机械卸载后心脏恢复相关的蛋白质组学标志物 - 心脑血管

心力衰竭是全球主要的死亡原因，严重心力衰竭患者需要左心室辅助装置(LVAD)支持。LVAD通常作为桥接至移植(BTT)或最终治疗方案植入，但如果患者心脏功能恢复，也可将其移除。然而，LVAD植入后心脏预后的分子预测因素仍不明确。

我们对心脏移植受者的肌样样本进行了液相色谱-质谱分析，包括14例BTT病例和10例桥接至恢复(BTR)病例，排除了心肌炎患者。本研究获得了东京大学机构审查委员会的批准(编号10162, G10032)。支持本研究结果的数据可根据合理要求向第一作者索取。LVAD植入持续时间在BTT组平均为849天(范围68-1,405天)，在BTR组平均为202.8天(范围77-428天)(图[A])。心肌组织经过处理，福尔马林固定石蜡包埋标本被分析。BTT组样本在LVAD植入时(植入前)和心脏移植时(植入后)采集，而BTR组样本仅在LVAD植入时采集。样本通过数据依赖串联质谱法使用质谱仪(Q-Exactive Mass Spectrometer, Thermo Fisher Scientific)进行分析。质谱数据使用Proteome Discoverer 1.4版(Thermo Fisher Scientific)和UniProtKB人类数据库的Swiss-Prot部分(截至2014年5月28日)进行分析和量化。仅在至少11名BTT患者和8名BTR患者中一致量化的蛋白质被纳入统计分析。

图. 机械卸载后心脏恢复相关的蛋白质组学标志物。A，蛋白质组分析的研究设计示意图。在桥接至移植(BTT)组(14名患者[11名男性，3名女性]；平均年龄41.3岁；范围19-55岁)和桥接至恢复(BTR)组(10名患者[7名男性，3名女性]；平均年龄34岁；范围21-43岁)中，胰蛋白酶肽段来自LVAD植入时从左心室心尖采集的植入前样本。在BTT组中，额外的植入后样本在心脏移植时从左心室游离壁采集。所有肽段均与轻甲基(CH₃)标签共价标记。BTT和BTR所有样本的混合物被标记为重标签(CHD2)，可在每个时间点进行相对定量。BTT组和BTR组在年龄上无统计学显著差异(P=0.098)。B，使用BTT的植入前和植入后以及BTR的植入前进行的层次聚类。加权基因共表达网络分析(WGCNA)确定了4个模块(M1-M4)。每个聚类特征如下：M1代表线粒体，M2代表细胞外基质，M3代表心肌收缩，M4代表糖酵解。C，BTT在每个模块中的蛋白质变化。LVAD支持期间，M4表达升高(Wilcoxon符号秩检验，P=0.0009)，而M1表达降低(Wilcoxon符号秩检验，P=0.0166)。D，主成分分析(PCA)。左图显示根据PC1和PC2上的PCA得分绘制的样本，按样本来源标记(BTT-植入前，BTT-植入后，BTR-植入前)。在M1至M4的相邻图中，样本在PC1和PC2上的位置保持不变，而样本根据每个模块的模块特征基因(ME)表达值进行标记。PCA表明PC1有助于区分LVAD植入时的BTT和BTR，而PC2反映了BTT中LVAD植入前后的变化。E，PCA与每个模块之间的相关系数分析。F，模块表达与LVAD植入时的临床病理数据之间的相关系数，包括心肌纤维化、机械辅助循环支持跨机构注册表(INTERMACS)概况状态、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室射血分数(LVEF)和BNP(脑钠肽)。分析显示LVDs与M1呈负相关，而心肌纤维化与M4呈负相关，与M2呈正相关。G，通过随机森林分析选择的预后蛋白。IDH2(线粒体异柠檬酸脱氢酶[氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸])和POSTN(骨膜蛋白)在LVAD植入时有效区分良好预后组(BTR)和不良预后组(BTT)。H，LVAD植入时BTT(n=14)和BTR(n=10)中IDH2和POSTN的相对量。IDH2(M1)在BTR中较高，POSTN(M2)在BTT中较高。I，LVAD植入时的INTERMACS心脏恢复评分(I-CARS)在BTR中主要高于BTT(Mann-Whitney U检验，P=0.002)。J，LVAD植入时BTT和BTR中IDH2/POSTN比值的相对量。IDH2/POSTN在BTR中较高。K，IDH2/POSTN受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)为0.9732(95% CI, 0.9138-1.000)，I-CARS的AUC为0.9018(95% CI, 0.7861-1 [DeLong])。使用DeLong检验的比较显示AUC差异无统计学显著性(Z=1.1043; P=0.2695)，但ROC曲线下面积表明IDH2/POSTN比值在预测心脏恢复方面优于I-CARS。L，另一组(6例BTT和7例BTR)心肌组织中抗IDH2(小鼠单克隆抗体；200×；Abcam)和抗POSTN(兔单克隆抗体；200×；ab227049)荧光双重染色的代表性图像。IDH2(红色)和POSTN(粉红色)免疫荧光染色的阳性区域在两组间存在显著差异。IDH2定位于心肌细胞的细胞质中，POSTN定位于间质的纤维化区域。M，IDH2和POSTN阳性区域的比值在BTR组中显著较高(Mann-Whitney U检验，P=0.003)。这一强大的预后方法能够使用0的临界值将样本分为BTT和BTR两组。纵轴以log10缩放。N，研究的示意图总结。糖酵解相关蛋白在LVAD植入后逐渐增加，线粒体蛋白减少。心脏可逆性与LVAD植入时更多的线粒体蛋白和更少的细胞外基质蛋白相关。

我们使用在BTT和BTR心肌中通过液相色谱-质谱检测到的满足上述标准的蛋白质(n = 412)进行加权基因共表达网络分析，并确定了4个模块(M1-M4)：M1(线粒体相关，149种蛋白)、M2(细胞外基质，100种蛋白)、M3(心肌收缩，33种蛋白)和M4(糖酵解，23种蛋白)。我们将模块特征基因的表达谱应用于层次聚类，并显示在LVAD植入时，高模块特征基因表达M1和低模块特征基因表达M2是BTR的特征(图[B])。在BTT的LVAD支持期间，M4表达升高，而M1表达降低(图[C])。

主成分(PC)分析表明PC1有助于区分LVAD植入时的BTT和BTR，而PC2有助于区分BTT中LVAD植入前后的变化(图[D])。我们计算了PC分析与每个模块特征基因表达之间的相关系数(图[E])。PC1与M1和M3呈正相关，与M2呈负相关。PC2与M4呈正相关。在LVAD植入时的分析显示左心室收缩末期内径与M1以及心肌纤维化与M4呈负相关，心肌纤维化与M2呈正相关(图[F])。

随机森林机器学习算法用于识别有助于区分BTT和BTR的蛋白质(图[G])。特别是IDH2(线粒体异柠檬酸脱氢酶[氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸])(M1)和POSTN(骨膜蛋白)(M2)被确定为与心脏可逆性相关的最显著蛋白质。与模块表达谱类似，BTR组中IDH2的蛋白表达水平高，而POSTN和TGFBI(转化生长因子-β诱导蛋白)的表达水平低(图[H])。机械辅助循环支持跨机构注册表(INTERMACS)心脏恢复评分已被提出作为LVAD植入后预后的预测因子。LVAD植入时的INTERMACS心脏恢复评分在BTR中主要高于BTT(图[I])。重点关注作为更好预后指标的IDH2/POSTN比值，我们通过受试者工作特征曲线下面积证明了IDH2/POSTN对心脏恢复的出色区分能力(图[J和K])。

此外，我们收集了另一队列的心肌组织，并对IDH2和POSTN进行了免疫荧光双重染色(图[L])。IDH2/POSTN阳性区域的比值在两组间存在显著差异(图[M])，通过免疫染色验证了IDH2/POSTN比值预测LVAD后心脏可逆性的有效性。

IDH2/POSTN比值被确定为心脏可逆性的有力预测因子。IDH2已知通过生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸并维持适当的氧化还原平衡，在线粒体抗氧化途径中发挥关键作用。线粒体功能障碍与心力衰竭中能量供需失衡相关；其校正作为改善整体心脏功能的新治疗方法已引起关注。POSTN因其在细胞外基质发育中的重要作用而被认可。线粒体减少和细胞外基质增加可能反映了心脏功能下降。

BTT在LVAD植入后糖酵解(M4)蛋白水平增加。在心力衰竭中，心肌能量代谢已知向类似胎儿的模式转变，其特征是脂肪酸代谢减少和糖酵解增加，这表明LVAD后与代谢变化相关的蛋白质组重塑。

总之，LVAD前后心肌组织的蛋白质组分析揭示了显著的蛋白质变化并确定了潜在的恢复标志物。尽管蛋白质变化可能归因于采样部位的差异，但IDH2/POSTN比值可用于预测BTR，这将推动LVAD心力衰竭患者的精准医疗发展。

致谢

我们感谢K. Sakuma和A. Nishimoto准备样本；M. Makita、T. Kitamura和Kousuke Ishino博士帮助进行蛋白质组学样本制备；I. Sakamoto进行免疫染色；Yoshimasa Kawazoe博士帮助进行统计分析；以及Ryuji Ohashi博士提供机构支持和指导。