局部脑梗死半暗带区域局部血流变化研究(PDF) ALTERATIONS OF LOCAL BLOOD FLOW IN THE PENUMBRA ZONE OF LOCAL CEREBRAL INFARCTION

局部脑梗死半暗带区域局部血流变化研究

摘要

本研究的主要目的是揭示通过光化学方法在大鼠大脑皮层诱导的中风中半暗带区域的循环变化。研究发现，在永久性缺血期间，半暗带区域血流供应的最大减少是在血管血栓形成过程完成后的24小时达到。对于处于凋亡初期的半暗带区域细胞进行治疗干预，最好在中风发生后的前12小时内进行。

关键词

光化学中风、半暗带、血流、大脑皮层、大鼠

引言

大约80-85%的中风总数是由缺血性脑梗死（缺血性中风）引起的。中风被认为是导致人口死亡率和残疾率的主要原因之一。在美国，缺血性脑损伤分别是死亡的第三大原因和成人残疾的首要原因（Ahmed等，2000）。

研究缺血性脑损伤的致病机制的主要目标之一是确定所谓的"治疗时间窗"，并开发适当的治疗方法，以最大程度地减少潜在的脑损伤。

在局灶性脑中风中，缺血区域包括一个中心区域（缺血焦点），其脑血流量急剧减少，以及一个更远端的部分，即所谓的半暗带区域，这些区域通过相邻完整血管的侧支部分供血（Bhardwaj等，2003，Ramos-Cabrer等，2011）。在缺血焦点中，根据脑血流量的严重程度及其持续时间，可能会发生不可逆的损伤，直至局部脑梗死。因此，及时干预和利用所谓的"治疗时间窗"来防止梗死的发展，以及在梗死形成的情况下，采取措施挽救半暗带区域的细胞元素，避免其发生不可逆的损伤并恢复其结构-功能组织，具有重要意义。

需要强调的是，尽管局部脑梗死问题十分紧迫，但与半暗带区域相关的形态学和功能变化问题研究不足。半暗带区域的结构和功能重组问题已在使用大脑中动脉短期闭塞模型及随后的再灌注情况下进行了更详细的研究。尽管在这种情况下，形态学重组的基本数据主要基于光镜研究，但关于半暗带区域神经元和胶质细胞的超微结构变化的数据非常稀少。此外，这些数据常常相互矛盾。例如，一些研究半暗带区域神经元损伤和死亡问题的研究人员认为，半暗带区域的选择性神经元死亡通过凋亡发生（Wang等，2001），其他作者认为神经元通过凋亡和坏死两种方式死亡（Zhao等，2001，2002），而第三种观点认为半暗带区域发生选择性神经元坏死（Lehrmann等，1997）。至于通过光化学方法诱导的局部梗死半暗带区域结构变化的发展过程，这方面的数据几乎不存在。

由于侵入性，大多数研究脑中风中生化、形态学和代谢紊乱的方法在临床环境中往往不适用，因为这些方法常常危及患者生命。

因此，广泛使用全局和局灶性缺血的动物模型来表征构成缺血性脑损伤基础的机制，测试新型抗缺血制剂的治疗效果，以及验证理论和临床假设。其中之一是光化学诱导局灶性脑梗死的方法（Watson等，1985）。在现阶段，本研究的主要目标是调查通过光化学方法在大鼠大脑半球局部皮层梗死中诱导的半暗带区域的循环变化。

材料与方法

实验在体重150-200克的雄性Wistar大鼠上进行。所有实验程序均在通过腹腔注射4%水合氯醛溶液（1毫升/100克体重）麻醉的动物上进行。

所有实验均严格按照I. Beritashvili实验生物医学中心生物伦理委员会通过的国际标准进行。

诱导局部脑梗死模型

使用了基于光化学诱导血管血栓形成方法的大脑半球局部皮层梗死实验模型（Watson等，1985）。众所周知，向动物注射光敏染料（玫瑰 Bengal）后，通过卤素灯对大脑皮层特定区域进行经颅强照射，会导致该区域形成缺血焦点。

在光束影响下，光敏染料中发生光化学反应，导致游离氧自由基的出现，引起血管内皮损伤、血小板膜损伤、血小板聚集、血管壁粘附，最终导致血管系统闭塞。

由于血管内皮损伤，毛细血管壁的通透性增加；发生脑水肿，从而加剧脑缺血损伤。血栓形成在照射30分钟时肉眼可见，并持续约4小时（Dietrich等，1987；Van Reempts等，1987）。应用了在格鲁吉亚科学院I. Beritashvili生理学研究所脑代谢调节机制研究实验室测试的部分修改方法（Mitagvaria, Nebieridze等，2001；Mitagvaria, Bakhutashvili等，2001）。实施此方法时，进行了以下操作：将加热至37°C的光敏染料玫瑰 Bengal溶液（每100克体重0.13毫升0.75%溶液）在2-3分钟内注入麻醉动物的股静脉。然后将动物置于立体定向装置中，暴露颅骨，并使用光纤导光束（直径-2mm）用250W卤素灯对额顶叶大脑皮层进行60分钟的经颅照射。

光源最终发射的功率（在颅骨表面）等于64W/cm²。在此情况下，大脑皮层照射区域的脑损伤明显（图1），并向强度降低的相邻区域延伸。受损组织的体积形状类似于截头圆锥。

图1. 大鼠脑梗死损伤的额顶叶大脑皮层区域。大量血栓形成的血管清晰可见（体积x3，约x15）

实验范式

实验在5组白鼠中进行，每组6只动物。在所有动物中，通过上述方法诱导大脑皮层梗死。对于第一组动物，在额顶叶大脑皮层经颅照射完成后4小时，以及对于II-V组动物，分别在12、24、48和96小时后，测量半暗带区域的系统动脉压（SAP）和局部血流（LBF）。为提供监测，还对大脑皮层对侧半球对称于半暗带区域的局部血流进行了测量。

在测量前，除第一组动物外，所有动物再次用水合氯醛麻醉，并在立体定向装置中放置后，在半暗带区域以及对侧半球的对称区域进行颅骨开窗（孔径-2-3mm）。对于第一组动物，即在照射过程完成后4小时进行测量的动物，无需重复麻醉。

开颅后，将活性电极（用于测量局部血流）植入大脑皮层所需区域，无需额外固定，参考电极固定在开窗孔附近的皮肤下。然后将微袖带放在动物尾巴上测量系统动脉压。局部血流和系统动脉压均在15分钟间隔内测量三次。三次测量的平均值被视为实验后获得的结果。

大脑皮层局部血流（LBF）测量

采用氢清除技术测量LBF。方法实施的最简单方案包括测量（铂丝，直径100μm）和参考（Ag-AgCl，板，直径2-3mm）电极放入极化电路中。

测量原理在于记录通过吸入途径或注入动脉系统给予脑组织的分子氢的清除曲线（浸出）。氢清除速度取决于组织血流强度，其计算根据众所周知的"初始倾斜"方法进行。使用OH-105通用极谱仪（OH-105，Radelkis，匈牙利）作为极谱仪。通常，氢的极化电压为+0.20-0.25V。该方法可用于急性和慢性实验。获得的计算结果具有高精度。

系统动脉压测量

使用"Artery"设备（由G. Abuladze教授开发）离散测量系统动脉压。将小型袖带紧密地放置在动物尾巴周围，持续加热至37°C。通过示波器测量收缩压和舒张压后，计算平均动脉压。

获得数据的统计分析

所有生理测量的结果均通过EXCEL for WINDOWS中可用的ANOVA分析工具包进行统计处理。通过学生t检验评估成对和组数据的差异可靠性。

结果及其分析

所有测量的绝对值见表1，半暗带区域局部血流的变化以初始值的百分比表示，如图2所示。

根据获得的数据，在经颅照射完成后4小时，半暗带区域的血流水平平均为30.5±1.6ml/100g/min，而在对侧半球的对称区域为58.5±1.82ml/100g/min。统计上，这些值之间的差异具有重要意义（P<0.01）。换句话说，在四小时内，半暗带区域的血流供应减少了48%。12小时后，上述变化导致以下值：半暗带区域的局部血流为17.8±1.0ml/100g/min，对侧（对照）侧为55.3±2.7；在这种情况下，差异在统计上是可靠的（P<0.01），减少量为78%。再过12小时，即大脑皮层经颅照射完成后24小时，半暗带区域的平均血流水平约为初始水平的16.4%（半暗带区域为10.1±0.74ml/100g/min，而完整对侧半球为61.5±3.2ml/100g/min）。在照射过程后24小时内记录的半暗带区域局部血流水平最低。48小时后进行的测量显示血流供应部分恢复，与先前（24小时）相比，增加了约7%（半暗带区域血流水平为13±0.64ml/100g/min，对侧半球为55±2.9ml/100g/min）。

与照射后24小时获得的数据相比，血流供应的上述增加在统计上是可靠的（P<0.05）。再过两天，即照射后4天，在半暗带区域，血流水平又增加了几个百分点，达到对照值的27.5%（半暗带区域为17.5±0.92ml/100g/min，对侧半球为63.6±3.3ml/100g/min）。在这种情况下，与先前（48小时）数据相比，半暗带区域血流供应的改善在统计上也是可靠的（P<0.05）。

因此，根据上述数据，半暗带区域血流供应的最大减少是在诱导血管血栓形成过程完成后24小时达到的，随后观察到其水平的部分恢复。对完整对侧大脑皮层梗死侧的血流水平测量显示，在所有动物组中，它在46（最低水平）和75ml/100g/min（最高水平）之间变化，在实验动物组之间未观察到统计上可靠的差异。关于系统血压也发现了类似的图像。在所有动物组中，该指标在79（最小值）和117mmHg（最大水平）之间变化。在这种情况下，动物组之间的平均值之间未观察到统计上可靠的差异。

缺血半暗带最初由Astrup等定义为一个中度缺血区域，其电活动降低，但膜功能得到支持，因此神经组织仍然存活（Astrup等，1977）。如果在缺血性中风后6-8小时内恢复正常血流，发展的神经功能缺损可以得到补偿。

根据一些研究，在中风发生后6小时内进行的血流水平测量结果并未显示半暗带区域（即中度缺血区域）的扩展，该区域围绕明确界定的中心梗死区域（Kaufmann等，1999）。

尽管如此，根据大量提供脑局部血流测量的研究，从中风发生时刻起不应考虑超过1-2小时作为真正的治疗时间窗。只有在这种情况下，通过积极措施，才能预期减少梗死体积。通常，这些措施包括使用促进再灌注或增强对缺血耐受的制剂。据信，脑梗死发展的特点主要取决于缺血的持续时间和严重程度。实验数据表明，在严重缺血情况下，仅一小时就足以形成梗死（Saver，2006）。已经发现，脑缺血区域的血流减少到每小时8ml/100g，在一小时内就保证会导致梗死（Yonas等，1990）。从计算机断层扫描（CT）得出的结论似乎接近上述结论——9ml/100g/min的血流强度应被视为脑活力的阈值。低于此阈值，脑梗死将在两小时内形成（Touho, Karasawa，1996）。

在第一小时内发展的脑血流变化具有预测价值——因为事实证明，根据这些变化，可以确定梗死发展的潜在可能性（Powers等，1985）。由于上述及其他许多数据，根据局部血流水平的指标评估梗死中心、半暗带区域及其周围区域的脑组织功能能力已成为常规做法（Furie等，2011）。局部血流水平被认为是评估缺血损伤区域及其邻近区域神经组织状态的最简单且生理上最可靠的指标，客观且明确。不仅缺血的深度，而且其持续时间对梗死形成都具有根本重要性。在永久性中风或神经组织长期中断供血的情况下，梗死会在中风焦点以及半暗带区域发展（Zhao等，1997）。此外，应该注意的是，在半暗带周围区域，只有单个神经元可能会死亡，其密度不足以形成梗死焦点。局灶性缺血不是唯一现象，可能具有不同性质。在其早期阶段，由于钠转运穿过血脑屏障（BBB）进入缺血区域的激活，可能会形成显著的细胞间水肿（Shalvi Mahajan, Hemant Bhagat，2016）。再灌注以及长期或永久性缺血，反过来可能导致非常戏剧性的结果。

相当彻底的实验研究表明，在全局和局灶性缺血中，缺血后血流减少与梗死的进一步扩展和加重之间不存在直接相关性。在注定要梗死的半暗带区域，缺血一小时后葡萄糖消耗减少了50%或更多，而在缺血后期间，低葡萄糖代谢与局部血流之间观察到密切相关性（van Golen等，2013）。在局灶性缺血的缺血后期间（在其停止后的前12小时内），焦点区域本身的血流水平正常，但半暗带通常约为正常值的40-50%（Nagasawa等，1989）。然而，像全局缺血一样，未观察到血流与代谢之间相关性受损的证据。在某些情况下，进行的测量显示，此时ATP水平在缺血前水平的70%至100%之间，不被认为是非常显著的下降。根据Chen等的研究，已显示出缺血后血流增加与梗死大小减少之间存在非常清晰的相关性，这与前列腺素合成抑制有关（Chen等，1995）。

前列腺素代谢阻断（除血管舒张外）还有许多其他潜在的积极效果，例如预防自由基产生。

进行的实验研究并未表明增加缺血后血流对防止半暗带区域发生可能的缺血性损伤具有根本重要性，这与基于"功能-代谢-血流"偶联运作的概念非常一致。

换句话说，在这个阶段，关于血流供应在缺血性脑损伤形成中的意义的观点，不能确定地批准，即在全局或局灶性缺血中，损伤发展和扩展的主要原因是缺血后期间血流供应的减少，因为这是由代谢强度降低"决定"的。

因此，增加局部缺血后脑血流几乎不可能具有保护性质（KUNZ和IADECOLA，2009）。这一乍看之下悖论的结论，不应降低缺血性损伤对中风时血流水平的潜在关键敏感性，特别是在局灶性、暂时性缺血时，当半暗带血流水平处于"过于损伤"和"单纯损伤"的范围内。

在我们的实验中，考虑了永久性（或延长至实验完成）缺血，当讨论不存在的再灌注的作用（如果不是通过任何药理途径诱导）时是无用的。在永久性缺血中，由于缺乏再灌注以及所有相关戏剧性变化（内皮细胞层损伤，再灌注第30分钟时蛋白质释放），可能会导致组织血流供应及其形态图像的部分改善（在我们的实验中显示）。

毫无疑问，使用各种脑中风实验模型并研究实验动物脑损伤区域发展中出现的形态学、生化和功能障碍，对于检测中风的机制和过程以及提供早期治疗具有重要意义。同样清楚的是，每个实验模型仅部分反映人类大脑中发生的缺血性变化。

因此，使用不同的脑缺血模型是互补的，这使得有可能更接近确定人类中风的内在机制。

在文献中，有大量数据表明，除了所谓的"闭塞"模型（例如，基于SCA闭塞的模型）外，局部脑梗死的光化学模型最精确地反映了人类脑缺血性损伤（Van Gelderan等，1994）。

尽管光化学诱导的损伤是快速进展障碍、血脑屏障破坏和血管源性水肿的结果，但缺血焦点中的细胞变化发生相当长的时间，并具有与使用"闭塞"模型相同的趋势（Lee等，1996）。

还应该指出，与"闭塞"模型相比，光化学诱导的局部缺血模型的特点是非常好的人体工程学：易于实施、可重复、相对无创，并且虽然假设该模型不能反映临床上观察到的缺血性变化，但表观扩散系数-ADC和细胞变化与中风发生时非常相似（Purushotham等，2015）。此外，该方法不仅可以成功应用于检测大脑半球局部皮层梗死发展中缺血性脑损伤进展的基本机制并寻找新的有效治疗方法和方法，还可以进行旨在检测大脑皮层各个区域和区域在学习、记忆、行为等基本功能实施中的作用的研究（例如，Kelly等，2001；Diehm等，2003；Reinecke等，2003等）。

结论

研究发现，在永久性缺血期间，半暗带区域血流供应的最大减少是在血管血栓形成过程完成后的24小时达到的。对处于凋亡初期的半暗带区域细胞进行治疗干预，最好在中风发生后的前12小时内进行。

参考文献

1. Ahmed S-H., Shaikh A. Y., Shaikh Z. Y., Hsu C. Y., 2000. What animal models have taught us about the treatment of acute stroke and brain protection. Curr. Atheroscler. Rep., 2, 167-180.
2. Astrup J., Symon L., Branston N., Lassen N., 1977. Cortical evoked potential and extracellular K+ and H+ at critical levels of brain ischemia. Stroke, 8, 51-57.
3. Bhardwaj A. J., Alkayed N. J., Kirsch J. R., Hurn P.D., 2003. Mechanisms of ischemic brain damage. Curr. Cardiol. Rep.,5, 160-167.
4. Chen J., Weinstein P., Graham S., 1995. Attenuation of postischemic brain hypoperfusion and reperfusion injury by the cyclooxygenase-lipoxygenase inhibitor BW755C. J, Neurosurg., 83, 99-104.
5. Diehm S. M., Witte O. W., Bruehl C., 2003. Differential alterations of the inactivation properties of high voltage activated calcium currents in area CA1 and CA3 f the rat following photothrombotic lesion. Neurosci. Lett., 341, 147-150.
6. Dietrich W. D., Watson B.D., Busto R., Ginsberg M. D. Bethea J. R., 1987. Photochemically induced cerebral infarction, I: early microvascular alterations. Acta Neuropathol. (Berl.), 72, 315-325.
7. Furie KL, Kasner SE, Adams RJ, et al., 2011. Guidelines for the Prevention of Stroke in Patients with Stroke or Transient Ischemic Attack: A Guideline for Healthcare Professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 42, 1, 227–76.
8. Kaufmann A., Firlik A., Melanie D., Fukui B., Wechsler L., Jungries A., Yonas H., 1999. Ischemic core and penumbra in human stroke. Stroke, 30, 93-99.
9. Kelly K. M., Kharlamov A., Hentosz T. M., Kharlamova E. A., Williamson J. M., Bertram E. H., Kapur J., Armstrong D. M., 2001. Photothrombotic brain infarction results in seizure activity in aging Fischer 344 and Sprague Dawley rats. Epilepsy Res.,47, 189-203.
10. Kunz Alexander and Iadecola Costantino., 2009. Cerebral vascular dysregulation in the ischemic brainHandb Clin Neurol., 92: 283–305. doi: 10.1016/S0072-9752(08)01914-3
11. Lee V. M., Burdett N. G., Carpenter T. A., Hall L. D., Pambikain P. S., Patel S., Wood N. I., James M. F., 1996. Evolution of photochemically induced cerebral ischemia in the rat. Stroke, 27, 2110-2119.
12. Lehrmann E., Christensen T., Zimmer J., Diemer N. H., Finsen B., 1997. Microglia and macrophage reactions mark progressive changes and define the penumbra in the rat neocortex and striatum after transient middle cerebral artery occlusion. J. Comp. Neurol., 386, 461-476.
13. Mitagvaria N., Nebieridze M., Kakabadze T., Erkomaishvili I. Sildenafil citrate (viagra) aggravates development of cerebral infarction. 2001, Clin. Hemorheol. and Microcircul., 24, 212-213.
14. Mitagvaria N., Bakhutashvili V., Sanikidze T., Nebieridze M., Pipia N., 2001, Plaferon-LB prevents development of cerebral infarction after photochemically induced thromboses in the rats. Georgian J Neuroscien., 1, 13-27.
15. Nagasawa H., Kogure K., 1989. Correlation between cerebral blood flow and histological change in a new rat model of cerebral artery occlusion. Stroke, 20, 1037-1043.
16. Powers W., Grubb R., Darriet D., Raichle M., 1985. Cerebral blood flow and cerebral metabolic rate of oxygen requirements for cerebral function and viability in humans. J. Cereb. Blood Flow Metab., 5, 600-608.
17. Purushotham A, Bruce C. V. Campbell, Matus Straka, et al. 2015. Apparent diffusion coefficient threshold for delineation of ischemic core. Int J Stroke. 10, 3, 348–353.
18. Ramos-Cabrer P, Campos F, Sobrino T, Castillo J., 2011. Targeting the ischemic penumbra. Stroke. 42 (1 Suppl): S7-11. doi: 10.1161/STROKEAHA.110.596684
19. Reinecke S., Dinse H. R., Reinke H., Witte O.W., 2003. Induction of bilateral plasticity in sensory cortical maps by small unilateral cortical infarctin in rats. Eur. J. Neurosci., 17, 623-627.
20. Saver J.L., 2006. "Time is brain - quantified". Stroke. 37, 1, 263–6. doi: 10.1161/01.STR.0000196957.55928.ab
21. Shalvi Mahajan, Hemant Bhagat, 2016, Cerebral oedema: Pathophysiological mechanisms and experimental therapies. Journal of Anesthesiology and Critical Care. CONFERENCE PROCEEDING, 3, 4, 22-28.
22. Van Gelderan P., de Vleeschouwer M. H. M., DesPres D., Pekar J., van Ziyl P. C. V., Moonen C. T., 1994. Water diffusion and acute stroke. Magn. Reson. Med., 31, 154-163.
23. Van Golen, Marc C. Huisman, Richard G. Ijzerman, et al., 2013. Cerebral Blood Flow and Glucose Metabolism Measured with Positron Emission Tomography Are Decreased in Human Type 1 Diabetes. Diabetes Aug; 62, 8, 2898-2904.
24. Van Reempts J., Van Deuren B., Van de Ven M., Cornelissen F., Borgers M., 1987. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke, 18, 1113-1119.
25. Wang G. X., Li G. R., Wang Y. D., Yang T. S., Ouyang Y. B., 2001. Characterization of neuronal cell death in normal and diabetic rats following experimental focal cerebral ischemia. Life Sci.,69, 2801-2810.
26. Watson B. D., Dietrich W. D., Busto R., Watchel M. S., Ginsberg M. D., 1985. Introduction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol., 17, 497-504.
27. Yonas H., Gur D., Classen D., Wolfson S.K., Moossy J., 1990. Stable xenon enhanced computed tomography measurement of cerebral blood flow in reversoble focal ischemia in baboons. J. Neurosurg., 73, 266-273.
28. Zhao Q., Belaiev L., Ginsberg M., 1997. Transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal suture. II Neurological deficits and pixel-based correlation of histopathology with local blood flow and glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab., 17, 1281-1290.
29. Zhao F., Kuroiwa T., Miysaka N., Nagaoka T., Nakane M., Tamura F., Mizusawa H., 2001. Characteristic changes in T(2)-value, apparent diffusion coefficient, and ultrastructure of substantia nigra evolving exofocal post-ischemic neuronal death in the rat. Brain Res., 895, 238-244.
30. Zhao F., Kuroiwa T., Miysaka N., Nagaoka T., Nakane M., Tamura F., Mizusawa H., 2002. Ultrastructural and MRI study of the substantia nigra evolving exofocal post-ischemic neuronal death in the rat. Neuropathol., 22, 91-105.

【全文结束】