肠道微生物群衍生的多胺代谢通路与平均血压相关性研究Gut microbiota–derived polyamine pathways associated with mean blood pressure | Hypertension Research

肠道微生物群衍生的多胺代谢通路与平均血压相关性研究

摘要

高血压是一种常见的生活方式相关疾病，受多种因素影响，包括过量盐摄入。最近，肠道微生物群(GM)因其在血压调节中的潜在作用而受到关注；然而，多胺代谢的作用仍不明确。本研究选取了60名来自日本志贺町的40岁以上参与者，根据平均血压和尿氯化钠(u-NaCl)排泄量将其分为四组(n = 15)。评估了临床参数，并通过鸟枪法宏基因组测序分析粪便样本，评估微生物组成和与精氨酸-多胺代谢相关基因的丰度。观察到三个主要发现：(1)盐敏感型和非盐敏感型高血压组之间GM的α多样性存在显著差异；(2)具有已知降压作用的多胺代谢关键酶亚精胺合成酶(EC 2.5.1.16)的丰度在正常血压个体中显著较高，且与u-NaCl排泄无关；(3)携带包括EC 2.5.1.16在内的多胺代谢酶基因的细菌种类在各组间存在显著差异，表明组间微生物代谢特征特异性。这些发现表明，GM介导的多胺代谢可能有助于调节盐敏感性血压。尽管观察到亚精胺产生细菌的变异和EC 2.5.1.16的参与，但这些因素本身并不能完全解释与盐摄入相关的组间差异。因此，多胺代谢可能在盐敏感性中发挥作用，但其他微生物和宿主因素也参与其中。需要进一步研究来验证这些发现，并探索针对微生物群的高血压预防和治疗策略。

引言

高血压(HT)是心血管疾病的主要危险因素。世界卫生组织报告称，约30%的成年人患有HT，这是心肌梗死、中风和肾衰竭等多种严重健康问题的原因。早期发现和适当管理HT可以显著降低并发症风险。因此，了解HT的病理生理学并开发预防和治疗策略对公共卫生至关重要。

HT是由遗传和环境因素共同引起的，包括过量盐摄入。研究表明，过量钠摄入会增加血压(BP)和心血管疾病风险。然而，并非所有参与者对盐摄入的BP反应都相同。换句话说，盐敏感性对个体BP的影响各不相同。研究已关注一氧化氮(NO)等血管扩张剂和多胺代谢作为盐敏感性的因素和机制。

多胺是分子结构中含有两个或更多氨基的烃类化合物。典型的多胺包括腐胺、亚精胺和精胺。亚精胺是最受研究的多胺之一，是一种BP抑制剂。亚精胺增加精氨酸的生物利用度，被认为通过增强NO产生而发挥降压作用。亚精胺还与抑制HT动物模型中的炎症诱导细胞因子、抑制血管内皮细胞的氧化损伤以及改善肾功能障碍有关。亚精胺在宿主细胞中合成或从饮食中摄取，但也由肠道微生物群产生并被人体吸收。近年来，已有数份报告支持GM在BP调节中的作用；然而，尚无研究报告肠道微生物群衍生的多胺代谢对BP的影响。

在本研究中，我们调查了肠道微生物多胺代谢是否与BP调节相关，以及饮食盐摄入如何影响携带多胺代谢相关基因的细菌丰度。本研究旨在阐明肠道微生物群衍生的多胺代谢在BP调节中的潜在作用，并为未来的预防和治疗策略提供见解。

方法

研究设计

这项观察性研究使用了2017年在日本石川县羽咋郡志贺町进行的"志贺町超级预防性健康检查"中40岁及以上居民的数据。健康检查期间收集的血清、尿液和粪便样本用于分析GM及相关代谢物。

伦理考虑

本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得金泽大学医学研究生院伦理委员会批准(批准号：1491)。在详细解释研究目的和程序后，从所有参与者处获得书面知情同意。

数据收集

使用问卷收集了与年龄、性别、病史、用药状况和吸烟状况等参数相关的志贺町超级预防性健康检查数据。身体质量指数(BMI)通过将当前体重(kg)除以身高(m²)的平方计算得出。在测量血压(BP)前，参与者在检查室的椅子上休息超过5分钟，并取两个稳定值的平均值作为临床BP值。BP在坐位时测量，将适当尺寸的袖带放在右上臂。使用的血压计为UM-15P(日本福冈Parama-tech有限公司)和HEM-907(日本京都欧姆龙有限公司)，这些是基于示波法的数字自动血压计。血清样本在禁食12小时并休息15分钟后早晨收集。根据需要收集尿液样本。收集后立即将血清和尿液样本冷藏。使用健康检查当天与采血同日禁食条件下收集的单次晨尿样本来评估尿钠排泄。未进行24小时尿液收集。使用总NO和硝酸盐/亚硝酸盐检测试剂盒(R&D Systems, Inc., MN, USA)测量尿液中NO代谢物浓度(NO/gCr)。该试剂盒测量尿液中硝酸盐和亚硝酸盐的吸光度，总值被视为尿NO浓度。使用尿肌酐水平调整数值以获得NO/gCr。

参与者选择

从接受健康检查的460人中，对254名自愿提交粪便样本的参与者的数据进行了分析。排除标准如下：(1)服用降压药物、类固醇、肠道调节剂、抗菌剂或质子泵抑制剂的个体；(2)接受癌症治疗的患者；(3)数据缺失的个体。排除了89名患者。

图1显示了165名参与者的平均BP(mmHg)和尿氯化钠(u-NaCl)排泄(g/天)的散点图。参与者使用散点图回归线和中位u-NaCl排泄量(9.7 g/天)分为四类。位于回归线和中位线±0.25标准差范围内的参与者被排除，以减轻潜在异常值的影响。随后，使用k-means方法确定每个聚类的质心。从四个划定的聚类中，选择与各自质心欧几里得距离最短的15个样本进行后续分析。参与者被分为四组：低盐/正常BP(LSNOR)、低盐/高BP(LSHT)、高盐/正常BP(HSNOR)和高盐/高BP(HSHT)。

粪便微生物群鸟枪法宏基因组分析

粪便样本的收集和存储如前所述。粪便样本在生物安全二级实验室中处理。使用NucleoSpin® DNA Stool(Macherey-Nagel Inc., Düren, Germany)从粪便样本中提取总DNA。GeneBay, Inc.对粪便样本进行了鸟枪法宏基因组分析。使用Covaris ME220(Covaris Inc., Woburn, MA, USA)对DNA进行片段化，纯化，并使用AMPure XP磁珠(Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)进行尺寸筛选。使用MGIEasy PCR-Free DNA Library Prep Set(MGI Tech Co., Ltd., Shenzhen, China)处理样本，并准备带索引条码的文库。使用下一代测序仪DNBSEQ-G400(MGI Tech Co., Ltd.)对最终文库进行测序(2 × 150 bp)，以获得原始读取数据(FASTQ格式)。

序列数据管理

通过鸟枪法宏基因组测序获得的原始读取数据使用FASTP(版本0.20.1)进行质量检查。使用Trimomatic软件(版本0.33)去除低质量读取。使用两步法去除人源基因组序列。首先，使用Bowtie2(版本1.1.2)将所有读取与人类参考基因组(hg37dec_v0.1)比对，以识别和去除人源序列。使用KneadData(版本0.10.0;哈佛大学Huttenhower实验室)从数据集中清除剩余的人源读取。未被去除的序列保留用于微生物组分析。

微生物组分析

使用宏基因组系统发育分析工具v.3.0(MetaPhlAn3)的默认设置进行细菌菌群组成分析，并计算细菌种类的相对丰度比。使用mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901数据库映射细菌种类。

使用人类微生物组计划统一代谢分析网络(HUMAnN3, 版本3.0.10)的标准设置进行细菌菌群的功能分析，并计算细菌来源的酶基因和代谢通路的丰度。在此过程的第一步中，使用Bowtie2(版本1.1.2)将MetaPhlAn3识别的细菌基因组映射到泛基因组数据库chocophlan.v296_201901b。使用DIAMOND(版本2.0.9)将无法映射到ChocoPhlAn的读取(代表未知细菌来源的序列)随后与UniRef90蛋白数据库(uniref90_annotated_v201901b)比对。最后，使用MetaCyc数据库(mapping_v201901b)将酶基因丰度映射到代谢通路。

与多胺代谢相关的酶基因

通过查询MetaCyc数据库，识别与多胺代谢相关的酶基因，以提取我们数据集下游筛选的候选基因。目标代谢通路如补充图S1所示。我们检查了将精氨酸通过腐胺和亚精胺转化为亚精胺的通路，以及转化为鸟氨酸和瓜氨酸的通路。在本研究中，仅包含在现有参考数据库(ChocoPhlAn, UniRef90和MetaCyc)中可功能注释的基因，未注释或未知基因被排除。因此，结果代表了这些数据库中当前注册的已知精氨酸和多胺相关酶基因。

统计分析

所有统计分析均使用R-studio软件(版本4.3.1; Boston, MA, United States)进行。在低u-NaCl排泄的两组(LSNOR与LSHT)、高u-NaCl排泄的两组(HSNOR与HSHT)、正常BP的两组(LSNOR与HSNOR)以及高BP的两组(LSHT与HSHT)之间进行组间比较。使用Welch's t检验对临床信息、α多样性、细菌种类和代谢酶基因进行显著性检验。使用R的"vegan"包对α多样性使用Simpson指数，对β多样性使用Bray-Curtis距离进行主成分分析(PCA)。使用PERMANOVA对β多样性进行显著性检验。使用协方差分析比较代谢物比例。根据先前研究，我们选择年龄、性别和BMI作为可能影响GM的混杂因素。对于所有显著性差异检验结果，在p < 0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

临床背景

表1显示了接受鸟枪法测序的60名患者的临床特征。LSNOR组与LSHT组之间以及HSNOR组与HSHT组之间的收缩压和舒张压值均存在显著差异(所有p < 0.01)。此外，LSNOR组的舒张压显著低于HSNOR组(p < 0.01)。当应用标准高血压标准(收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg)时，9名参与者在基于mBP的分类与传统高血压定义之间存在差异。尿NaCl排泄在LSNOR组与HSNOR组之间以及LSHT组与HSHT组之间存在显著差异(均为p < 0.01)。其他临床参数、病史或NO/gCr水平未观察到显著差异。

细菌种类多样性

图2A显示了一个堆叠图，展示了前20种细菌种类的平均相对丰度比。在根据平均BP和盐排泄分类的四组中评估了肠道微生物群的多样性。与LSNOR组相比，LSHT组中脆弱拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和类杆菌属(Bacteroides stercoris)显著更丰富(p = 0.010和0.006)，而拟杆菌属(Alistipes putredinis)在LSNOR组中更丰富(p = 0.029)。与HSNOR组相比，HSHT组中B. stercoris显著更丰富(p = 0.026)。与LSNOR组相比，HSNOR组中B. vulgatus和B. stercoris显著更丰富(p = 0.007和0.026)。与HSHT组相比，LSHT组中产糖副拟杆菌(Fusicatenibacter saccharivorans)和E. sp. CAG.180显著更丰富(p = 0.025和0.046)，而HSHT组中A. putredinis更丰富(p = 0.004)。与HSNOR组和LSHT组相比，HSHT组的α多样性显著更高(p = 0.041和0.043；图2B)，而β多样性未发现显著差异(图2C)。

精氨酸和多胺相关酶基因丰度比较

补充图S1A显示了在分析的粪便样本中鉴定出的精氨酸代谢相关酶基因的代谢通路图。补充图S1B显示了在分析的60名参与者中携带每种酶基因的细菌种类比例。值得注意的是，EC 2.1.3.3和EC 4.1.1.19分别在60.2%和59.5%的患者分离细菌中检测到。相比之下，携带EC 3.5.1.53和EC 4.1.1.17的细菌种类的流行率低于10%。

图3显示了四组中精氨酸和多胺代谢相关酶的基因丰度。LSNOR组的EC 3.5.3.11、EC 2.5.1.16和EC 2.1.3.3值显著高于LSHT组(p = 0.048、0.040和0.033)，而LSNOR组的EC 3.5.3.1值显著低于LSHT组(p = 0.034)。HSNOR组的EC 3.5.3.12和EC 2.5.1.16值显著高于HSHT组(p = 0.028和0.036)。HSNOR组的EC 3.5.3.12值显著高于LSNOR组(p = 0.020)。如补充图S2所示，EC 4.1.1.17和EC 3.5.1.53的基因丰度低于总量的10%。

与精氨酸-多胺代谢相关的酶基因丰度和微生物多样性

补充图S2,A-H展示了酶基因丰度的种水平分析。在LSNOR与LSHT组以及HSNOR与HSHT组比较中，几种细菌(特别是脆弱拟杆菌、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)和双环罗斯伯里氏菌(Roseburia bicirculans))的精氨酸和多胺代谢相关酶基因(如EC 3.5.3.1、EC 4.1.1.19和EC 3.5.3.12；p < 0.05)丰度存在显著差异，如补充图S2所示。

补充图S2,A–H (ii, iii)展示了基于携带精氨酸-多胺代谢通路中酶基因的细菌种类的PCA。关于α多样性，LSNOR组与LSHT组在EC 3.5.3.12方面存在显著差异(p = 0.034)，LSNOR组与HSNOR组在EC 2.5.1.16方面存在显著差异(p = 0.020)。在β多样性方面，EC 3.5.3.12在四组间存在显著差异(p = 0.027)。

讨论

参与者根据其平均BP和u-NaCl排泄水平分为四组。我们分析了GM的组成和与精氨酸-多胺代谢相关的基因。获得了以下三个主要发现：首先，LSHT组与HSHT组之间以及HSNOR组与HSHT组之间的GM α多样性存在显著差异。其次，编码具有降压特性的亚精胺合成酶的EC 2.5.1.16的丰度在正常血压组中显著高于高血压组，与u-NaCl排泄无关。第三，携带多胺代谢酶基因(包括EC 2.5.1.16)的细菌种类存在显著的组间差异，表明各组间微生物代谢的功能差异。

与先前报告显示高血压和盐敏感性高血压中α多样性降低相反，我们的研究表明HSHT组的α多样性更高。Palmu等人分析了6,953个群体样本，发现高血压个体的α多样性显著较低。Kang等人比较了受控和不受控原发性2级高血压患者，发现不受控组的α多样性显著较低。盐摄入也被证明会降低α多样性：Cardilli等人证明高盐饮食显著降低了具有完整微生物群的小鼠的α多样性，而Singh等人在1,014名参与者的数字营养队列中报告称，包括钠摄入作为负面因素的健康饮食指数与α多样性强烈相关，无论年龄或性别。虽然这些研究表明高血压和盐摄入会降低微生物多样性，但我们的结果部分不同，可能是由于我们独特的分组标准、种族或年龄分布。然而，两组研究都同意高血压和正常血压个体之间的α多样性存在显著差异。

这种差异可能归因于参与者选择和分类策略的差异。这种分类方法有意捕捉了位于每个血压-盐摄入类别质心附近的参与者，提供了每组内具有平均特征的代表性样本。然而，它可能排除了可能表现出明显盐敏感性或血压反应的异常个体，这可能导致观察到的α多样性模式与早期研究的差异。

众所周知，人类GM可以从精氨酸产生多胺，如腐胺和亚精胺。特别是，精氨酸脱羧途径(精氨酸→腐胺→腐胺)是人类肠道中的主要途径，涉及精氨酸脱羧酶(ADC；EC 4.1.1.19)和腐胺脲水解酶(EC 3.5.3.11)。亚精胺合成酶(EC 2.5.1.16)，通常由细菌speE基因编码，催化将丙胺基从脱羧S-腺苷甲硫氨酸转移到腐胺。在我们的研究中，正常血压组中EC 2.5.1.16基因丰度显著更高，表明肠道微生物合成亚精胺可能有助于BP调节。

多胺正在成为发病机制中的关键调节因子。据报道，它们发挥心脏保护、肾脏和血管保护作用，从而有助于降低BP。Matsumoto等人在44名超重成人(BMI 25-30 kg/m²)中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照平行试验，发现摄入含有动物双歧杆菌乳亚种和精氨酸的酸奶改善了内皮功能，通过内皮外周动脉张力评估。在该组中，粪便和血清多胺浓度显著增加。Sieckmann等人还证明了在包括高血压在内的十一种肾脏损伤小鼠模型中多胺降解酶的表达增加，表明肾功能受损、高血压和多胺水平降低之间存在联系。综合这些发现表明，多胺改善心血管和肾功能，并且部分多胺来自肠道细菌。因此，细菌亚精胺合成酶表达减少可能对HT有因果贡献。

在各种多胺中，亚精胺似乎起着特别关键的作用。除了其血管舒张和抗动脉粥样硬化作用外，亚精胺还抑制促炎细胞因子的产生并改善肠道屏障功能。肠道通透性增加促进了内毒素(如脂多糖)的全身易位，导致慢性炎症和血管或肾损伤，这可能加剧HT。亚精胺通过诱导自噬促进上皮再生和紧密连接形成，增强粘膜屏障并减少全身炎症。在盐敏感HT模型中，高盐摄入破坏肠道屏障并增强Th17介导的粘膜炎症，从而升高BP。产生多胺的细菌的存在可能抵消这些影响并维持肠道稳态。

尽管EC 2.5.1.16表达与BP调节相关，但其变异本身无法解释与盐摄入相关的差异。此外，携带该基因的细菌通常具有其他代谢途径，表明对BP的观察到的影响可能源于复杂的微生物相互作用，而不仅仅是EC 2.5.1.16的功能。

在本研究中，我们证明了根据平均血压和尿盐排泄分类的组之间肠道微生物群中的多胺代谢存在显著差异。然而，众所周知，肠道微生物群可以通过多种因素影响血压，包括短链脂肪酸、氧化三甲胺和免疫调节。未来的研究应侧重于集成比较分析，量化和比较这些因素的相对贡献，以确定哪些通路在血压调节中起最关键作用。

在我们的数据集中，直肠真杆菌和菊粉罗斯伯里氏菌，两者都携带EC 2.5.1.16，在HSNOR组中比在LSNOR组中更丰富，表明它们对正常血压个体的耐盐性有贡献。相反，双环罗斯伯里氏菌和肠道罗斯伯里氏菌在LSHT组中比在HSHT组中更少，可能表明肠道微生物谱与盐敏感性相关。这四个物种共享一个共同的功能特征：它们产生短链脂肪酸(SCFAs)和多胺。直肠真杆菌是人类肠道中的主要丁酸产生革兰氏阳性厌氧菌，而菊粉罗斯伯里氏菌、双环罗斯伯里氏菌和肠道罗斯伯里氏菌属于毛螺菌科，将膳食纤维发酵成SCFAs，包括丁酸和丙酸。研究表明，SCFAs通过激活G蛋白偶联受体、降低血管阻力和调节免疫反应来降低BP。因此，产生SCFA和多胺的细菌丰度的变化可能影响盐敏感HT的发展。

此外，这些物种中的多胺代谢可能有助于种间代谢交叉喂养。双环罗斯伯里氏菌具有EC 4.1.1.19、EC 3.5.3.11和EC 2.5.1.16，使其能够独立地从精氨酸合成亚精胺。然而，在肠道环境中，多胺生物合成途径的每个步骤都受不同细菌物种中不同的酶表达模式调节。精氨酸的可用性和肠道环境(如pH)也有重大影响；例如，在大肠杆菌中，ADC在酸性条件下被诱导，导致腐胺分泌。肠道细菌之间的交叉喂养可能涉及释放腐胺并将其转化为腐胺的单一物种。这些合作网络可能构成"混合生物合成系统"，支持持续的多胺生产并促进宿主生理。

本研究有几个局限性。首先，这是一项相对较小的观察性研究，每组15名参与者。由于受试者是有选择地招募的，并且排除了具有极端血压或钠摄入水平的个体以最小化偏差，因此研究结果的普遍性有限，无法建立因果关系。其次，此局限性涉及所分析的尿液和粪便样本的收集方法。粪便样本仅从能够并愿意提供样本的参与者处获取，尿钠排泄是通过单次晨尿样本而非标准化的24小时收集来估计的。尽管这种方法在健康筛查环境中很实用，但在解释结果时应考虑潜在的测量变异性和选择偏差。然而，本研究中使用的尿NaCl排泄9.7 g/天的截断值与日本最近的全国数据一致。根据《国民健康营养调查》(2017-2024)，过去十年日本成年人的中位盐摄入量一直稳定在约9.7-10.1 g/天。因此，尽管使用晨尿而不是24小时尿收集，但此截断值被认为是本研究中参与者分层的合理标准。第三，人类中的亚精胺还来自内源性生物合成和饮食摄入，除了GM；因此，微生物合成的相对贡献可能有限。需要进行干预研究，如动物模型中的粪便微生物群移植或细菌代谢物给药，以验证我们的发现。

总之，本研究根据BP和盐摄入量的分层对GM组成和多胺代谢相关基因进行了表征。正常血压个体中EC 2.5.1.16丰度增加，与盐摄入无关，以及相关细菌的差异，表明肠道微生物多胺合成在血压调节中的重要作用。

这些发现强调了在理解BP调节时，除了宿主因素外，还应考虑肠道微生物因素的重要性。尽管组成存在变异，但GM仍然是一个持久的生物实体，可能通过代谢和免疫介导的通路影响宿主生理。

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