摘要
背景
先天性心脏病儿童存在神经发育不良的风险。肠道微生物组可能通过肠脑轴影响神经发育结果。本研究调查了早期肠道微生物组与神经发育结果的关联。
方法
在心脏重症监护室进行了一项前瞻性队列研究。在手术前、手术后和出院前收集粪便样本。使用贝利婴儿和幼儿发展量表在9-12个月进行神经发育测试。对16S核糖体RNA V4区域的微生物数据进行处理。使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2和MicrobiomeAnalyst 2.0分析微生物组数据。
结果
分析了24名患者：15名（62.5%）为男性，12名（50%）为白人。认知能力（Chao1 P = 0.024）和语言评分（Chao1 P = 0.018）较低的儿童α多样性较低；β多样性显示边缘显著差异（Jaccard P = 0.102和P = 0.051）。较低的认知评分与较少的副拟杆菌属（Parabacteroides）（P = 0.031）、拟杆菌属（Bacteroides）（P = 0.041）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.047）相关；较低的语言评分与较少的双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.044）和肠球菌属（Enterococcus）（P = 0.024）相关。较低的运动评分与较少的罗氏菌属（Rothia）（P = 0.017）相关，但与更高的沙雷氏菌属（Serratia）（P < 0.001）、不动杆菌属（Acinetobacter）（P = 0.016）和变形杆菌属（Proteus）（P = 0.013）丰度相关。
结论
先天性心脏病且认知和语言评分较低的儿童α多样性较低且抗炎菌群（如双歧杆菌属）较少，而运动评分较低的儿童则有更高丰度的促炎菌群（如沙雷氏菌属、不动杆菌属和变形杆菌属）。需要进一步研究以了解肠道微生物失调对先天性心脏病儿童神经发育的纵向影响。
引言
先天性心脏病是最常见的出生缺陷，约占所有出生的1%，其中约25%将在新生儿期需要手术。心脏护理的快速进展显著提高了存活率。然而，先天性心脏病的存活者面临各种合并症，包括神经发育问题（如认知功能、语言和运动发展）。约50%的先天性心脏病儿童也存在神经发育障碍。美国心脏协会关于先天性心脏病患者预后的声明将神经发育延迟视为影响这些儿童生活质量的最重要合并症之一。目前仍存在一个缺口，即识别有助于神经发育监测和管理的因素，最终改善先天性心脏病存活者的长期生活质量。
肠脑轴是肠道与大脑之间的一个双向通信网络，是研究肠道微生物组在神经发育障碍中作用的有前景领域。同时，肠道微生物组对先天性心脏病儿童的影响是一个日益增长的研究兴趣领域。肠道微生物组由生活在人体胃肠道中的全部微生物组成，与宿主表现出复杂的相互作用，并可能通过肠脑轴影响神经发育。该轴通过神经递质、代谢物和免疫信号促进肠道微生物群与中枢神经系统之间的通信。因此，肠脑轴的破坏可能导致能量获取、炎症和短链脂肪酸产生的改变，进而可能导致先天性心脏病儿童的神经发育延迟。先天性心脏病婴儿由于早期接触心脏手术、抗生素以及口咽、胃和肠道中的气管插管和喂养管，特别容易受到肠道微生物组失调的影响。
尽管新兴文献支持先天性心脏病儿童肠道微生物组失调的发现，但大部分工作集中在围手术期。早期肠道微生物组对儿童神经发育的长期影响尚未得到研究。此外，现有文献开始支持早期肠道微生物组在健康幼儿神经发育中的作用。然而，肠道微生物组与先天性心脏病婴儿神经发育结果之间的关联仍不明确。本研究的目的是描述先天性心脏病婴儿肠道微生物组与神经发育结果（即认知功能、语言和运动发展）之间的关联。我们假设肠道微生物组失调与先天性心脏病婴儿的神经发育评分降低相关。具体而言，我们还假设较低的相对α和β多样性与先天性心脏病婴儿的神经发育评分降低相关。此外，我们假设有益菌群（如双歧杆菌属）的相对丰度较低与先天性心脏病婴儿的神经发育评分降低相关。本研究的主要结果是确定肠道微生物失调与神经发育评分的关联。
材料与方法
设计
我们于2021年至2023年在亚特兰大儿童医疗保健中心对24名先天性心脏病婴儿进行了一项前瞻性队列研究。本研究根据赫尔辛基宣言的指南进行。所有涉及人类参与者的程序均获得机构审查委员会（STUDY0000264(2)）的批准。在获得父母或监护人的书面知情同意后收集样本。我们的主要结果是确定肠道微生物失调与不良神经发育评分的关联。失调定义为较低的α多样性、较低的β多样性或有益菌群的丧失；较低的神经发育评分是通过比较贝利测试低于平均水平与高于平均水平的肠道微生物组来衡量的。
参与者和环境
纳入2021年至2023年在亚特兰大儿童医疗保健中心心脏重症监护室住院的先天性心脏病新生儿。符合条件的儿童在9至12个月期间进行了门诊神经发育评估。排除标准包括（1）由于回肠切除术或结肠切除术导致短肠而无法耐受肠内喂养的婴儿；（2）手术时早产<36周的婴儿；（3）心脏手术后在心脏重症监护室以外的其他医院单元恢复的婴儿；以及（4）在心脏重症监护室出院前死亡的婴儿。
程序
在获得同意后识别并纳入符合条件的婴儿。数据记录到REDCap中。在住院期间三个时间点收集粪便样本（手术前[T1]、手术后[T2]和出院前[T3]）。使用人类微生物组项目建立的标准肠道微生物组数据收集程序作为协议。
测量
人口统计学和临床因素
婴儿的人口统计学数据，包括性别、年龄、诊断年龄以及种族和民族，由父母或法定监护人报告。临床变量包括诊断、手术程序和婴儿健康史（如母亲产前史、药物、阴道分娩与剖宫产以及饮食组成[人乳、婴儿配方奶或两者]），这些数据由父母自我报告或从医疗记录中收集。
肠道微生物组
在排便后，通过棉签从参与者的尿布中收集三个粪便样本：一个用于数据分析，一个用于质量控制，一个用于必要时存储。收集的粪便样本在收集后4小时内转移到大学实验室，并储存在-80°C的锁定实验室冷冻柜中，直到分析。所有收集的数据均匿名，并记录在安全大学服务器上密码保护文件中的安全电子表格中。样本在住院期间的三个不同时间点（T1、T2和T3）收集。详细方法已在我们之前的工作中发表。
神经发育测试
根据常规术后门诊护理和第一年内的最佳实践建议，进行认知功能、语言和运动发展的标准化测试。发育评估由一位在先天性心脏病术后儿童护理方面有经验的训练有素的儿童心理学家使用贝利婴儿和幼儿发展量表（贝利）进行。贝利用于检测早期发育延迟，并已在临床和研究环境中使用。第四版于2019年出版，适用于1至42个月的儿童，测量五个领域的神经发育：认知、运动、语言、社会情感和适应行为。分析中使用的领域基于可用数据，缺失数据的领域（如情感和适应行为）未进行分析。共有29名患者符合条件，其中5名患者缺少贝利评分，留下24名进行分析。贝利量表的平均综合评分为100。由于样本量小，患者被分为认知、语言和运动评分低于平均分的患者与那些达到或高于这些维度平均分的患者，并作为二元结果进行分析。
感兴趣的暴露和结果
我们感兴趣的暴露是肠道微生物失调对神经发育结果的影响。肠道微生物失调定义为较低的相对α多样性、较低的相对β多样性或有益菌群的相对丰度较低。患者被分为贝利评分低于平均分的认知、语言和运动发展患者与达到或高于认知、语言和运动评分平均分的患者。然后我们调查了神经发育结果与肠道微生物失调（较低的相对α多样性、较低的相对β多样性和有益菌群的相对丰度较低）之间的关联。
DNA提取和测序
肠道微生物组的细菌DNA提取和测序在加拿大温哥华的Microbiome Insight进行，遵循人类微生物组项目标准操作协议。本研究对16S核糖体RNA（16S rRNA）V4区域进行测序。文库制备、测序过程和测序数据的详细信息在先前出版物中提供。
统计分析
本研究分析了从更大父母队列研究中获得的既有肠道微生物组又有神经发育结果数据的儿童子集。父母研究纳入了41名先天性心脏病婴儿，其人口统计学特征如下：手术时平均年龄6.3天（SD = 8.0），58.5%为男性，53.7%为白人，95.1%为西班牙裔，51.2%为阴道分娩，31.7%为母乳喂养。其中，24名儿童被纳入当前分析，其人口统计学特征与父母队列相似。基于神经发育评分，患者被分析为贝利评分低于平均水平与高于平均水平的患者。
使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME 2）处理、过滤16S rRNA V4基因序列并聚类为计数数据。在QIIME 2中，使用Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2进行序列质量控制（例如修剪序列和过滤phiX读数和嵌合序列）。序列通过细菌分类学分析使用Silva v132数据库进行过滤，阈值为99%。使用条形图说明时间点和神经发育结果的关键微生物。使用相对丰度≥0.001和样本流行率≥10%的阈值，进行核心微生物组分析以识别在时间点组成保持稳定的属。使用Spearman秩相关探索与神经发育结果相关的微生物模式。核心微生物组和模式分析均使用MicrobiomeAnalyst 2.0完成。
使用QIIME 2和MicrobiomeAnalyst 2.0进行多样性分析和丰度分析，以研究肠道微生物失调与神经发育结果之间的关联。使用观察到的操作分类单元、Chao1和Shannon指数估计α多样性（样本内）。进行Spearman相关分析以分析连续变量的α多样性估计值，对分类变量使用Mann-Whitney U检验。使用Bray-Curtis和Jaccard距离度量和主坐标分析来可视化β多样性（样本间）的神经发育结果模式。使用置换方差分析来测试β多样性与神经发育结果之间的关联。
线性判别分析效应大小是一种生物标志物发现方法，可识别具有统计显著性和生物学相关性的特征。具体而言，使用Kruskal-Wallis和秩检验检测肠道微生物特征，这些特征在达到或高于与低于平均神经发育结果评分（即认知、语言和运动领域）的参与者之间显示出显著差异丰度。随后，应用线性判别分析效应大小来估计每个差异丰度特征的效应大小，使用P < 0.05的显著性阈值和2的线性判别分析分数（效应大小）阈值。然后使用微生物组多变量关联与线性模型2拟合一般线性模型，以检查肠道微生物特征与神经发育结果之间的关联。这些模型包括主要结果变量、协变量和阻断因素。在本研究中，微生物组多变量关联与线性模型2识别了与神经发育结果相关的肠道微生物特征（建模为固定效应），同时控制相关协变量（也建模为固定效应）。协变量包括性别、种族、分娩方式、喂养类型和研究时间点，基于它们与肠道微生物组的显著相关性进行选择。报告了未经调整的P值和使用Benjamini-Hochberg程序的错误发现率调整P值，边际统计显著性定义为P < 0.1，统计显著性定义为P < 0.05。
结果
参与者特征
29名先天性心脏病儿童符合纳入标准，其中5名因缺少贝利测试评分被排除，留下24名进行分析（表1）。其中，15名（62.5%）为男性，12名（50%）为白人，23名（95.8%）为非西班牙裔，7名（29.6%）患有大动脉转位。有8名（33.3%）婴儿仅接受母乳喂养，7名（29.2%）接受配方奶，9名（37.5%）接受母乳和配方奶的组合。
表1. 参与者描述。
变量 数据
人口统计学和临床特征 N = 24
手术前年龄（天），平均值（SD） 5.6（8.8）
性别，n（%）
女性 9（37.5）
男性 15（62.5）
种族，n（%）
白人 12（50.0）
黑人 9（37.5）
双种族或其他 3（12.5）
民族，n（%）
西班牙裔或拉丁裔 1（4.2）
非西班牙裔或拉丁裔 23（95.8）
喂养类型，n（%）
两者 9（37.5）
母乳 8（33.3）
配方奶 7（29.2）
分娩方式，n（%）
剖宫产 12（50.0）
阴道 12（50.0）
诊断，n（%） N = 24
D-TGA 7（29.6）
法洛四联症 2（3.7）
Shone复合症 2（3.7）
双出口右心室 2（7.4）
肺动脉闭锁 1（3.7）
动脉干 1（3.7）
室间隔缺损 4（14.8）
单心室 1（3.7）
其他 10（37.0）
神经发育测量 N = 24
贝利综合评分
认知功能，平均值（SD） 100.83（15.0）
低于平均值（<100），n（%） 6（25.0）
达到或高于平均值（≥100），n（%） 18（75.0）
语言发展，平均值（SD） 103.5（11.5）
低于平均值（<100），n（%） 8（33.3）
达到或高于平均值（≥100），n（%） 16（66.7）
运动发展，平均值（SD） 102.2（16.5）
低于平均值（<100），n（%） 7（29.2）
达到或高于平均值（≥100），n（%） 17（70.8）
- 缩写：DORV，双出口右心室；D-TGA，大动脉转位；VSD，室间隔缺损。
肠道微生物组的特征
图1A按研究时间点（T1、T2和T3）展示了最常见的属。基于研究时间点（T1、T2和T3）的认知功能、语言发展和运动发展的神经发育结果的属分别在图1B-D中展示。核心微生物组分析成功识别了按时间点的先天性心脏病儿童的主要常见属（图S1）。
图1 基于研究时间点和神经发育结果的分类谱。 （A）基于研究时间点（手术前[T1]、手术后[T2]和出院前[T3]）的微生物属。 （B）基于认知功能和研究时间点的微生物属。 （C）基于语言发展和研究时间点的微生物属。 （D）基于运动发展和研究时间点的微生物属。
与神经发育结果相关的肠道微生物组模式
图S2展示了与神经发育结果认知功能、语言和运动发展相关的肠道微生物模式。
肠道微生物组与神经发育结果之间的关联
α多样性
与达到或高于平均水平的认知功能评分相比，低于平均水平的患者α多样性显著较低（观察到的操作分类单元P = 0.024，Chao1 P = 0.024，Shannon P = 0.052；图2A）和语言评分（观察到的操作分类单元P = 0.018，Chao1 P = 0.018，Shannon P = 0.028；图2B）。运动评分的α多样性无差异（观察到的操作分类单元P = 0.282，Chao1 P = 0.282，Shannon P = 0.751；图2C）。
图2 α多样性和神经发育结果：（A）与认知功能的关联，（B）与语言发展的关联，以及（C）与运动发展的关联。对于每个结果，报告了观察到的操作分类单元、Chao1和Shannon指数。对分类变量进行Mann-Whitney U检验以分析α多样性估计值。OTU，操作分类单元。
β多样性
低于平均水平与达到或高于平均水平的神经发育评分之间存在边缘显著的差异。具有达到或高于平均水平的认知评分（图3A）和语言评分（图3B）的先天性心脏病儿童表现出更高的β多样性，但运动评分无差异（图3C）。
图3 β多样性和神经发育结果：（A）与认知功能的关联，（B）与语言发展的关联，以及（C）与运动发展的关联。对于每个结果，报告了Bray-Curtis（1）和Jaccard（2）距离度量。使用置换方差分析测试β多样性与神经发育结果之间的关联。
丰度分析
表S1使用线性判别分析效应大小总结了肠道微生物组与神经发育结果之间的关联。对于认知功能，达到或高于平均水平的患者显示出副拟杆菌属（Parabacteroides）（P = 0.059）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.062）、Finegoldia（P = 0.075）和拟杆菌属（Bacteroides）（P = 0.097）的富集相对丰度（表S1A）。对于语言发展，达到或高于平均水平的患者显示出双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.054）、沙雷氏菌属（Serratia）（P = 0.097）、罗氏菌属（Rothia）（P = 0.099）和未分类属（P = 0.033）的富集，而低于平均水平的患者显示出肠球菌属（Enterococcus）（P = 0.017）、Romboutsia（P = 0.054）和Muricomes（P = 0.054）的富集（表S1B）。对于运动发展，达到或高于平均水平的患者显示出韦荣球菌属（Veillonella）（P = 0.010）、副拟杆菌属（Parabacteroides）（P = 0.027）、罗氏菌属（Rothia）（P = 0.033）和流感嗜血杆菌属（Haemophilus）（P = 0.087）的富集，而低于平均水平的患者显示出沙雷氏菌属（Serratia）（P = 0.004）、变形杆菌属（Proteus）（P = 0.008）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）（P = 0.033）、不动杆菌属（Acinetobacter）（P = 0.033）和Romboutsia（P = 0.033）的富集（表S1C）。
进一步分析（表S2）使用微生物组多变量关联与线性模型2进行，控制性别、种族、分娩方式、喂养类型和研究时间点。对于认知功能，低于平均水平的儿童副拟杆菌属（Parabacteroides）（P = 0.031）、拟杆菌属（Bacteroides）（P = 0.041）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.047）的相对丰度较低（图4A和表S2A）。此外，语言评分低于平均水平的儿童肠球菌属（Enterococcus）（P = 0.024）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）（P = 0.044）和未分配属（P = 0.027）的相对丰度较低（图4B和表S2B）。最后，运动评分低于平均水平的儿童罗氏菌属（Rothia）（P = 0.017）的相对丰度较低，但沙雷氏菌属（Serratia）（P < 0.001）、不动杆菌属（Acinetobacter）（P = 0.016）和变形杆菌属（Proteus）（P = 0.013）的相对丰度较高（图4C和表S2C）。尽管在使用线性判别分析效应大小和微生物组多变量关联与线性模型2的两种分析中，在错误发现率调整后所有关联都失去了统计学意义，但这些发现突出了可能与神经发育相关的多种菌群，并值得在更大队列中确认。
图4 使用微生物组多变量关联与线性模型的分类丰度分析。本研究拟合模型以检查肠道微生物组与神经发育结果之间的关联，同时控制性别、种族、分娩方式、喂养类型和研究时间点。（A）与认知功能相关的三种分类，（B）与语言发展相关的三种分类，以及（C）与运动发展相关的四种分类。
讨论
本研究描述了早期肠道微生物组与先天性心脏病儿童神经发育结果（即认知功能、语言和运动发展）之间的关联。较低的认知和语言评分与较低的α多样性相关，并在β多样性上表现出差异，具有相对丰富的菌群变化。具体而言，先天性心脏病且认知评分较低的儿童副拟杆菌属、拟杆菌属和双歧杆菌属较少；语言评分较低的儿童肠球菌属和双歧杆菌属较少；运动评分较低的儿童罗氏菌属较少但沙雷氏菌属、不动杆菌属和变形杆菌属较多。这些发现突出了可能与神经发育相关的多种菌群，如副拟杆菌属、肠球菌属和双歧杆菌属，值得在更大队列中进一步研究。
对肠道微生物组在神经发育障碍中的作用的理解正在增长，需要研究微生物组与先天性心脏病儿童之间的相互作用。几项研究假设了肠脑轴的存在，其中肠道和大脑之间的通信通过几条途径发生，包括与肠道相关的炎症、激素和神经递质，并进一步由肠道微生物组衍生的代谢物调节。这种双向通信理论上通过细菌上调或下调介导细胞因子产生的基因等机制发生，以及产生血清素并在迷走神经刺激中起作用的肠嗜铬细胞。动物模型已经证明了肠道微生物组与小鼠运动和行为控制之间的关系，表明血脑屏障的通透性更高。研究描述了先天性心脏病婴儿相对大脑不成熟，这可能会损害血脑屏障的通透性，因此增加的促炎细菌可能通过这种机制影响大脑发育。
在本研究中，认知和语言评分较低的患者α多样性降低，即样本内存在的分类单元的丰富度和均匀度降低。这种肠道微生物多样性对神经发育评分的改变机制可能通过肠脑轴介导。在母体微生物组研究中，降低的α多样性与改变的胰岛素敏感性相关，可能增加胎儿发育先天性心脏病的风险，而β多样性与先天性心脏病儿童的较低生长相关，可能是因为存在促炎细菌和改变的能量代谢，可能损害后期的神经发育结果。这支持了越来越多的证据，表明失调的肠道微生物组（在多样性和组成方面）可能影响肠脑轴途径（如炎症和代谢组学途径）。
我们的研究发现，认知评分较低的患者副拟杆菌属、拟杆菌属和双歧杆菌属的丰度较低。此外，语言评分较低的儿童肠球菌属和双歧杆菌属的丰度也较低。研究表明，总体而言，先天性心脏病儿童与健康对照组相比副拟杆菌属的丰度较低。拟杆菌属和副拟杆菌属也与较低的体重和较小的头围以及3岁时较低的沟通和个人社交技能相关。有趣的是，关于肠球菌属与神经发育结果的关联的文献有限，一项研究表明语言障碍儿童与较高丰度的兼性厌氧菌如肠球菌属相关，而非较低，这与我们在研究中发现的相反。在生命最初3年内接受抗生素治疗的儿童中，肠道微生物组明显改变，双歧杆菌属减少。双歧杆菌属的较高相对丰度与抗炎作用相关，并可能影响婴儿行为和情绪处理，且可能持续超过第一年。一项荟萃分析显示，双歧杆菌属丰度降低与自闭症谱系障碍相关，特别是与其他几种细菌一起，并与自闭症症状的严重程度相关，可能通过双歧杆菌属对γ-氨基丁酸产生的介导，这是一种神经递质。在先天性心脏病中，母亲的双歧杆菌属和乳酸杆菌属在患有先天性心脏病的婴儿中较低，脂多糖（一种促炎介质）增加，进一步表明双歧杆菌属在先天性心脏病中的作用。因此，生命早期双歧杆菌属的减少可能影响先天性心脏病儿童的长期神经发育结果。这一发现可能为先天性心脏病儿童的管理提供信息，因为他们经历了显著的早期生活压力源（如手术），这些压力源可能影响抗炎细菌分类单元（如双歧杆菌属和乳酸杆菌属）的定植。这一发现有助于有限的文献支持继续检查肠道微生物分类单元与先天性心脏病儿童神经发育结果之间的联系，提供可能的未来治疗靶点。
本研究的局限性在于样本量小和单中心招募，从而限制了对更大人群的普遍性。同时，对多次比较应用了错误发现率调整。某些变量，如民族和诊断类型，由于方差有限或类别过多而未包含在调整中。尽管存在这些局限性，但仍发现肠道微生物组的改变与较低的认知、语言和运动评分相关，否则不会预期。其次，我们的研究使用16S rRNA扩增子进行肠道微生物组测序，可以识别细菌的存在，但不报告肠道微生物组的功能。需要进一步使用多组学方法（如鸟枪法宏基因组学和代谢组学）来进一步揭示肠道微生物组的功能。最后，本研究仅限于第一年的随访。需要额外的纵向研究来进一步完善这一人群的肠脑轴和神经发育结果。
总之，早期肠道微生物组的改变与先天性心脏病儿童第一年内的较低神经发育评分相关。在神经发育评分较低的儿童中，特别是在认知功能和语言发展方面，发现了较低的多样性和抗炎细菌（如双歧杆菌属）的较低丰度。这些发现表明了一种影响肠脑轴的机制，可能由炎症或促炎代谢物介导，可能对这些儿童的神经发育产生负面影响。需要进一步研究以了解微生物失调对先天性心脏病儿童神经发育的纵向影响。
作者贡献
Michael P. Fundora对审阅和编辑、原始草稿、监督、资源、项目管理、方法、调查、资金获取和概念化做出了贡献。Lily Dressner对审阅和编辑、项目管理以及方法做出了贡献。Christina Calamaro对审阅和编辑、方法、调查、数据管理、资金获取和概念化做出了贡献。Ann-Marie Brown对审阅和编辑、方法、调查和概念化做出了贡献。Amelia St. John对审阅和编辑、项目管理、数据管理以及概念化做出了贡献。Rachael Keiffer对审阅和编辑、方法、数据管理以及概念化做出了贡献。Nneka Alexander对审阅和编辑、数据管理和概念化做出了贡献。Hui Huang对审阅和编辑、方法和形式分析做出了贡献。Scott Gillespie对审阅和编辑、方法和形式分析做出了贡献。Patricia Wei Denning对审阅和编辑、方法和调查做出了贡献。Kolby Sanders-Lewis对审阅和编辑、项目管理、资金获取和数据管理做出了贡献。Jinbing Bai对审阅和编辑、可视化、监督、资源、方法、资金获取、形式分析、数据管理和概念化做出了贡献。
致谢
感谢所有父母同意参与。
利益冲突声明
无声明。
【全文结束】
