关。虽然 Kofler 等人证明脑色氨酸减少与 SAH 后的抑郁症状相关，但我们的结果显示，较低的全身色氨酸水平与较差的功能结局和 DCI 的发展密切相关。总之，这些发现表明，色氨酸代谢受损代表了影响 SAH 后神经心理学脆弱性和神经血管不稳定性的一个共同病理生理轴。

aSAH 后预后不良患者循环色氨酸水平降低可能是由几种汇聚的生物学机制驱动的。首先，最令人信服的解释是炎症诱导的吲哚胺-2,3-双加氧酶 (IDO1/IDO2) 激活（19），该酶在出血后的急性神经炎症反应中被细胞因子如 IFN-γ、IL-6 和 TNF-α 迅速上调。该酶将色氨酸转入犬尿氨酸途径，从而消耗全身色氨酸储备并产生与血管功能障碍和继发性脑损伤相关的代谢物（20）。其次，aSAH 触发深度的应激反应，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致糖皮质激素介导的肝脏色氨酸-2,3-双加氧酶 (TDO) 刺激（21-23）。临床更严重或易发生 DCI 的患者中皮质醇的持续升高可能随时间进一步加速色氨酸分解代谢，与第 9 天观察到的持续降低一致。第三，我们队列中观察到的 IPA 和短链脂肪酸降低的代谢特征表明存在显著的肠道微生物群失调，这已知通过改变微生物 Trp 消耗、损害吲哚途径代谢和削弱肠道屏障完整性来影响色氨酸可用性（20-24）。这种失调会加剧全身炎症，进而放大 IDO 激活，形成一个自我强化的色氨酸耗竭循环（25）。第四，急性期反应中白蛋白结合和循环游离脂肪酸的改变可能调节游离色氨酸与结合色氨酸的分布，即使总色氨酸浓度仍可测量，也可能降低其生物利用度（26）。最后，尽管危重患者的营养摄入通常受损，但仅凭营养不良不太可能解释早期和显著的色氨酸降低（20, 26），特别是在喂养状态发生持续变化之前观察到的第 1 天差异。总之，这些机制表明，aSAH 后的色氨酸耗竭反映了涉及炎症、应激内分泌学和肠道微生物失调的综合宿主反应——每一种都促进了一种可能易发迟发性脑缺血和不良神经恢复的代谢环境。

在我们的研究中，IPA 在第 1 天时组间无差异，但在第 9 天时，预后不良和 DCI 患者中显著降低。IPA 是一种肠道微生物群衍生的色氨酸代谢物，主要由革兰氏阳性菌产生，在免疫调节、抗氧化防御、肠道屏障完整性、微生物群平衡和神经保护中具有关键作用（27）。基于 Ren 等人（28）描述的 IPA-肠道屏障-免疫轴，我们的研究结果表明，aSAH 后进行性的肠道微生物群失调（12, 13）导致 IPA 产生减少，进而加剧肠道屏障功能障碍、全身炎症和 IDO 介导的色氨酸向犬尿氨酸途径的转移，从而增加神经血管脆弱性并导致 DCI 和不良结局。Peng 等人的一项研究表明，脑出血与肠道微生物群衍生的 IPA 持续减少有关，并且补充 IPA 通过抑制 Stap1 增强小胶质细胞髓鞘碎片清除，从而改善神经恢复和白质完整性，促进修复（29）。这一机制与我们的发现直接一致，因为在患有 DCI 和不良结局的 aSAH 患者中，IPA 的延迟但显著降低同样表明，微生物群衍生的 IPA 丧失导致了持续的神经炎症和恢复受损，而非直接的急性损伤。此外，IPA 通过抗炎、抗氧化和神经保护机制直接减轻缺血性脑损伤（30），我们的结果表明，在患有 DCI 和不良结局的 aSAH 患者中观察到的 IPA 水平降低，可能反映了内源性保护性代谢物的丧失，该代谢物通常会减轻继发性缺血性损伤并支持神经恢复。广谱抗生素治疗会降低艰难梭菌的相对丰度，并几乎完全抑制 IPA 合成，将水平降至接近零（31）；然而，尽管在我们的研究中，感染和随之而来的抗生素使用在不良 aSAH 组中显著更频繁，因此可能影响 IPA 水平，但我们的逻辑回归分析表明，低 IPA 仍然是结局的独立预测因子。总之，aSAH 相关的肠道失调可能减少微生物从色氨酸合成 IPA，而由此导致的 IPA 介导的屏障保护和免疫调节信号的丧失会促进肠道通透性和全身炎症，削弱 IPA 对迟发性缺血性损伤和 DCI 的内源性神经保护作用，并通过炎症驱动的 IDO 激活和色氨酸远离吲哚代谢物产生来进一步强化 IPA 耗竭。在我们研究的分析中，特定 SCFAs 水平较低与较差结局一致相关，因为丙酸、异丁酸、异戊酸和己酸在功能结局不良和/或 DCI 患者中降低——尤其是在入院后早期——其中丙酸对不良结局和 DCI 均显示出最强且最一致的独立预测价值。

来自缺血性卒中、创伤性脑损伤 (TBI)、脑出血 (ICH) 和动脉瘤性蛛网膜下腔出血 (aSAH) 的累积证据支持肠道微生物群衍生的短链脂肪酸 (SCFA) 在塑造损伤后炎症、继发性脑损伤和神经恢复中的核心作用。实验性卒中研究表明，SCFA 可用性的降低会损害功能恢复，而恢复 SCFA 可通过调节适应性免疫反应、小胶质细胞激活和神经可塑性来改善结局（32, 33）。人类研究通过显示急性脑损伤伴随肠道失调和改变的循环 SCFA 水平扩展了这些发现，这些改变与功能结局和炎症标志物相关，尽管这些关联的方向和强度取决于测量的时间和临床背景（7, 34）。

在此背景下，我们观察到丙酸在预后不良的患者中在第 1 天已经降低，并在第 9 天独立预测 DCI，这表明早期丙酸耗竭反映了 aSAH 超急性期 SCFA 介导的免疫调节控制的丧失。这一解释与将较低 SCFA 水平与较差恢复联系起来的缺血性卒中数据（7）以及显示具有改变代谢能力的肠道微生物组谱与血管痉挛和 DCI 相关的 aSAH 研究一致，表明早期促炎代谢环境可能使患者易发继发性缺血性损伤（12, 35）。

对于异丁酸观察到的时间模式进一步强调了脑损伤后 SCFA 信号的动态性质。尽管异丁酸在预后不良的患者中持续较低，但其独立关联仅在 D9 时才出现，表明较晚的 SCFA 测量可能更好地捕捉持续的肠道失调和持续的神经炎症，而非急性损伤严重程度。这与基于血栓切除术的卒中研究一致，其中急性 SCFA 水平与全身炎症标志物的相关性比与初始神经功能缺损的相关性更强，而长期关联似乎与恢复更相关（34），并且与 ICH 研究一致，这些研究表明产 SCFA 分类群的持续减少与神经功能改善受损相关（36, 37）。

值得注意的是，在随后发生 DCI 的患者中观察到的异戊酸和己酸的早期降低，指向了支链和中等链长 SCFA 作为易发继发性损伤的早期代谢信号的作用。虽然个体 SCFA 在出血性卒中中的研究较少，但 ICH 中的多组学分析表明，微生物组驱动的宿主代谢改变（包括 SCFA 相关途径）密切跟踪疾病严重程度和结局（38）。在此框架内，异戊酸和己酸的早期缺陷可能反映了 aSAH 后肠-脑轴的急性破坏，这种破坏先于并导致迟发性缺血性并发症（12, 35）。此外，来自创伤性脑损伤模型的证据表明，持续的损伤后肠道失调和 SCFA 可用性降低与较差的长期神经结局相关，而恢复 SCFA 信号——无论是通过微生物恢复还是直接补充——均可减轻神经炎症并改善功能恢复，进一步支持 SCFA 缺乏在急性脑损伤后继发性脑损伤中的因果作用（39-41）。来自实验性卒中和 TBI 模型的机制见解为这些临床观察提供了生物学合理性，通过证明 SCFA 直接调节免疫细胞分化、T 细胞运输、小胶质细胞激活和血脑屏障完整性，从而影响继发性损伤级联反应和长期恢复轨迹（32, 33, 42）。同时，人类研究强调，急性期循环 SCFA 水平可能代表一个复合信号，整合了代偿性反应、代谢应激和治疗相关因素，这可以解释与结局的时间依赖性或甚至矛盾性关联（34）。在补充分析中，早期色氨酸水平与入院炎症标志物（CRP 和 NLR）呈显著负相关，支持与吲哚胺 2,3-双加氧酶 (IDO) 途径激活一致的炎症相关代谢转变。相比之下，早期丙酸水平与炎症标志物无关，表明 SCFA 改变可能反映了超越急性全身炎症负担的独特调节机制。重要的是，尽管色氨酸和丙酸的早期降低与 DCI 和不良结局独立相关，但本研究的观察性质排除了因果推断。代谢物水平降低可能代表继发性脑损伤的生物学活性贡献者，或者可能作为全身炎症和整体疾病严重程度的标志物。因此，这些发现应被解释为关联性而非因果关系的机制性证据。需要进一步的实验和干预性研究来阐明这些关联的方向性和生物学相关性。

应承认本研究的几个局限性。首先，这是一项单中心、观察性研究，样本量相对较小，可能限制了研究结果的普适性。尽管队列规模与许多 aSAH 代谢组学研究相当或更大，但在更广泛的临床环境中可靠应用这些生物标志物之前，需要在独立的多中心队列中进行外部验证。抗生素暴露是研究肠道微生物群衍生代谢物时的一个重要潜在混杂因素。在本队列中，没有患者在 D1 采样前接受抗生素治疗，也未应用常规预防；因此，早期（D1）代谢物改变不能归因于抗生素治疗。然而，大多数抗生素治疗在 DCI 风险窗口之前或期间开始（D1 后中位 7 天开始），这可能通过微生物组破坏影响了 D9 代谢物水平——特别是 IPA。尽管在调整后的结局模型中将感染状态作为协变量，但不能完全排除抗生素类型、持续时间和时间的残余混杂。未来需要具有详细纵向抗生素暴露数据的研究来进一步阐明这种效应。其次，观察性设计排除了因果推断。虽然确定了特定肠道微生物群衍生代谢物、功能结局和迟发性脑缺血 (DCI) 之间的强关联，但我们的数据无法确定改变的代谢物水平是继发性脑损伤的机制性贡献者，还是反映疾病严重程度、全身炎症或治疗相关因素的表象。第三，代谢物测量仅限于两个预定义的时间点（第 1 天和第 9 天）。尽管选择这些时间点是为了捕捉急性期和 DCI 的峰值风险窗口，但它们可能无法完全反映 aSAH 后微生物群衍生代谢物的动态和潜在非线性时间轨迹。更频繁的纵向采样可以提供对肠-脑代谢相互作用演变的更深入见解。第四，未进行肠道微生物群组成的直接评估。因此，观察到的循环 SCFAs 和吲哚代谢物变化只能间接反映肠道失调。将粪便微生物组测序与血清代谢组学相结合，对于直接将微生物分类群、代谢能力与临床结局联系起来是必要的。第五，神经重症监护中固有的几个潜在混杂因素可能影响代谢物水平，包括抗生素暴露、肠内营养实践、机械通气、感染和其他重症监护干预措施。尽管在多变量模型中纳入了感染状态作为协变量，但不能排除残余混杂。最后，出血前的营养摄入和代谢状态未进行系统量化，且缺乏 aSAH 前的基线代谢物水平。因此，患病前代谢的个体间差异可能导致了观察到的差异。此外，缺乏正式的预先样本量计算可能限制了检测较小效应量的统计功效。由于 DCI 的中位时间是 9 天，大约一半的 DCI 事件发生在第 9 天采样时间点之前或当天。因此，第 9 天代谢物水平应被解释为反映了 DCI 峰值窗口期间的动态病理生理过程，而非纯粹的前瞻性预测因子。尽管存在这些局限性，但跨多种分析方法和时间点结果的一致性支持了观察到的关联的稳健性，并强调了未来进行机制性和干预性研究的必要性。

5 结论

总之，我们目前的研究结果与现有文献很好地整合，并支持一个模型，在该模型中，特定 SCFAs——特别是丙酸、异戊酸和己酸——的早期耗竭标志着 DCI 风险增加，而较晚时间点 SCF# 全文：

而较晚时间点 SCFA 水平持续偏低，例如第 9 天的异丁酸，则反映了持续的失调和受损的恢复潜力。这种时间性和代谢物特异性模式强化了 SCFAs 不仅仅是旁观者，而是 aSAH 后肠-脑-免疫相互作用的动态指标，对于风险分层和靶向治疗干预具有潜在意义。

声明

数据可用性声明

本研究中呈现的原始贡献已包含在文章/补充材料中，进一步查询可直接联系通讯作者。

伦理声明

涉及人类的研究已获得匈牙利医学研究委员会的批准。研究按照当地法规和机构要求进行。参与者提供了书面知情同意书以参与本研究。

作者贡献

BN-N：研究调查、可视化、撰写初稿、数据管理、方法论。RT：数据管理、研究调查、资源、撰写初稿。CS：数据管理、正式分析、研究调查、撰写初稿。DO：数据管理、正式分析、研究调查、方法论、撰写初稿。AS：监督、验证、撰写初稿。TM：构思、研究调查、撰写初稿。PC：研究调查、可视化、撰写初稿、构思、撰写审阅与编辑。

资金

作者声明，本工作及/或其出版获得了财务支持。本研究得到了匈牙利 NRDI 基金（NKFI-FK-146159）和转化神经科学国家实验室项目（RRF-2.3.1-21-2022-00011）的支持。

利益冲突

作者声明，本工作是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

生成式人工智能声明

作者声明，在创建本稿件时未使用生成式人工智能。

本文中附图中提供的任何替代文本（alt text）均由 Frontiers 在人工智能的支持下生成，并已尽合理努力确保其准确性，包括在可能的情况下由作者进行审阅。如果您发现任何问题，请与我们联系。

出版商注

本文中表达的所有主张仅代表作者本人，不一定代表其所属机构、出版商、编辑和审稿人的观点。本文中可能评估的任何产品或制造商可能提出的任何主张，均未得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充材料可在以下网址在线获取：www.frontiersin.org/articles/10.3389/fneur.2026.1768108/full#supplementary-material

参考文献

（此处省略详细的参考文献列表，共 42 条参考文献）

摘要

关键词： 动脉瘤性蛛网膜下腔出血；迟发性脑缺血；吲哚-3-丙酸；结局；短链脂肪酸；色氨酸

引用： Nagybanyai-Nagy B, Tengölics R, Sajben C, Olasz D, Schwarcz A, Molnar T and Csecsei P (2026) 血清微生物组相关代谢物——包括短链脂肪酸和吲哚衍生物——预测动脉瘤性蛛网膜下腔出血后的结果和迟发性脑缺血：一项双时间点LC–MS研究。Front. Neurol. 17:1768108. doi: 10.3389/fneur.2026.1768108

收到日期： 2025年12月15日

修订日期： 2026年3月4日

接受日期： 2026年3月24日

出版日期： 2026年4月7日

卷号： 17 - 2026

编辑： Zachary Sorrentino，佛罗里达大学，美国

审稿人： Vishank A. Shah，约翰霍普金斯大学，美国；Chengfeng Qiu，怀化市第一人民医院，中国

版权： © 2026 Nagybanyai-Nagy, Tengölics, Sajben, Olasz, Schwarcz, Molnar and Csecsei。这是一篇开放获取文章，根据 Creative Commons Attribution License (CC BY) 条款分发。允许在其他论坛中使用、分发或复制，前提是原始作者和版权所有者被注明，并且原始出版物在本期刊中被引用，按照公认的学术实践。不允许不符合这些条款的使用、分发或复制。

通讯作者： Peter Csecsei，csecsei.peter@pte.hu

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