水培栽培大蒜样品中硒吸收研究的硒形态分析 - 硒与微生态

摘要

硒是人类和植物的重要营养来源。目前，包括硒酸盐和亚硒酸盐在内的无机硒被用于种植富硒作物，以解决人们的硒缺乏问题。大蒜作为葱属的主要积累植物，当在富含硒的土壤中生长时，可以吸收超过1000 mg/kg的硒浓度。在本研究中，大蒜样品在无土介质中发芽后，被转移到含有三种不同浓度亚硒酸钠(Na₂SeO₃)的水培培养介质中。冻干的150 μM大蒜提取物中根部和叶片的总硒含量分别为43.8 ± 33.2和62.7 ± 16.4 mg/kg (n = 4)，而酶提取的叶片和根部中的总硒含量分别为10.3 ± 2.0和10.6 ± 5.9 mg/kg (n = 4)。此外，硒形态分析表明，甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)是大蒜中的主要有机硒化合物。同时检测到未知的硒物种，表明需要进一步研究以确定它们。

引言

大蒜是一种通过无性繁殖栽培了很长时间的园艺作物。大蒜不仅自古以来用于增强食物风味，还因其治疗特性而被广泛使用。其健康益处的主要原因在于存在大蒜素分子。大蒜含有多种分子和矿物质，包括碳水化合物、纤维、蛋白质、镁、钾等。有机硫分子赋予大蒜药用、烹饪和杀虫特性。大蒜的有机硫成分导致其具有刺激性和收敛性气味。

硒与硫有着密切的关系。硒(Se)可以在多种代谢过程中替代硫(S)。由于硒和硫的化学和物理特性相似，硒可以在植物的代谢过程中替代硫。这导致它们在吸收、运输和植物中整合过程中的竞争。硒酸盐(SeO₄²⁻)使用与硫酸盐(SO₄²⁻)相同的同化机制进行化学还原，并成为含硒氨基酸的一部分，如硒代半胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)。这一机制替代了含硫的半胱氨酸和蛋氨酸。SeCys和SeMet被认为能够被整合到蛋白质中。

硒是一种重要微量元素，人体需要少量以维持健康。作为人类必需的膳食元素，硒促进人体抗氧化和免疫活动的改善。因此，人体硒缺乏会导致各种健康问题，包括生长迟缓、心血管疾病、癌症和许多其他并发症。世界卫生组织(WHO)建议个人每日硒摄入量在55至200 mg之间。机体可以通过饮食摄入吸收硒。由于硒在缺乏和毒性之间仅有很小的范围，它对人类健康具有潜在的正反两方面影响，因此非常重要。硒的毒性和生物可利用性可能受其化学形态的影响。硒的每种变体在人体代谢过程中都起着不同的作用。硒在自然界中以无机和有机形式存在，具有四种不同的氧化状态。无机硒化合物包括亚硒酸盐(SeO₃²⁻)、硒酸盐(SeO₄²⁻)、硒化物(Se²⁻)和元素硒(Se⁰)。此外，硒代蛋氨酸(Se-Met)和硒代半胱氨酸(Se-Cys)参与各种生物活动。含硒氨基酸是蛋白质结构的重要组成部分，可在各种食品中找到。包括甲基硒代半胱氨酸(methyl-SeCys)、Se-Met和SeCys在内的含硒氨基酸比其硫化合物具有更高的抗氧化活性。硫的类似物将Se结合形成含硒氨基酸(SeCys和SeMet)。用含硒氨基酸替代含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)的蛋白质可能产生有害和异常的蛋白质。为保持作物安全，确定生物强化的最佳硒水平至关重要。这将有助于将谷物或可食用部分的硒含量保持在安全范围内，避免潜在毒性。植物利用硫同化途径进行硒代谢，该途径将硫替换为重要的含硫氨基酸，如半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)，以及相关蛋白质。作物是人类硒摄入的主要来源。然而，作物中的硒水平通常不足以满足人类的硒需求。因此，增加植物可食用部分中硒水平的方法，通常称为硒生物强化，为解决硒缺乏问题提供了一种有效途径。据报告，外源硒的使用不仅可以增加作物中的硒含量，还可以抑制作物从土壤中吸收重金属。

在文献中，大蒜已使用阴离子交换色谱(AEC)、尺寸排阻色谱(SEC)、氢化物发生原子荧光光谱法(HG-AFS)、原子吸收光谱法(AAS)、双通道原子荧光光度计(AFS)和气相色谱质谱联用(GC-MS)进行了定性和定量分析。通常选择IP-RP-HPLC，因为该系统在确定植物样品中硒的形态方面非常有效。

在发展中国家(包括土耳其)的人群中，硒缺乏的程度尚不确定，对食用作物可食用部分的硒水平进行的研究有限。为了在增加硒含量的同时减少大蒜可食用部分中重金属的积累，使用了水培栽培，包括发芽阶段。本研究的主要目标是对不同浓度亚硒酸盐水培种植的大蒜进行深入的富集研究。本研究的目标是了解大蒜如何吸收亚硒酸盐以及在大蒜体内产生哪些类型的硒。

材料和方法

仪器

所有样品中总硒的测定均通过电感耦合等离子体串联质谱仪(ICP-MS/MS)型号8800 ICP-QQQ(Agilent Technologies, Japan)进行，并与配备自动进样器和二元泵的Agilent 1100系列HPLC系统联用，用于测量样品中的硒形态。

通过为同位素⁷⁶Se、⁷⁸Se和⁸⁰Se实施使用O₂的质量转移技术，消除了完全消化样品中基质引起的光谱干扰，而在形态分析中仅使用H₂作为碰撞气体以减少由于等离子体导致的分子干扰。硒形态和总分析的所有操作参数均根据我们研究小组先前进行的研究应用。

大蒜样品的消化使用Mars 5微波消化单元(CEM Corporation, USA)在温度和压力控制程序中进行。

Agilent 1100系列HPLC系统用于分析物的分离。色谱柱出口通过PEEK管直接连接到ICP-MS/MS雾化器。用于形态分析，使用了Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱(250 × 4.60 mm, 4 µ)。

试剂

除非另有说明，本研究中使用的所有试剂均为分析纯。使用Elga Veolia的PURELAB Flex系统生产超纯去离子水，用于流动相以及所有样品和标准制备。

在大蒜样品的酶消化中，使用了蛋白酶XIV(来自Streptomyces griseus)和蛋白酶K(来自Tritirachium album)，两者均来自Sigma-Aldrich, Germany。Tris-羟甲基甲烷(min. 99%, ITW Reagents)用作缓冲溶液(pH 7.5)，并在酶消化过程中使用。

反相离子对色谱(RP-IP-HPLC)用于硒的形态分析，含有3.0%(v/v)甲醇的流动相使用七氟丁酸(HFBA)制备，该酸从Alfa Aesar购得，纯度为99%。为获得1000 mg/kg Se的硒酸盐和亚硒酸盐，以及100 mg/kg Se的其他有机硒物种，将适量的硒酸钠(Na₂SeO₄)(无水99.8+%，Alfa Aesar)、亚硒酸钠(Na₂SeO₃)(Alfa Aesar, 99% min)、硒代-DL-半胱氨酸Se(Cys)₂(Sigma, USA)、硒代甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)(95%, Sigma, USA)和硒代蛋氨酸(SeMet)(Sigma, USA)溶解在去离子水中。用于形态分析，储备溶液保存在+4.0°C，工作溶液通过储备溶液的系列稀释每日制备。

在总硒测定中，使用Milestone SubPUR系统从Emsure级硝酸(Merck, 65%)和H₂O₂(Merck, 35%, w/w)生产的亚沸HNO₃用于样品消化和进一步样品制备步骤。NIST编码为SRM 3149的标准参考物质用于绘制总硒测定的校准曲线。

富硒大蒜的栽培

本研究中使用的大蒜样品源自土耳其卡斯塔莫努(Kastamonu/Türkiye)。蒜瓣在+4.0°C的冰箱中保存两周。硒富集研究是通过使用大蒜鳞茎进行的。大蒜样品用去离子水冲洗并在环境温度下完全干燥。然后，称重大蒜样品并在自来水(一种无土介质)中发芽4天。发芽期结束后，样品被转移到通过向自来水中添加0.50 g植物营养素并加入适量亚硒化钠制备的富硒营养液中。大蒜样品在含有50 μM、100 μM和150 μM亚硒酸钠(Se(IV))的三种不同富硒培养基中，在14 g自来水中栽培(表1)。此外，还准备了未添加硒溶液的对照样品，以评估硒对大蒜生长的影响。样品在常规日光和室温条件下在水培介质中生长10天。

大蒜植物的生长在栽培期间每天被仔细观察。植物颜色、大小或一般状况的变化每天被视觉记录。植物的高度也每天测量并记录。根部还被检查是否有黄化或异常发育的迹象。在生长期，每两天检查一次营养溶液，并通过自来水增加到14 g，以维持大蒜植物的理想生长条件。图1显示了大蒜栽培实验设置的可视化。在第10天结束时，在黄化/成熟开始之前终止了水培环境。从收获的植物中分离出根和叶。分别称重大蒜的根和叶；使用尺子测量叶片长度，并将营养介质用水稀释至50 g。使用塑料刀将大蒜的根和叶切成小块，以增加样品的表面积，实现更有效的冻干。冻干后，大蒜样品储存在−80°C。

总硒的定量

总硒在冻干大蒜的根和叶以及它们的酶消化溶液中测定。此外，生长结束后的营养溶液也分析了剩余的总硒。应用了我们在先前关于韭菜样品的研究中开发和验证的消化程序，用于上述样品的矿化，因为基质与先前的相当相似。该程序包括在5.0分钟内将温度升至135°C，然后在5.0分钟内进一步升至180°C，保持20分钟，然后冷却至环境温度。为了消化样品，称取约10 mg冻干的大蒜根和叶并转移到容器中。然后，向容器中加入3.0 mL亚沸HNO₃溶液(65% v/v)、1.0 mL 30%(w/w) H₂O₂和1.0 mL H₂O。消化后的样品用超纯去离子水稀释至10 g。

营养溶液也被消化以评估剩余的硒水平。容器中含有约0.15 mL的营养溶液样品，全部来自对照和硒水培培养基。通过加入2.0 mL亚沸HNO₃、1.0 mL 30% H₂O₂和2.0 mL H₂O进行。消化后的样品用超纯去离子水稀释至10 g。

对于酶提取的大蒜根和叶溶液的分析，称取2.0 mL溶液到容器中，加入2.0 mL亚沸HNO₃溶液(65% v/v)和1.0 mL 30% H₂O₂。消化后的样品用超纯去离子水稀释至10 g。

应用基质匹配的外部校准方法测定所有消化样品中的总硒量，整个样品和标准制备步骤均按重量进行。

酶辅助提取程序

酶水解过程用于从蛋白质中释放硒代氨基酸。Ari等人描述的酶提取方案应用于硒富集大蒜的冻干根和叶。将10 mg大蒜样品与5.0 mL提取溶液混合，该溶液由5.0 mg蛋白酶XIV和蛋白酶K在30 mM Tris-HCl与1.0 mM CaCl₂(pH: 7.5)中制备。添加蛋白酶以水解肽键。溶液在50°C下摇动18小时后离心并通过0.45 μm过滤器过滤。分析在150 μM亚硒酸钠(Se(IV))强化培养基中栽培的大蒜样品的根和叶，以证明所提方法的代表性提取效率。通过比较酶提取溶液和固体样品中的总硒含量来评估提取产率。这些提取溶液的矿化按照"总硒定量"部分描述的程序进行。然后使用ICP-MS/MS在优化调谐参数下，采用基质匹配的外部校准技术量化溶液中的总硒。

硒形态分析

HPLC-ICP-MS/MS用于对酶提取的大蒜根和叶样品进行形态分析(无机和有机Se)。所有标准品和大蒜样品均按重量制备，使用外部校准方法进行测量。

用于形态分析，使用Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 × 4.60 mm, 4µ)色谱柱。使用0.10%(v/v) HFBA、3.0%(v/v) MeOH和pH 6.0混合物作为流动相，流速为1.0 mL/min，进样量为20 µL。最佳仪器和色谱条件按照Ari等人的应用，酶提取样品直接分析，无需进一步稀释。

通过外部校准方法实现了大蒜中Se(Cys)₂、SeMet和MeSeCys的定量。分别为大蒜的根和叶单独创建了硒代氨基酸的校准曲线。两种样品的校准图均针对浓度范围为0.49-100.9 ng/g的硒代氨基酸制备。对于叶样品，校准曲线的回归系数记录为Se(Cys)₂、MeSeCys和SeMet分别为0.9997、0.9998、0.9979。同样，根样品的校准曲线回归系数计算为Se(Cys)₂、MeSeCys和SeMet分别为0.9995、1.0000、0.9990(表1)。

系统分析性能方面，检测限(LOD)和定量限(LOQ)值使用0.50 ng/g标准溶液在3.0% MeOH中测试了亚硒酸钠(Se(IV))、Se(VI)、Se(Cys)₂和SeMet，而MeSeCys则使用5.0 ng/g标准溶液在3.0% MeOH中评估。在计算LOD和LOQ时使用了以下公式：

\begin{gathered}

\text{LOQ} = 10\text{sd} + \text{C}_{\text{std}} \

\text{LOD} = 3\text{sd} + \text{C}_{\text{std}}

\end{gathered}

所有硒物种在所用仪器条件下的计算LOD和LOQ值见表2。

结果和讨论

大蒜的水培栽培

已知水培前塔什科普吕(Taşköprü)大蒜的平均重量；因此，评估了根和叶以了解硒强化对大蒜样品生长的影响。不同部分大蒜样品的平均重量见表3。结果表明，与对照植物相比，无机亚硒化物补充显著增加了大蒜根和叶的生长。

当仅评估根的质量增加时，观察到在补充了50 μM和100 μM亚硒酸钠(Se(IV))的培养基中生长的植物的干质量甚至高于其初始湿重，而对照组保持干质量，被认为仅相当于水分损失。然而，在100 μM亚硒化物强化培养基中栽培的根表现出与对照组相似的行为。因此得出结论，150 μM亚硒酸钠(Se(IV))浓度可能是大蒜植物的毒性水平，导致生长减少。

高硒水平会抑制光合作用和营养运输。研究表明，当营养溶液中存在高硒水平时，植物矿物质平衡的变化，特别是大量磷的积累，可能导致其生长问题和生物量减少。

大蒜样品可食用部分中硒吸收率和硒转运的调查

水培栽培的一个优势是能够计算植物对强化分析物的吸收率。在本研究中，理论上50 μM、100 μM和150 μM亚硒酸钠(Se(IV))营养溶液中的总硒量分别计算为3.9 mg/kg、8.0 mg/kg和11.9 mg/kg。植物生长过程完成后，通过ICP-MS/MS测量了每个营养溶液中剩余的总硒量，分别报告为0.85 ± 0.26、2.5 ± 0.8和2.6 ± 0.4 mg/kg。因此，相对平均吸收量分别发现为78%、69%和78%。这些数据支持大蒜样品在生长期有效地从溶液中吸收硒。如"大蒜水培栽培"部分所述，样品质量增加的评估表明，单独的硒应用显著改善了大蒜的生长参数，这与先前的报告一致。据认为，硒对植物生长的影响源于其解毒重金属的能力，从而对生长产生积极贡献。

为了调查硒的典型定位，通过ICP-MS/MS分别测定了在150 μM硒富集生长培养基中栽培的大蒜样品的根和叶中的总硒量。冻干大蒜样品根和叶的总硒含量分别发现为43.8 ± 33.2和62.7 ± 16.4 mg/kg (n = 4)。根据获得的数据，考虑到平均值上的标准偏差，大蒜样品根和叶之间硒积累能力的差异似乎显著。因此，可以得出结论，在给定的栽培时间期间，Se(IV)转化为有机硒形式需要时间，并且更可能在叶片中积累，而不是在根部。这些发现与文献报道一致，即大多数植物的茎和叶中的硒水平通常高于根部。

提取效率率的调查

如"总硒定量"部分所述，通过ICP-MS/MS测定提取物中的总硒量，并在最高亚硒酸钠(Se(IV))强化样品(即150 μM)中测试了所应用方法在根和叶中的提取效率。

酶提取的叶和根中的总硒量分别为10.3 ± 2.0和10.6 ± 5.9 mg/kg (n = 4)。测量的根和叶的平均提取效率分别计算为(33 ± 22)%和(17 ± 3)% (n = 4)。这些低提取效率值表明，大蒜每个部分中约70-80%的总硒无法提取。在我们先前的研究中，所提出的提取方案对韭菜样品(n = 53)的叶和茎的提取效率率记录为(70 ± 20)%和(67 ± 19)%。另一方面，应用于葱属植物的不同酶提取程序的效率也报告为显著高于本研究中观察到的值。因此，作者怀疑大蒜样品的粒径不够小，如我们先前的研究，因此与先前报道的研究相比，提取效率相对较低。

硒形态分析

据报道，SeMet通过转硫途径分解为游离SeCys并进入代谢反应。富含硒的食物来源，特别是有机硒如硒代蛋氨酸(SeMet)，可以增强人体对硒的吸收和利用。植物可以以无机或有机分子的形式含有硒，这些分子可以成为高分子量化合物，如蛋白质。研究表明，高等植物具有硒途径。被根吸收后，硒在植物内代谢，形成有机硒化合物。这些化合物可以储存在植物内或通过挥发释放到空气中。在葱属植物(包括大蒜)中，"蒜氨酸"是活性化合物和风味的主要来源。许多硒化物，可能是硒化合物(Se化合物)的可能分解产物，类似于"蒜氨酸"(Se-"蒜氨酸")，也已在富硒大蒜中发现。

尽管基于吸收率的实验结果表明大蒜可以收集大量硒，但需要进一步研究大蒜样品中硒转运的机制，以确定可食用部分中的硒含量。对照大蒜样品的营养溶液含有低于ICP-MS检测限的硒。因此，虽然对硒富集样品的测量结果进行了一致分析，但未对预期硒浓度显著低于硒富集样品的对照样品进行形态分析。对于植物中有机硒物种的形态，反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC)与ICP-MS结合使用多种离子对试剂。在本研究中，使用HFBA作为离子对试剂，通过IP-RP-HPLC-ICP-MS/MS系统确定了大蒜样品不同部分中硒物种的存在，HFBA能够分离比三氟乙酸(TFA)、五氟丙酸(PFPA)和三乙基铵乙酸(TEAA)更多的有机硒物种。在这种分离方法中，无机硒物种不如有机硒物种分离得有效，如图2所示。然而，它有助于提取样品中无机硒物种的定性测定。由于在IP-RP-HPLC系统中未检测到属于亚硒酸盐或硒酸盐的任何显著峰，因此本研究中未应用进一步的色谱分离，如强阴离子交换HPLC系统。

通过硫酸盐转运蛋白，植物根部吸收硒并随后将其转运到叶的木质部，在叶绿体中进行硫同化以产生SeMet、SeCys和其他有机硒。亚硒酸在根中迅速转化为有机硒化合物，而硒酸则被运送到木质部并转移到茎中，其中它被整合到有机硒化合物中并类似硫一样在整个植物中运输。这种色谱分离方法仅在大蒜样品的根和叶中鉴定出Se(Cys)₂、SeMet、MeSeCys和未知物种(图2)。在大蒜样品中检测到的所有物种，包括未知物种，都与文献综述一致。生大蒜被观察到含有不同的硒物种，包括MeSeCys、Se(VI)、SeMet和未知物种。大蒜(Allium sativum)、洋葱(Allium cepa)、韭菜(Allium ampeloprasum)和西兰花(Brassica oleracea)都含有高量的硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)，约占总硒的一半。我们的研究还表明，大蒜中存在的最主要物种是MeSeCys和SeMet。此外，应明确指出，在所有样品中，大蒜样品叶和根中记录的未知峰的峰面积与SeMeCys和SeMet一样可检测。如表4所示，不同亚硒酸钠Se(IV)处理下大蒜样品叶和根中硒物种(SeMet和MeSeCys)的百分比分布显示出对硒暴露的组织特异性代谢反应。

在叶中，SeMet在较低亚硒酸钠Se(IV)浓度(50-100 µM)下占主导地位，约占测量的总硒物种的60-62%。然而，在150 µM亚硒酸钠Se(IV)下，比例明显转向有利于MeSeCys(57.3%)，表明在较高硒水平下向MeSeCys生物合成的代谢转变。这种转变可能反映了一种适应性解毒机制，因为MeSeCys被认为是一种毒性较低、非蛋白原性的硒形式，可以比SeMet更安全地储存或排泄。

在根中，SeMet和MeSeCys的比例在所有亚硒酸钠Se(IV)浓度下保持更平衡，在100和150 µM下比例接近1:1。这表明根表现出相对稳定的硒形态分布，可能是由于在硒代谢中相对于叶扮演更被动的角色，或是在转运到地上部分之前的早期阶段处理Se。总体而言，数据表明硒形态是剂量和组织依赖性的。虽然SeMet在较低浓度下占主导地位，但较高的硒暴露会诱导向MeSeCys的转变，特别是在叶中，可能是为了减轻硒毒性的保护性反应。SeMet是谷物、草原豆类和大豆中主要的硒化合物。另一方面，MeSeCys是富硒十字花科植物(包括大蒜、洋葱、芽苗、西兰花和野生韭菜)中主要的硒化合物。MeSeCys在文献中已被报道为具有显著抗癌潜力的硒化合物，这也是本研究中在大蒜样品中检测到的最主要的有机硒物种之一。

文献表明，植物积累亚硒酸盐并通过代谢途径将其转化为有机硒物种。在本研究中，使用该途径研究了大蒜样品中硒的积累和转化。虽然吸收的硒被转化为有机硒物种，但并非所有物种都进行了定性和定量测定。尽管现有的分离方法在文献中常用，但仍需进行进一步研究以确定对硒信号有显著贡献的观察到的未知物种。在文献中，大蒜中的未知峰通过精确质量测定进行鉴定，进一步确认了结构表征的硒物种的身份。

结论

环境和遗传因素可以影响植物的生长。本研究调查了影响植物代谢的硒富集以及硒补充对大蒜生长、吸收、运输、提取效率和分化的影响。水培大蒜可以有效吸收亚硒酸盐，但当浓度超过100 μM时，其生长可能会受到抑制。本研究还发现，大蒜植物有效地吸收了硒，在50 μM和100 μM亚硒酸钠(Se(IV))下的吸收率分别为78%和69%。硒更可能在大蒜叶中积累，表明无机硒向有机形式的转化具有时间依赖性，与早期研究一致。硒形态分析证实，MeSeCys和SeMet是大蒜中存在的主要有机硒化合物，在根和叶中的浓度不同。这些结果表明，硒积累和转化为有机硒化合物受到植物生长阶段、特定器官和硒浓度等因素的影响。此外，研究检测到未知的硒物种，如色谱分析中显著峰所示，表明需要进一步研究以识别和表征这些未确定的化合物。本研究中使用的酶提取方法相对效率低下，可能影响形态分析的代表性。形态分析确定MeSeCys和SeMet为主要的有机硒形式，还存在显著的未知硒物种，值得进一步研究。未来研究应采用ESI-MS/MS或LC-HRMS等先进技术来阐明未知色谱峰的身份。