在许多生物体中，衰老是一个显著的风险因素，会导致染色体错误分离率增加，这是非整倍体的主要来源。在这项研究中，我们报告说，老化的酵母母细胞通过将其染色体不对称分配给其子细胞，以及预先存在的（旧的）纺锤体极体（相当于酵母的中心体），从而失去染色体。值得注意的是，核孔复合体（NPC）的重塑和核篮的位移触发了这些不对称分离事件。同时，核篮的位移还导致未剪接的前mRNA泄漏到细胞质中。我们证明，去除三个参与染色体分离基因的内含子足以完全抑制老细胞中的染色体丢失。此外，在年轻细胞中促进前mRNA泄漏也会通过相同的三个内含子导致不对称染色体分配和丢失。因此，我们提出核篮从NPC的位移及其随后对前mRNA质量控制的影响是导致衰老表型如非整倍体的关键触发因素。
引言
细胞衰老会导致多种保守的表型，包括染色体错误分离、线粒体片段化、受损或错误折叠蛋白质的积累以及核形态的变化。引人注目的是，在真菌、蠕虫和哺乳动物等不同生物体中，衰老也与核孔复合体（NPC）的重塑相关，这是一种约50 MDa的通道，控制mRNA的出口和蛋白质的核质分布。至少在分裂细胞中，表达早衰变异体Lamin A（早衰蛋白）时，NPC最显著的变化是其核篮的丢失。这种结构由位于NPC核质侧的TPR蛋白形成，在mRNA出口、前mRNA在核内的保留、蛋白质质量控制和基因调控等多样过程中起作用。NPC在真核信息流中的核心位置及其篮子的广泛功能表明，改变它们的功能可能会对细胞功能产生非常多样化的影响。然而，尽管如此，我们对NPC结构重排是否以及如何影响衰老知之甚少。
结果
老化酵母细胞丢失染色体
为了研究老化是否影响酵母细胞的核型，我们使用微流控平台在显微镜下捕获并监测了复制老化母细胞整个生命周期内单个染色体的命运，使用标记有TetO序列的II号或IV号染色体作为报告分子。II号染色体是平均大小的染色体，而IV号染色体是第二长的染色体。这两种染色体通过在其中心附近插入256个TetO重复序列进行标记。这些染色体通过表达荧光标记的TetR蛋白（TetR-GFP或TetR-mCherry；图1A-B）可视化。然后我们在整个复制寿命期间监测了这些细胞，使用微流控平台将它们固定在显微镜下。每个母细胞的复制年龄通过计数它在一段时间内产生的子细胞数量来测量，定义为在某个时间点已完成的出芽次数（CBE）。通过标记的纺锤体极体（SPB/中心体等效物，用mCherry标记）的大小和数量及位置来确定成像时细胞所处的细胞周期阶段（图1A）。
分析这些图像显示，所有年轻的母细胞（约0-3 CBE；t=0小时）及其子细胞都含有一个荧光点，记录了这些标记染色体的存在。然而，当达到18至22 CBE（t=24小时）时，约10-15%的老母细胞失去了它们的荧光点（图1B-C）。无论标记哪个染色体或使用哪种荧光标签，都观察到了这一点。标记的SPB的荧光不受影响，表明点的丢失不是由于老细胞中荧光素的不稳定性引起的。为了测试这些荧光染色体焦点的丢失是否是由于TetO阵列的特异性丢失还是整个染色体的丢失，我们在IV号染色体的长臂中间插入了一个额外的标记（256个LacO序列阵列），并询问那些失去TetO阵列的细胞是否也失去了LacO重复序列。分析这些图像显示，85%缺乏TetO阵列的细胞确实失去了LacO阵列（50/59）。因此，这些细胞可能失去了整个染色体。支持这一观点的是，TetO阵列的丢失对细胞是致命的。实际上，超过99%（145/146次染色体II丢失事件）的无点细胞未能进一步分裂，正如预期的那样，单倍体细胞失去整个染色体。我们得出结论，就像许多其他生物一样，酵母在达到老年时会经历染色体不稳定性的爆发（图1A，C）。
老化细胞通过不对称姐妹染色单体分配丢失染色体
鉴于着丝粒在染色体丢失中的重要作用，我们推测老母细胞中染色体的丢失可能是由于有丝分裂错误分离事件引起的。为了确定是否如此，我们接下来分析了在我们对老化细胞的延时录像中，处于有丝分裂期的细胞（图2A）。分析老母细胞的后期事件显示，染色体II、IV和迷你染色体的错误分离率显著增加（图2B）。在我们录制的600个后期事件中，发现有66（11%）共分离了标记的姐妹染色单体到一个极点，其中54/66（82%）的错误分离事件导致姐妹染色单体不对称分配到这些老母细胞的芽中（图2C）。这在年轻细胞中几乎从未观察到（图2A-C）。值得注意的是，老母细胞中染色体丢失频率和姐妹染色单体不对称分配到芽中的频率大致相同，无论标记的是染色体II还是染色体IV。因此，老母细胞中染色体的丢失似乎完全可以由随着年龄增长的姐妹染色单体不分离增加以及由此导致的染色体不对称分配到芽中解释。因此，我们检查了这种特殊模式的定向染色体错误分离背后的机制。
讨论
衰老通过广泛的保守细胞表型表现出来，但在少数情况下，我们对其相互关系或因果联系知之甚少。在这项研究中，我们调查了老母细胞中NPC的重塑是否有助于其他衰老表型的出现，以染色体丢失为研究案例。我们展示了NPC的重塑不仅必要而且充分，可以提高随着年龄增长的染色体丢失率，并提供了相关机制的见解。确实，促进NPC核篮位移和一般核篮缺陷的干预措施促进了姐妹染色单体的非分离和向芽中的错误分配，从而导致老母细胞中的染色体丢失。这些干预措施包括刺激eccDNA形成的突变和去除主要酵母TPR同工型Mlp1。相反，防止NPC重塑的干预措施，例如延迟eccDNA的积累、其锚定到NPC以及SAGA招募到NPC，恢复了老细胞中正常的染色体分离并防止了染色体丢失。因此，NPC的重塑似乎是触发老细胞中染色体丢失的关键点。
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