阿奇霉素是应用广泛的抗生素，在COVID-19大流行期间常用于住院患者。但经验性使用阿奇霉素对病毒性呼吸道感染患者呼吸道微生物组的影响尚不清楚。本研究对1164名因COVID-19住院患者的前瞻性多中心队列进行纵向鼻拭子宏转录组学分析，比较了接受阿奇霉素治疗（n=366）、未使用抗生素（n=474）或使用其他抗生素（n=324）的患者的上呼吸道微生物组、耐药组和全身免疫反应。结果显示：阿奇霉素改变了微生物组组成，并增加大环内酯类/林可酰胺类/链霉素类（MLS）耐药基因的表达和相对比例；这些变化在暴露1天后出现，并持续超过一周；MLS耐药基因表达与共生菌和潜在病原体相关，而血液和气道中的宿主炎症基因表达未见差异。这表明经验性阿奇霉素治疗影响了上呼吸道微生物组和耐药组，但未见明显的抗炎获益。
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摘要
阿奇霉素是一种广泛使用的抗生素，在COVID-19大流行期间常被用于治疗住院患者。经验性阿奇霉素用于病毒性呼吸道感染患者对呼吸道微生物组的影响尚不明确。本研究采用纵向宏转录组学方法，对1164名因COVID-19住院的前瞻性多中心队列患者的鼻拭子样本进行分析。我们比较了接受阿奇霉素（n=366）、未接受抗生素（n=474）或接受其他抗生素（n=324）患者的上呼吸道微生物组、耐药组和全身免疫反应。我们发现，阿奇霉素改变了微生物组组成，并增加了大环内酯类/林可酰胺类/链霉素类（MLS）耐药基因的表达和相对比例。这些变化在暴露1天后出现，并持续超过一周。MLS耐药基因表达与共生菌和潜在病原体相关，而血液和气道中的宿主炎症基因表达未见差异。这表明经验性阿奇霉素治疗影响了上呼吸道微生物组和耐药组，但无明显抗炎获益。
正文
引言
阿奇霉素是世界卫生组织基本药物之一，是人类医疗中最常用的抗生素之一，仅美国每年处方量就超过4000万张。阿奇霉素的过度使用在门诊中已有充分记录，估计约30%的抗生素处方不合理。在COVID-19大流行的第一年，阿奇霉素也成为住院患者中最常用的抗生素之一，部分原因是早期研究提示其可能具有抗病毒活性，以及既往研究显示大环内酯类抗生素具有抗炎特性。
然而，随后的随机对照试验表明，阿奇霉素对COVID-19的治疗无临床获益，包括住院患者（RECOVERY试验，n=7763）、重症COVID-19住院患者（COALITION II试验，n=397）、轻中度COVID-19（ATOMIC-II，n=298）以及门诊患者（PRINCIPLE，n=1323）。尽管如此，许多医疗中心最初仍将阿奇霉素纳入其COVID-19治疗指南，公共错误信息也持续推动该药物的过度处方。
近期研究发现，阿奇霉素暴露可改变人体微生物组及其抗菌耐药基因库（统称为耐药组）。例如，MORDOR临床试验的二次分析发现，对非洲儿童进行每年两次的大规模阿奇霉素分发导致肠道微生物组中大环内酯类及其他抗菌耐药基因（ARG）类别的丰度增加。此外，患有哮喘的成人随机接受每周三次阿奇霉素治疗12个月后，其痰液样本中大环内酯类耐药基因的PCR拷贝数较对照组增加。
尽管急性呼吸道感染是最常见的使用场景，但尚未有研究评估阿奇霉素对呼吸道微生物组的影响，尤其是在经验性处方的情况下。此外，尚无阿奇霉素暴露研究纳入宏转录组学（可同时评估细菌16S rRNA丰度和ARG表达），从而提供活性耐药组的功能谱。
为解决这些空白，我们对1164名因COVID-19住院的成人进行前瞻性队列呼吸道宏转录组学分析，研究阿奇霉素暴露的影响。我们发现呼吸道微生物组发生显著变化，包括可检测表达的大环内酯类耐药基因增加及其在气道耐药组中的比例上升，但未见抗病毒或免疫调节作用的证据。综合来看，我们的发现揭示了病毒性感染期间经验性阿奇霉素暴露的不良影响和生物学后果。
结果
队列
我们在2020年5月至2021年3月期间进行了一项前瞻性观察研究，纳入1164名因COVID-19住院的成人，来自多中心IMPACC队列。利用先前建立的COVID-19结局轨迹组（TG）对患者按疾病严重程度进行分组。TG从1（最轻）到5（28天内死亡）。入院后及整个住院期间追踪阿奇霉素和其他抗生素的使用情况。在研究的1164名COVID-19患者中，366名（31.4%）接受了经验性阿奇霉素治疗（阿奇霉素组），474名（40.7%）未接受抗生素（无抗生素组），324名（27.8%）接受了非阿奇霉素的抗生素（其他抗生素组）。
经验性阿奇霉素使用在COVID-19严重程度最高的患者中最常见，但与其他抗生素组相比，阿奇霉素治疗患者疾病严重程度较低。阿奇霉素治疗的中位天数为2天（IQR 1-4天，范围1-35天），不同TG组间差异显著（P=0.03）。大多数患者（98.2%）在入院后1周内接受阿奇霉素。使用阿奇霉素的患者最常同时使用头孢曲松（77.2%）或万古霉素（19.4%）。阿奇霉素使用在性别或种族方面无差异。
阿奇霉素暴露改变呼吸道微生物组
我们首先利用入院后28天内6个时间点的鼻拭子样本进行宏转录组学RNA测序，分析阿奇霉素对上呼吸道微生物组的影响。分析调整了年龄五分位数、性别、严重程度TG、住院天数、患者、是否使用皮质类固醇以及除阿奇霉素外6种最常见抗生素的使用情况。我们发现，阿奇霉素治疗5±1天（常见的疗程长度）与气道细菌相对丰度显著降低相关（调整后P=0.026，FC=0.82），且效应在1±1天内即可观察到（调整后P=0.0019，FC=0.90）。其他抗生素也在1±1天后导致上呼吸道细菌相对丰度下降（调整后P=0.036，FC=0.93），但在后期时间点不明显。
对真菌组的评估显示，接受阿奇霉素与1±1天后上气道真菌相对丰度增加相关（调整后P=0.038，FC=1.17），且随着阿奇霉素给药5天呈现时间依赖性增加趋势。上气道微生物组α多样性在不同治疗组间无差异，但基于Bray-Curtis差异指数的微生物群落组成在阿奇霉素暴露组间存在显著差异（PERMANOVA P=0.001）。各患者Bray-Curtis距离相对于最早时间点的轨迹比较显示，无论是否使用抗生素，群落组成随时间发生显著变化。
差异分类丰度分析表明，阿奇霉素暴露与上气道中潜在致病菌如葡萄球菌属和克雷伯菌属的富集相关，并消耗了奈瑟菌属和梭杆菌属等常见共生菌。在差异丰度属中，我们还检查了上气道微生物组中最常见物种的相对丰度。例如，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌占了基于阿奇霉素暴露的差异丰度葡萄球菌属的大部分。
我们进一步使用HUMAnN3和MaAsLin2进行微生物代谢通路功能分析，比较阿奇霉素组与其他抗生素组和无抗生素组在5±1天时间点的差异，但多重比较校正后未发现差异富集的通路。我们还测试了阿奇霉素治疗是否与上气道中SARS-CoV-2相对丰度的变化相关，在5±1天治疗组中未观察到与另外两组相比的差异。
阿奇霉素暴露改变呼吸道抗菌耐药组
为理解阿奇霉素暴露对呼吸道抗菌耐药组的影响，我们首先比较了各组间的ARGα多样性。阿奇霉素暴露与早期（1±1天）治疗时间点耐药组Shannon多样性指数相对其他抗生素组增加有关（调整后P=5.8×10⁻³，FC=1.24），但与无抗生素对照组无显著差异。阿奇霉素暴露后耐药组组成的改变也很明显，在1±1天和5±1天阿奇霉素治疗时间点，与对照组相比Bray-Curtis差异指数均显著不同（PERMANOVA P=0.001）。
由于阿奇霉素是一种大环内酯类抗生素，我们接下来聚焦于赋予MLS类抗生素耐药性的ARGs。我们发现，与无抗生素组或其他抗生素组相比，阿奇霉素暴露与早期（调整后P=3.5×10⁻⁴和6.2×10⁻⁷，FC=1.48和1.61）和晚期（调整后P=1.3×10⁻³和4.3×10⁻⁶，FC=1.61和1.70）时间点可检测表达的MLS基因数量显著增加相关。纵向模型随后显示，阿奇霉素暴露天数导致上呼吸道微生物组中可检测表达的MLS ARGs数量显著增加（调整后P=7.6×10⁻⁷）。这些结果对组间疾病严重程度差异具有稳健性，按疾病严重程度分层的敏感性分析证实了这一点。
为比较评估不同类型ARGs中阿奇霉素暴露的影响，我们评估了每种类型占耐药组的比例随时间的变化。我们发现，阿奇霉素暴露5±1天后，MLS ARG比例从耐药组的24.5%增加到42.9%（调整后P=1.7×10⁻⁴）。值得注意的是，MLS ARGs的富集，无论是在ARG丰富度还是占耐药组的比例方面，在阿奇霉素停药后7-10天仍然持续。
气道耐药组与微生物组的相关性将分类群与耐药基因联系起来
在气道微生物组中鉴定出多种MLS耐药基因，其中ermA和msrA最为常见。为评估上气道微生物组中MLS耐药基因与细菌分类群之间的关系，我们进行了多维相关性分析。多个MLS基因与潜在致病菌（如葡萄球菌属、链球菌属）以及常见共生菌（如棒状杆菌属、多洛西格兰菌属）之间存在显著正相关。种水平的多维相关性分析进一步强化了这些关系（例如金黄色葡萄球菌与mphC、msrA）。利用CARD RGI病原体来源工具，将检测到的ARG序列k-mers与已建立的细菌病原体数据库进行匹配，进一步揭示了大环内酯类耐药基因与特定物种之间的联系（例如化脓性链球菌与ermA，ermC与金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）。
阿奇霉素不改变宿主炎症反应
既往研究发现阿奇霉素具有抗炎特性，导致其被超说明书用作免疫调节剂。因此，我们试图了解在急性COVID-19背景下，阿奇霉素暴露是否与气道或血液中宿主炎症基因表达的变化相关。我们进行了差异基因表达分析。在治疗5±1天后，气道或血液中均未发现差异表达基因（FDR<0.05），提示阿奇霉素不能有效减轻COVID-19住院患者的病理性炎症反应。
讨论
在一个大型多中心COVID-19住院患者队列中，经验性阿奇霉素治疗与上呼吸道微生物组、真菌组和抗菌耐药组的变化相关。我们观察到阿奇霉素治疗5±1天后，可检测表达的大环内酯类耐药基因显著扩增，部分效应在数天内即可出现。此外，阿奇霉素治疗与上气道微生物群组成的变化相关，包括潜在致病菌如克雷伯菌属和葡萄球菌属的富集。综合来看，我们的发现表明，病毒性呼吸道感染患者中不恰当的阿奇霉素使用可驱动大环内酯类耐药决定因子的扩增并破坏气道微生物组组成。
既往针对非洲儿童大规模阿奇霉素治疗的研究发现该药物暴露与肠道微生物组中大环内酯类耐药基因增加之间存在令人担忧的关系。我们在呼吸道层面且在转录水平上进一步证实了这些重要发现，表明效应在抗生素治疗数天内即可检测到。重要的是，我们发现阿奇霉素暴露不仅与微生物组内耐药潜力增加相关，还与MLS耐药基因的功能表达相关。
美国疾病控制与预防中心认为耐大环内酯类肺炎链球菌和化脓性链球菌是紧迫威胁。考虑到我们的结果，以及门诊中约30%的抗生素处方被认为不适当或不必要，过去十年中这些物种大环内酯类耐药性增加或许并不意外。鉴于大量阿奇霉素处方针对儿童，这尤其令人担忧，因为儿童可能因不必要接触该药物而早在幼年时期即被耐大环内酯类细菌定植。
阿奇霉素被用于慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化/支气管扩张、肺移植、HIV/AIDS等的预防性治疗。虽鲜有研究检验阿奇霉素预防对呼吸道耐药组的影响，但一项近期针对哮喘患者的研究发现，12个月后痰液微生物组中大环内酯类耐药基因的多重PCR检测结果增加。需要进一步研究以理解阿奇霉素预防对这些患者群体上、下呼吸道微生物组和耐药组的影响。
MORDOR试验的一项亚分析发现，对非洲儿童进行4年每年两次的阿奇霉素治疗降低了死亡率，但导致鼻咽部培养的耐大环内酯类肺炎链球菌增加。与这些既往微生物学观察一致，我们的相关性分析表明，链球菌属和葡萄球菌属（涵盖一些最重要的细菌性肺炎病原体，如金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌）可能携带这些耐药决定因子。此外，我们发现MLS耐药基因表达与棒状杆菌属等共生及条件致病菌的丰度之间存在关系。
在MORDOR试验中，大规模阿奇霉素治疗还导致肠道微生物组中非大环内酯类耐药基因负荷增加。相比之下，我们发现阿奇霉素对上气道其他类型ARGs的脱靶效应相对较少。一种可能的解释是研究人群年龄和人口统计学差异，也可能是呼吸道与肠道微生物组采样差异，或宏转录组学与宏基因组DNA测序方法的不同。
既往研究显示阿奇霉素具有免疫调节潜力，这一发现促进了其在囊性纤维化、COPD和其他炎症性疾病患者中的应用。COVID-19大流行早期使用阿奇霉素的部分动机是其可能减轻有害炎症反应；然而，临床试验最终未发现治疗获益。与此一致，我们未观察到COVID-19住院患者中非常抱歉，之前输出的译文在讨论部分的最后一句被截断了，并未完整结束。现在我将补全剩余部分，并正确标注结束标记。
【补全翻译余下部分】
……尽管如此，许多医疗中心最初仍将阿奇霉素纳入其COVID-19治疗指南，公共错误信息也持续推动该药物的过度处方。
……与此一致，我们未观察到COVID-19住院患者中阿奇霉素治疗与气道或血液中的炎症基因表达或病毒载量之间存在显著关联。
本研究的优势包括大型多中心队列、详细的临床表型分析、使用呼吸道宏转录组学技术以及严格的临床和生物学数据质量控制。但本研究也存在局限性：观察性研究设计、短读长测序无法将大环内酯类耐药基因明确关联到特定分类群；鼻拭子样本仅限于上呼吸道，可能无法反映肺部微生物变化；抗生素给药数据由各研究地点的临床研究协调员手动提取，存在人为错误风险；研究在广泛接种COVID-19疫苗之前进行，结果不受疫苗接种状态影响，但可能与当代接种队列有所不同。未来需要开展随机临床试验，结合气道和肠道微生物组采样及细菌培养，以更全面地表征阿奇霉素及其他抗生素暴露对人类微生物组和耐药组的影响。对下呼吸道样本和宏基因组组装基因组的评估将有助于进一步拓展我们对抗生素暴露（包括携带ARGs的特定分类群）的理解。
总结而言，我们发现COVID-19住院患者的阿奇霉素暴露与气道微生物组的组成变化和大环内酯类耐药基因的扩增相关。综合来看，我们的发现表明，病毒性呼吸道感染患者中经验性大环内酯类使用可能加剧抗菌耐药性并带来公共卫生风险，这强调了抗微生物药物管理工作的重要性。
【全文结束】