基于微生物群的血管内移植物植入患者感染风险生物标志物研究：一项初步研究

背景： 医疗相关感染(HAIs)仍然是全球医疗系统面临的关键问题，显著增加了发病率、死亡率和医疗成本。术后及与医疗器械相关的HAIs尤其令人担忧，因其临床后果严重且可能致命。尽管这一领域尚待深入探索，但宿主、植入器械与人体微生物群之间的相互作用日益被认为是HAIs发生的潜在因素。

方法： 在此背景下，本研究旨在通过16S rRNA基因测序，调查血管内移植物(VEGs)植入患者皮肤和口腔微生物群在预测和致病方面的潜在作用。通过比较发生HAIs患者(HAI组)与未发生术后感染并发症患者(NoHAI组)的微生物谱，以识别风险生物标志物、菌群失调的微生物模式以及可能易导致HAIs发生的进化轨迹。

结果： HAI患者的口腔样本显示微生物多样性降低（香农指数，p值=0.597），而与NoHAI患者相比，皮肤样本则显示出显著更高的多样性（p值=0.023）。此外，某些特定分类单元被发现是HAIs易感性的潜在指标，包括厚壁菌门D（p值<0.001）、葡萄球菌属（p值=0.011）和流感嗜血杆菌D（p值=0.036），以及齿龈卟啉单胞菌（p值=0.01）和变形链球菌（p值=0.005）。

结论： 这些结果为可能使患者易发生感染的微生物学动态提供了初步见解。尽管需要在更大规模和更多样化的手术人群中进行进一步验证，但这些微生物特征可能成为未来手术患者术前风险分层和个性化预防策略的有前景的靶点。

1 引言

传染病，定义为由病原体或其毒性产物引起的疾病，已经深刻影响了人类，塑造了社会、经济和文化。从14世纪的黑死病到最近的COVID-19大流行，传染病已经导致数百万人死亡并改变了历史进程。医疗相关感染(HAIs)，定义为在医疗过程中获得并在入院后至少48小时或在医疗治疗后30天内显现的感染，仍然是一个主要的公共卫生问题。它们不仅威胁患者的健康和安全，还通过与住院延长和治疗相关的直接成本以及与医疗法律诉讼相关的间接成本，给医疗系统带来重大经济负担。近几十年来，由于人口老龄化和免疫功能低下患者数量增加，HAIs的发病率有所上升。根据欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)协调的HAIs患病率点源调查，在十年内，HAIs的平均患病率从6%上升到7.1%，相当于每年约37,000人死亡。

在各种类型的HAIs中，接受血管内移植物(VEGs)植入的患者发生的感染需要特别关注。VEGs用于治疗如主动脉瘤等血管疾病，与开放手术相比，它们通过降低发病率和死亡率彻底改变了外科手术。然而，尽管具有临床益处，这些患者仍有发生严重感染并发症的风险。

传统上，与VEG相关的感染是指直接涉及人工器械本身的感染。尽管这些事件相对罕见（0.2-5%的病例），但与高达30%的高死亡率相关。然而，除了这些假体感染外，接受VEGs植入的患者也有发生其他HAIs（如尿路、手术部位或肺部感染）的风险，这些感染并非直接与移植物相关，而是在术后期间发生。这些情况下HAIs的发病率尚未明确定义，但任何此类感染都可能成为移植物感染或术后并发症的潜在风险因素。这凸显了需要考虑患者对感染的更广泛易感性的创新预防和管理策略。

在此背景下，本研究聚焦于接受VEGs植入后发生的HAIs，而非植入器械本身的感染。选择这一人群是因为它代表了一个临床同质且定义明确的手术队列，为研究宿主相关因素（如微生物群）对HAIs发生的影响提供了理想的起始模型。尽管这一选择限制了研究结果向更广泛手术人群的推广性，但它通过最小化与手术技术和围手术期管理相关的变异性增强了内部有效性，这对于初步研究是有用的方面。

人体微生物群在维持人类健康方面起着关键作用，有助于抵抗病原体感染的定植。被称为菌群失调的微生物群变化可能会损害这种保护功能，使个体易受感染，包括HAIs。尽管HAIs通常归因于众所周知的机会致病菌，如"ESKAPE细菌"（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）和艰难梭菌，但最近的研究表明，更广泛的微生物群落可能使个体易受感染。

因此，我们重点关注两个关键的微生物生态位——皮肤和口腔，它们代表了人体防御的第一道防线的基本组成部分，也是HAIs相关病原体的潜在储存库或传播界面。口腔微生物群可能与全身感染直接相关，并且由于口腔细菌进入血液，特别是在有血管植入物的患者中，已被牵涉到菌血症和心内膜炎。相反，皮肤微生物群虽然可能通过双向互动受到外部环境的影响，但也包括稳定的共生群落，在维持屏障完整性和预防病原体定植方面起着关键作用。因此，调查这两个解剖部位有助于评估导致感染易感性的微生物因素，提供对影响手术患者HAIs易感性的可能微生物因素更全面的理解。

目前的估计表明，通过在医疗环境中严格遵守标准化的感染预防和控制措施，高达一半的HAIs是可以预防的。因此，有效的预防策略必须超越标准的卫生实践。对宿主微生物群、医疗器械和环境暴露之间相互作用的更深入了解，可能会揭示感染风险的早期生物标志物。这些知识可以为设计针对性的预防策略和个性化的感染控制措施提供信息，从而有效减少HAIs的负担及其相关成本。

在此背景下，本研究旨在探索接受VEG植入的患者口腔和皮肤微生物群的组成及其潜在预测价值，作为将预测性微生物学生物标志物整合到个性化医学方法的更广泛努力的一部分。这种整合可能会显著增强HAIs的预防，改善患者预后，并为更广泛的公共卫生策略提供信息。通过将预防和治疗干预措施定制到个体微生物群谱，医疗系统可以实施更有效、以患者为中心的感染控制方法，最终降低HAIs的发生率并降低相关医疗成本。

2 材料和方法

2.1 伦理考虑

研究方案按照《赫尔辛基宣言》进行，并获得了中东部威尼托地区地方伦理委员会的批准，协议编号为0018838，日期为2024年3月13日。所有参与者在纳入研究前提供了书面知情同意。本研究中收集的所有个人数据均按照通用数据保护条例(GDPR，欧盟条例2016/679)进行处理。数据分析前对数据进行了假名化处理，且仅限授权研究人员访问。参与者被告知数据管理、使用及其权利，包括随时撤回同意的可能性。

2.2 样本收集

样本收集在已接受VEGs植入的患者上进行。患者基于明确定义的标准进行选择，包括年龄在18至90岁之间、能够提供有效知情同意，以及没有明显的免疫系统疾病或肿瘤疾病。在采样前四周内服用抗生素或在VEGs植入前六个月内发生HAIs的患者被排除。

患者招募由"帕多瓦大学医院血管外科复杂业务单位(U.O.C. di Chirurgia Vascolare dell'Azienda Ospedale-Università di Padova, AOUPD)"和"帕多瓦大学医院法医和毒理学单位(U.O.C. di Medicina Legale e Tossicologia, AOUPD)"的法医遗传学实验室合作进行。提供书面知情同意后，招募的患者被纳入研究样本，并分为两组："病例"组（术后发生HAIs的患者）和"对照"组（未发生HAIs的患者）。

鉴于样本量有限和研究的初步性质，特意采用了"非一对一匹配"方法，以保持HAI和NoHAI组的充分代表性，同时维持年龄和性别的平衡。具体而言，共选择了20名患者，年龄范围从64岁到88岁，用于研究和采样。这些患者被分为"病例"组10名和"对照"组10名，每组包括8名男性和2名女性。这种设计确保了在除住院时间（感染的预期结果）外的收集人口统计学或临床变量之间没有其他显著差异的情况下，具有足够的可比性，如下文结果部分所述。

样本收集在每位患者手术后12个月进行，使用非侵入性程序。样本通过在患者优势手的两个手掌和患者的口腔上擦拭无菌拭子收集。从刚刚提到的两个身体部位重复进行第二次类似的采样，时间在一个月后。特意选择这个时间点是为了捕捉相对稳定的微生物群配置，最小化暂时性术后、住院和抗生素相关扰动，以及季节性和日常变异性。先前研究表明，微生物群落在重大扰动后往往会逐渐重新平衡到个体基线。因此，这种方法旨在近似患者微生物群在可能与术前时期相关的配置特征，而不是在围术期或术后时期。

为最小化个体间变异性，所有采样程序均由同一操作员对所有患者执行，确保采样程序的一致性。在采样程序结束时，为每位患者获得四个样本：两个来自优势手掌，两个来自口腔。实验协议概述如图1所示。计算在每个解剖部位收集的两个样本中微生物的平均丰度，以生成每位患者的皮肤和口腔各两个稳定的代表性微生物群谱。这些微生物群谱被认为反映了患者在干预前的基线状态，增强了后续分析的准确性，减少了时间变异性，并增加了每位患者复合微生物谱的稳健性。

基于患者的病史和采样部位，参考微生物群谱被分配到四个组：第1组：HAI_Oral（"病例"组的口腔样本），第2组：NoHAI_Oral（"对照"组的口腔样本），第3组：HAI_Skin（"病例"组的皮肤样本），和第4组：NoHAI_Skin（"对照"组的皮肤样本）。

样本收集在不同日期进行，具体取决于手术期。每次收集后，立即提取微生物DNA并在-20°C下储存，以保持其质量和稳定性。一旦收集完所有样本并提取了微生物DNA，随后对所有样本同时进行后续分析。

患者数据，包括年龄、性别、ASA评分和其他临床和手术信息，被收集并存储在仅限授权研究人员知道密码的计算机数据库中。

2.3 微生物DNA提取和文库制备

使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)从口腔和皮肤样本中提取微生物DNA，遵循Delicati等人描述的相同程序。随后，由外部机构(Personal Genomics SRL, Verona, Italy)进行文库制备、微生物DNA测序和初步生物信息学分析。使用引物组合Pro341F和Pro805R扩增16S rRNA基因的高变区V3-V4，并使用Illumina MiSeq平台考虑300对端进行测序。

2.4 临床和人口统计学统计分析

进行了临床和人口统计学分析，以探索与HAIs相关的潜在混杂变量，考虑"病例"和"对照"组。变量包括患者特征（如ASA评分、合并症和慢性治疗）、手术特征（季节、持续时间、类型、再干预和住院天数）以及器械参数（植入器械的数量和长度）。对这些变量中的每一个使用T检验或Mann-Whitney U检验进行单变量分析（用于连续变量，如住院天数和手术持续时间），对分类变量（如手术季节、ASA评分）使用卡方检验或Fisher精确检验，具体取决于数据分布。当p值小于0.05时，结果被认为具有显著性。

2.5 微生物群的生物信息学和统计分析

在分析了患者的临床和人口统计学特征后，进行了微生物学分析，以调查发生HAI和未发生HAI的患者之间微生物群谱的差异。使用Qiime2（2023.9版）和R studio（4.3.22023.10.31 ucrt版）处理和分析微生物学数据。

使用KronaTools生成Krona图表，表示四个实验组（HAI_Oral、NoHAI_Oral、HAI_Skin和NoHAI_Skin）中不同微生物的平均相对丰度。随后，为了定义患者的参考微生物群（口腔和皮肤部位），有必要比较之前提到的同一部位相隔一个月收集的两个样本。使用堆叠条形图可视化相对门级频率。

由于认为年龄和性别平衡是充分的，因此在将组视为独立的情况下进行统计分析。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，并相应选择参数（T检验）或非参数（Mann-Whitney U检验）分析。分别对每个解剖部位（口腔和皮肤）进行比较，避免将所有组一起比较以限制假阳性风险。这些分析集中在域、门和属水平的差异上。

此外，评估了口腔和皮肤样本之间的门水平差异，以确认它们不同的生物学起源。使用四分位距进行了初步的离群值评估。将具有统计学意义的结果用条形图或热图可视化。p值低于0.05被认为具有显著性。

在物种水平上，进行了更深入的分析，重点关注α多样性和β多样性。特别是，通过使用香农指数和物种丰富度计算的稀释曲线评估了α多样性，在20,000次测序深度下进行。相反，使用基于Aitchison距离的主坐标分析(PCoA)图评估了β多样性，这考虑了微生物组数据的组成性质。最后，进行了指示值(IndVal)分析，以识别在口腔和皮肤部位与HAI或NoHAI组显著相关的特定物种。具有显著IndVal（p值<0.05）的分类群被视为潜在生物标志物。为确保可重复性，在IndVal分析的置换测试中使用了42的随机种子来计算统计显著性。

3 结果

在本研究中，收集并分析了接受VEGs植入的患者的微生物学样本，目的是识别人体微生物群与HAIs发生之间的潜在关联。首先，为了确认基于患者年龄和性别的"非一对一匹配"过程的可靠性，在"病例"和"对照"组中，通过单变量分析评估了组平衡。结果显示，组间年龄和性别无统计学显著差异（p值>0.05），确认了这些变量的充分平衡。随后，进行了单变量分析，以评估其他潜在混杂变量对发展HAIs倾向的影响。除住院天数外，这些变量中没有一个显示显著结果，在"对照"组中中位数为2.5天（四分位距(IQR)为1.75），在"病例"组中为14.5天（IQR = 11）（p值=0.002）。关于组间无显著差异的其他分析变量，结果如下（除非另有说明，否则报告连续变量的平均值±标准差）：(i)两组中大多数患者的ASA评分为3（p值=0.226）；(ii)"对照"组中合并症的平均数量为4.40±1.35，而"病例"组中为4.50±1.96（p值=0.896）；(iii)"对照"组中慢性治疗的平均数量为4.80±1.32，而"病例"组中为4.30±1.49（p值=0.438）；(iv)在"病例"组中，大多数患者在春季接受手术，而在"对照"组中大多数手术在冬季进行（p值=0.093）；(v)手术持续时间在两组中中位值均为3.00小时，但"对照"组的IQR为0.75，"病例"组为3.50（p值=0.424）；(vi)"对照"组中的所有手术都是计划好的，而"病例"组中约40%的患者接受了急诊手术（p值=0.087）；(vii)每组有一名患者需要第二次手术（p值=1.000）；(viii)"对照"组中植入的VEGs平均数量为4.10±2.56，而"病例"组中为3.60±2.01（p值=0.633）；以及(ix)植入的VEGs总长度在组间相当（"对照"组为313.70±137.33 mm，"病例"组为318.80±199.08 mm；p值=0.948）。

所有植入器械均不含抗菌剂，由类似材料制成，并在两组中植入类似的解剖部位。此外，所有患者在手术前后均接受了头孢唑啉抗生素预防。上述变量的相关数据（进行了单变量分析）在补充表1中按每位患者进行了总结。由于组在临床变量、年龄和性别方面具有可比性，后续对HAIs发展的潜在微生物学预测因素的统计分析将组视为独立的。

进一步的描述性分析集中在影响"病例"组患者的HAIs特征上（在补充表2中总结）。HAIs平均在手术后6.6天被检测到，标准差为8.7天。六名患者发展为肺部感染；其中五名患者表现出肺实变的放射学证据，提示肺炎或其他呼吸道疾病，尽管未确定特定病原体。一名患者发展为由真菌白色念珠菌引起的肺部感染。两名患者发展为尿路感染(UTIs)：一名由大肠杆菌引起，另一名未确定特定病原体。一名患者发展为由阴沟肠杆菌引起的手术伤口感染，另一名患者发展为由溶血葡萄球菌引起的血流感染。

随后，进行了微生物学分析，以比较HAI和NoHAI组之间的微生物群谱，揭示了口腔和皮肤水平上的组成和多样性差异。具体而言，使用单个口腔和皮肤样本来为每位患者生成两个参考微生物群谱——每个解剖部位一个——通过平均两个采样时间点的微生物结果。这些谱被分类到四个实验组中：HAI_Oral、NoHAI_Oral、HAI_Skin和NoHAI_Skin。这种分类允许分别调查来自口腔（HAI_Oral与NoHAI_Oral）和来自皮肤（HAI_Skin与NoHAI_Skin）的两组之间的相关性和差异。

生成了Krona图表，表示四个实验组中不同分类水平上微生物的平均相对丰度（补充图1a-d）。随后，跨不同分类水平（域、门、属和物种）进行了进一步分析，以深入理解人类微生物群与HAIs发生的相关性。在域水平上，已识别的绝大多数微生物被归类为细菌（补充图1a-d），与16S rRNA测序一致。如图2所示，口腔样本与皮肤样本相比显示出更高的细菌丰度（p值<0.01）。然而，在口腔水平上，与未在手术后发展HAIs的患者（NoHAI_Oral）相比，发展HAIs的患者（HAI_Oral）的这种丰度结果较低。相反，皮肤微生物群显示出与微生物HAI_Skin相关的微生物物种丰度增加，高于NoHAI_Skin（图2）。值得注意的是，虽然在口腔微生物群中观察到的趋势未达到统计学显著性，但在皮肤微生物群中，HAI组和NoHAI组之间的差异具有统计学显著性（p值=0.007）。

进行了门水平分析，以探索所有样本中微生物门的相对丰度。生成了堆叠条形图，以可视化HAI和NoHAI组在口腔和皮肤水平上这些门的分布（图3）。如图所示，厚壁菌门D在口腔微生物群中显著更丰富，值为52%，而在皮肤微生物群中为28.5%，显示出统计学显著差异（p值=0.00002）。相反，放线菌门在皮肤微生物群（33.5%）中显著更丰富（p值=0.002），而在口腔微生物群（14.5%）中较低。其他门显示出特定于部位的显著差异，包括厚壁菌门C（10.5%口腔vs. 6.5%皮肤；p值=0.001）、梭杆菌门（5%口腔vs. 2%皮肤；p值=0.003）和厚壁菌门A（1.5%口腔vs. 6%皮肤；p值=0.0005）。变形菌门在皮肤上更丰富（8%口腔vs. 13.5%皮肤），尽管这种差异在统计学上不显著。没有其他门显示出统计学显著差异。

随后，通过分别比较口腔和皮肤微生物群的HAI和NoHAI组，进一步开发了门水平分析。显示发现的显著差异的结果如图4所示。在口腔微生物群中，所有具有显著差异的门在NoHAI_Oral组中更丰富。其中，拟杆菌门和螺旋体门显示出中等显著性，p值均约为0.02，而梭杆菌门显示出高度显著差异（p值<0.001）。相反，在皮肤微生物群中，只有异常球菌门在NoHAI_Skin组中显著更高（p值=0.04），而蛭弧菌门E（p值=0.049）、脱硫杆菌门I（p值=0.013）和厚壁菌门D（p值<0.001）在发展HAIs的患者（HAI_Skin）中更丰富。

继续在属水平上进行分析，在HAI和NoHAI患者之间出现了显著差异。结果显示在热图中，以组间中位相对丰度的绝对差异表示，突出显示在发展HAI的患者中更丰富的属（HAI > NoHAI）或在未发展感染的患者中更丰富的属（NoHAI > HAI），如图5所示。在口腔微生物群中，HAI_Oral组中没有属显著更丰富，而NoHAI_Oral组中富集了几个属，包括Leptotrichia（p值=0.01）、Campylobacter A（p值=0.024）、Tannerella（p值=0.04）和Porphyromonas A 859423（p值=0.02）。

相反，在皮肤微生物群中，显示显著差异的大多数属在HAI_Skin组中更丰富。显示出相关差异且因此被认为特别感兴趣的最丰富属包括Haemophilus D（p值=0.036）、Brevundimonas（p值=0.008）、Saccharimonas（p值=0.022）、Staphylococcus（p值=0.011）和Lancefieldella（p值=0.027）。只有少数属在NoHAI_Skin组患者的中更丰富，尽管中位差异很小。

最后的分析集中在物种的最后分类水平上。基于香农指数和物种丰富度的稀释曲线在所有组中围绕2,000次读数达到稳定的平台，表明在此测序深度下达到了足够的物种耗尽水平（图6）。尽管所有曲线达到相似的平台，但香农多样性和物种丰富度值在组间有所不同，表明微生物组成存在差异。特别是，HAI_Skin组显示出最高的香农多样性值，约为6.5，显著高于NoHAI_Skin组（平均≈5.5；p值=0.023，Kruskal-Wallis检验）。相反，HAI_Oral组显示出较低的香农多样性（平均≈4.5） compared to the NoHAI_Oral组（平均≈4.8），但这种差异在统计学上不显著（p值=0.597）。这些发现表明存在潜在的部位特异性菌群失调模式，在发展HAIs的患者中皮肤微生物群多样性增加而口腔微生物群多样性降低（图6a）。

物种丰富度的组顺序基本相同，但观察到平台达到得更渐进，表明组间物种组成或密度不同。特别是，皮肤组（HAI和NoHAI）显示出比口腔组更高的物种丰度，反映了这两个解剖部位不同的微生物生态（图6b）。

通过Aitchison距离评估的β多样性并通过PCoA图表示（图7）显示，沿轴1，口腔和皮肤样本之间存在明显分离，解释了总变异的11.98%。值得注意的是，HAI_Oral和HAI_Skin组在轴2（解释约6.10%的总变异）和轴3（占约4.84%）上均显示出更大的离散度，特别是在HAI_Skin样本中。

最后，IndVal分析允许识别口腔和皮肤样本中与HAI和NoHAI组显著相关的潜在细菌物种。每个组中识别出的物种反映了微生物组成的显著差异，并可能提供关于发展HAIs易感性的线索。在分析的2,000多个物种中，有14个物种被突出显示为表征实验组的重要物种（图8）。特别是，在口腔样本中，Veillonella A. dispar是唯一与HAI_Oral组显著相关的物种，IndVal值约为0.72（p值=0.035），六个物种在NoHAI_Oral组中显著更丰富，IndVal值范围从0.74到0.88：Prevotella sp902776665（IndVal = 0.74，p值=0.025）、Eubacterium M brachy（IndVal = 0.75，p值=0.03）、CAJPSE01 sp003860125（IndVal = 0.76，p值=0.035）、Gemella morbillorum（IndVal = 0.80，p值=0.025）、Porphyromonas A 859424 endotalis（IndVal = 0.82，p值=0.015）、Oribacterium sinus（IndVal = 0.88，p值=0.035）。另一方面，考虑皮肤样本，六个物种在HAI_Skin组中显著更丰富，IndVal值范围从0.71到0.94：Luteolibacter gellanilyticus（IndVal = 0.71，p值=0.03）、Pseudomonas F furukawaii（IndVal = 0.76，p值=0.03）、Sphingomonas L 486704 sp. 001421355（IndVal = 0.77，p值=0.01）、Prevotella denticola（IndVal = 0.82，p值=0.01）、Lactobacillus gasseri 329,735（IndVal = 0.84，p值=0.045）和Streptococcus mutants（IndVal = 0.94，p值=0.005）。此外，只有一个物种，Faecalibacterium prausnitzii（IndVal = 0.70，p值=0.045），与NoHAI_Skin组显著相关。

4 讨论

本研究聚焦于探索人体微生物群与接受VEGs植入的患者发生HAIs之间的潜在关联。调查皮肤和口腔微生物群允许考虑不同身体部位的微生物群落在术后HAIs背景下的情况，为潜在风险因素提供更广泛的视角。事实上，在接受腹部移植物植入的患者中发生HAI可能导致VEGs感染，这是一种罕见但危及生命的状况，需要医疗和手术治疗的结合，后者包括清除感染的移植物，随后用生物或假体材料进行原位重建，这是一种与高发病率和死亡率相关的手术。

微生物学样本在手术后12个月收集，一个月后进行第二次收集，以捕捉相对稳定的微生物群，最小化暂时性因素（如季节性波动、药物治疗或饮食变化）的影响。为每位患者生成两个参考微生物谱（口腔和皮肤），提高了数据的可靠性。

本研究的另一个优势是患者的选择。比较组在年龄和性别方面保持平衡，确保队列之间的基本同质性。这最小化了人口统计学偏差，提高了分析的可靠性。初步检查确认组间年龄或性别无显著差异，使我们能够将组视为独立的同时专注于微生物群相关差异。

选择了总共20名患者，分为"病例"和"对照"组，并收集了有关人口统计学、手术、住院和器械的信息（补充表1）。尽管文献表明ASA评分、合并症和慢性治疗可能影响HAIs风险，但在我们的队列中，这些变量中没有一个在组间显示显著差异，表明相对同质性。唯一的例外是住院长度（p值=0.002）。然而，这一结果是预期的，因为更长的住院时间是HAIs发生的直接结果，而不是因果因素，这与先前的报告一致。

HAIs平均在手术后6/7天被检测到（补充表2），表明大多数感染发生得较早，这与先前的研究一致。我们在队列中观察到的HAIs类型是异质的（补充表2），以与肺部相关的感染为主，总共影响六名患者。这种较高的发生率与其它文献数据一致，这些数据显示大多数HAIs与肺部感染相关。其中，五名患者显示出肺实变，这是一种可能与肺炎或其他呼吸道疾病相关的临床状况。有趣的是，这些病例中未确定特定病原体，因此这些肺实变可能由非感染性因素或未被所用方法检测到的病原体引起。这与其它研究中的发现一致，在这些研究中，相当比例的肺炎病例保持培养阴性。一名患者发展为由白色念珠菌引起的肺部感染，这是一种在肺部感染中相对罕见的真菌病原体，但在免疫功能低下或接受侵入性手术的患者中已知会引起肺炎，如我们案例中所见。两名患者发展为尿路感染，一名由大肠杆菌引起（最常见的与尿路感染相关的病原体之一），另一名未确定特定病原体。尿路感染在住院患者中也很常见，通常与尿道导管的使用或手术期间对泌尿道的操作有关。未能检测到尿路感染的致病病原体有时可能发生（如我们之前引用的患者），特别是对于可能难以用标准诊断方法识别的多重耐药生物体。然而，在去年，正在开发新的技术方法来克服这个问题。此外，如前所述，一名患者发展为由阴沟肠杆菌引起的手术伤口感染，这是一种通常与手术部位感染相关的细菌。这种微生物是胃肠道正常菌群的一部分，但在免疫抑制或术后患者中可能变得致病。最后，在一名患者中检测到由溶血葡萄球菌引起的血流感染，这是一种已知在免疫抑制患者中引起感染的物种。这种病原体是皮肤正常菌群的一部分，但可能变得具有侵入性，特别是在有留置器械或接受大手术的患者中。

这些发现共同凸显了在VEGs植入后可能发生的感染的广泛谱系，并强调了人体微生物群在感染背景中的重要性。因此，为探索潜在的与微生物群相关的模式，在两个解剖部位跨不同分类水平进行了分析，从域和门到属和物种。

在域水平上（图2），口腔微生物群显示出比皮肤更高的绝对细菌丰度，这与口腔腔的温暖、潮湿和营养丰富的环境一致。相反，皮肤上较低的细菌丰度反映了其干燥、营养贫乏和暴露的条件。尽管口腔微生物群通常以比皮肤微生物群更高的细菌含量为特征，但我们观察到HAI和NoHAI患者之间的微生物多样性有所不同。具体而言，HAI患者的口腔样本中香农多样性降低（p值=0.597），而皮肤样本中增加（p值=0.023），与对照组相比，仅皮肤微生物群显示出显著差异（图6）。这一结果证实了Wang等人和Ogbanga等人最近发布的其他数据，可能反映了皮肤微生物组更大的时间变异性。

门水平分析证实了口腔和皮肤微生物群之间预期的差异（图3和补充图1a-d）。门水平分析的结果证实了口腔和皮肤微生物群组成已知差异，突显了微生物多样性和主要门的相对丰度与起源解剖环境密切相关。例如，厚壁菌门D在口腔中更丰富（52% vs. 28.5%，p值=0.00002），而放线菌门在皮肤中显示出更大的丰度（33.5% vs. 14.5%，p值=0.002）。这些差异与位点已知的功能和环境特征一致。其他门，如厚壁菌门C、梭杆菌门和厚壁菌门A，也显示出类似的趋势，突显了皮肤和口腔微生物群之间的组成差异，而变形菌门在位点之间相似，如其他研究所观察到的。总体而言，这些结果证实了门水平上口腔和皮肤微生物群微生物组成之间的已知区别。

比较HAI和NoHAI患者，口腔样本显示在HAI_Oral与NoHAI_Oral组相比，细菌丰度非显著性降低，可解释为描述性趋势，而皮肤样本显示在HAI_Skin与NoHAI_Skin相比，细菌丰度显著增加（p值=0.007）（图2）。这些结果与先前描述的微生物多样性α稀释曲线分析结果一致。特别是，HAI患者口腔微生物多样性的降低可能表明菌群失调状态，可能易导致机会性定植，尽管无法确定因果关系。相反，HAI患者皮肤微生物多样性的增加似乎与一些研究相矛盾，这些研究表明皮肤微生物多样性降低是感染、皮肤病或抗生素暴露的结果。然而，我们的观察可以在考虑疾病不同背景和阶段的更复杂现象的背景下解释。尽管如此，这种增加并不意味着直接的致病作用；它可能反映了在某些临床条件下机会性或环境分类群定植的增加。

为进一步探索实验组之间微生物组成的变化，使用基于Aitchison距离的PCoA图评估了β多样性，该距离评估了微生物群落之间的总体差异。PCoA图（图7）显示，沿轴1（总变异的11.98%），按解剖部位有明显区别，这与先前发现口腔和皮肤微生物群之间微生物组成存在显著差异的研究一致。在每个解剖部位内，HAI样本在轴2和轴3（总变异的6.10%和4.84%）上显示出更大的离散度，表明发展感染的患者的微生物群落异质性增加。这与感染可能是人类微生物群不同显著变化的结果的概念一致，但尚不能建立与HAI发展的因果联系。值得注意的是，HAI组的皮肤样本（HAI_Skin）显示出最明显的变异性。总体而言，这些结果表明患者和解剖部位之间的微生物结构存在差异，但发现仍具有探索性。

随后，门、属和物种水平的分析确定了明确表征HAI和NoHAI组的分类群。在门水平上，一些门在实验组之间显示出显著不同的丰度（图4）。拟杆菌门、梭杆菌门和螺旋体门在NoHAI_Oral组中最为丰富，表明其潜在的保护或中性作用。这一结果与将这些门归因于维持平衡口腔微生物群和调节局部免疫过程中心作用的文献研究一致。对于皮肤，异常球菌门在NoHAI样本中更丰富，可能反映了稳定的微生物群。相反，蛭弧菌门E、脱硫杆菌门I和厚壁菌门D被检测为在HAI_Skin组中最为丰富，这些差异可能表明改变的微生物群组成，但功能和预测含义应进一步探索。

在属水平上，结果突显了特定微生物属在区分发展HAIs和未发展HAIs的患者方面的重要性（图5）。在口腔微生物群中，几个共生口腔属（如Leptotrichia、Campylobacter A、Tannerella和Porphyromonas）在NoHAI组中更丰富。相反，在发展HAIs的患者的皮肤样本中检测到特定属（包括Staphylococcus、Haemophilus D、Brevundimonas、Saccharimonas和Lancefieldella）的丰度增加。虽然其中一些属包括机会致病菌，但我们初步的发现只能表明与HAI发展的可能但非确定性关联。它们的丰度增加可能更多地反映了微生物失衡或感染易感性增加，强调了需要针对性研究来阐明其功能作用。

除了最丰富的分类群外，较少代表的细菌属也被发现可能与NoHAI或HAI组相关。尽管数量较少，但这些次要分类群可能在宿主-微生物相互作用和菌群失调过程中起关键作用。例如，在我们的案例中，Skermanella被确定为在HAI_Skin组中显著富集。这种通常具有环境来源的属可能表明外源性污染或皮肤屏障完整性的改变。

在物种水平上进行了IndVal分析，以识别与HAI和NoHAI组更具体相关的分类群，符合先前应用此方法进行生物标志物发现的研究（图8）。与NoHAI_Oral相关的物种（如Prevotella、Porphyromonas、CAJPSE01 sp003860125、Gemella morbillorum和Oribacterium）通常是平衡口腔微生物群的一部分，可能反映微生物稳态而非直接保护。唯一的例外是Eubacterium M. brachy，尽管其表征NoHAI_Oral组，但已被多次与口腔疾病和更少情况下与全身炎症相关。然而，它的存在更可能受宿主相关因素（如口腔接触香烟烟雾）的影响，而不是代表个体健康的生物标志物。相反，在HAI_Oral组中，识别出Veillonella A. dispar（IndVal值≈0.72）；虽然通常为共生菌，但它可能有助于生物膜形成，有利于机会致病菌的定植。尽管本研究未包括对生物膜形成的特定评估，但这一发现可能表明潜在的微生物相互作用机制，值得在今后的研究中探索。转向与皮肤微生物群相关的物种，Faecalibacterium prausnitzii，一种以其抗炎特性而闻名的肠道共生菌，与NoHAI_Skin组相关。尽管如此，我们在本研究中偶尔在皮肤上检测到它应谨慎解释，先前的研究表明它在皮肤水平上可能具有潜在的有益作用。相反，几种细菌物种，如Luteolibacter gellanilyticus、Pseudomonas F furukawaii、Sphingomonas L 486704 sp001451355、Lactobacillus gasseri、Prevotella denticola和Streptococcus mutans，与HAI_Skin组相关联。这些细菌物种主要是环境或机会性生物体，它们在皮肤上的检测可能反映了改变的微生物动态或暂时性定植，可能易导致感染。

总体而言，这些结果突显了不同解剖部位HAI和NoHAI组之间多样性和组成的差异，但发现仍具有探索性，需要进一步研究以评估这些微生物模式是否可作为患者风险分层或针对性预防干预的生物标志物。从转化角度看，理解这些微生物特征可以为未来的临床应用提供有用的框架。特别是，微生物特征可能支持在手术前识别有更高发展HAIs风险的患者，导致术前风险分层和设计旨在降低HAIs发生率的个性化预防或卫生干预。此外，如果在更大规模和纵向研究中得到验证，此类生物标志物可以补充现有的感染控制措施，提供更个性化的患者管理方法。然而，应谨慎解释当前数据，因为临床转化将需要进一步的方法学标准化和在更广泛手术人群中的独立验证。

确实，尽管本研究为识别与HAIs易感性相关的潜在预测生物标志物提供了初步见解，但必须考虑几个局限性。该研究仅限于接受VEGs植入的患者，并包括相对较小的样本量，限制了研究结果的普遍性。样本收集在手术后12个月进行，一个月后进行第二次采样。如上所述，特意选择此时间点是为了捕捉稳定的微生物群并最小化暂时性术后影响。证据支持微生物群落往往会重新建立近似术前基线状态的组成，同时最小化季节性和日常变异性。然而，这种方法无法捕捉手术前立即的微生物状态，引入了一些不确定性，将观察到的微生物群谱与HAIs风险联系起来。最终，其他局限性包括缺乏更长期的纵向数据、来自外部测序的潜在批次效应，以及部分未测量的与患者相关的因素（如生活方式习惯（饮食、卫生、阳光暴露、吸烟等）），这些可能充当混杂因素。

鉴于这些限制，本研究应被视为一项初步研究。需要进一步的针对性调查，以更好地阐明不同分类群作为HAIs潜在预测生物标志物的特定作用。未来的工作应旨在在更大队列中确认这些发现，理想情况下包括来自更广泛手术人群的患者，而不仅仅是VEGs手术。收集有关其他患者相关因素的额外信息将有助于解释潜在的混杂变量。此外，功能研究——也关注较少丰富的分类群——对于分析可能影响HAIs易感性的微生物相互作用和生态动态是必要的。最后，纳入术前采样可以更准确地表征基线微生物群，从而更清楚地理解微生物对HAIs的易感性。

5 结论

本研究为与HAIs易感性相关的微生物群谱差异提供了初步证据。在实验组之间观察到微生物多样性的差异，HAI_Oral组多样性较低，HAI_Skin组多样性较高，表明微生物多样性和感染风险之间的关系可能是解剖部位特异性的。分类分析表明，口腔微生物群更具"对照"组特征，而皮肤微生物群显示出更多与"病例"组相关的特征。在"病例"组中识别出的分类群通常是环境性或可能易导致菌群失调的，而在"对照"组中的分类群则显得更平衡且可能具有保护性。虽然这些发现突显了可作为探索性生物标志物的微生物谱，但研究的局限性（包括小样本量、特定程序队列、术后采样和未测量的患者因素）意味着结果应在无泛化的情况下解释。需要在更大规模和更多样化的人群中进行进一步研究，理想情况下包括术前采样和功能分析，以验证这些观察结果。总体而言，这项初步研究强调了人体微生物群在理解HAI风险方面的潜在相关性，并可能为个性化感染预防的未来方法提供信息，旨在改善对HAIs的理解，提供减少其对公共卫生和医疗系统影响的具体工具。

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