背景
人体微生物组由存在于各种器官和组织内外的微生物群落组成，包括细菌、病毒和真菌。仅细菌的总数（38万亿）就估计超过我们自身细胞的数量（30万亿）¹,²。除了那些引发即时健康问题的微生物外，人们对这些微生物的关注一直较少。然而，近年来，由于检测技术的改进，人们开始关注身体特定器官和组织的微生物组，包括肠道³,⁴。作为肠道一部分的人体结肠（大肠）是体内微生物组的最大贡献者¹。肠道微生物组最为多样化，参与了广泛的代谢过程，这些过程可能有益（包括促进脂肪储存、血管生成、免疫训练、维生素生物合成、药物代谢以及复杂食物化合物的分解）⁴,⁵，也可能有害（菌群失调导致不同疾病状态或直接引起感染），这取决于微生物的种类和/或丰度⁴,⁵。
早期研究报道，简单碳水化合物，包括食糖（蔗糖）、果糖和乳糖，在摄入后不需要消化，而是在小肠上部被迅速吸收⁶。然而，复杂碳水化合物，包括淀粉、纤维素和纤维，在胃中不易消化，可能会到达大肠，在吸收前由肠道微生物分泌的酶协助消化⁶。此外，肠道微生物对不可消化纤维的发酵会产生短链脂肪酸，这些短链脂肪酸可被身体用作营养来源，并在肌肉功能和预防慢性疾病（包括某些癌症和肠道疾病）方面发挥重要作用⁶。释放的短链脂肪酸降低了结肠的pH值，这限制了能在结肠中生存的微生物范围，限制了某些有害细菌（如艰难梭菌）的生长⁶。
与健康肠道相关的微生物群，包括普雷沃菌、瘤胃球菌、拟杆菌、厚壁菌、消化链球菌、双歧杆菌和乳杆菌，它们在低氧环境中茁壮成长，通过争夺营养和附着于肠道黏膜（免疫活动和抗菌蛋白产生的主要场所）的位点，来防止通过饮用或食用受污染的水或食物进入体内的有害细菌过度生长⁷⁻⁹。
已知直接影响肠道微生物组成和/或丰度的因素包括环境、出生方式、药物使用、遗传和饮食，这些因素造就了独特的个体特异性微生物组³,¹⁰,¹¹。然而，现在人们的注意力主要集中在饮食对塑造肠道微生物组的直接影响上，因为无论我们出生在哪里或如何出生、健康与否，每个人都会进食⁶。富含益生元如果聚寡糖、菊粉、果胶、抗性淀粉和树胶的食物物质，包括水果、蔬菜、豆类和全谷物（如小麦、燕麦、小米和大麦），对肠道健康特别重要，因为它们作为有益微生物群的食物⁶,¹²。然而，益生菌食品，包括发酵食品，如开菲尔、含活性菌种的酸奶、泡菜蔬菜、天贝、康普茶、泡菜、味噌和酸菜，含有有益的活性微生物，可能会进一步改变微生物组¹³,¹⁴。
育龄妇女（WRA）是一个特殊群体，她们对营养素的需求很高¹⁵，尤其是在怀孕和哺乳期间。生活在贫困社区的妇女特别容易营养不良，随之而来的是健康问题¹⁵。因此，通过可获得的、营养丰富的食物来满足这一群体妇女的营养需求，对改善孕产妇和儿童健康结果以及整体社区福祉具有重要意义。然而，在经济条件较差的社区中，很难满足特定营养素的日常需求。生活在贫困社区的妇女特别容易营养不良，随之而来的是健康问题¹⁵。布基纳法索（Burkina Faso）生产的发酵牛奶-小米饮料"德格"（degue）在加纳越来越受欢迎，已成为加纳城乡居民快速获取营养的来源。这种产品通常因其原产地而被称为"布基纳"（burkina）或"布鲁基纳"（brukina）。然而，牛奶的高成本使该产品价格昂贵，贫困人群难以负担。此外，这种产品不适合乳糖不耐受者。我们的研究旨在使用大豆（一种富含纤维、蛋白质、镁、铁和脂肪的廉价豆类）生产的牛奶替代牛奶来生产布基纳，并评估其对加纳育龄妇女肠道微生物组多样性的潜在益处。我们预计这种称为大豆奶-布基纳（SMB）的发酵植物性奶产品将更便宜、更安全，并对消费者更有营养益处。此外，与饲养牲畜获取牛奶相比，大豆奶在布基纳生产中的使用对环境影响更小，最终将促进大豆市场的发展，而大豆市场正在大力推广以改善加纳当地农民的生计。
方法
研究区域
本研究在加纳沃尔特地区的霍霍埃市（HMV/GH）进行。根据加纳共和国财政部2024年报告：HMV/GH人口规模为114,472（2021年人口住房普查数据），其中男性54,893人（48%），女性59,579人（52%）。与区域平均水平（每平方公里175人）相比，HMV/GH人口密度高（每平方公里312.3人），约73%的人口居住在城市地区，27%居住在农村地区。该市平均家庭规模为3.1人，低于区域平均值3.3人和全国平均值3.6人。
伦理批准
研究方案和方法经加纳卫生服务伦理审查委员会（GHS-ERC 015/10/21）、科学与工业研究委员会机构审查委员会（CSIR/IRB/AL/VOL 1-017）和健康与 allied 科学大学研究伦理委员会（UHAS-REC A7 (2) 2t-22）审查和批准，以确保结果的完整性和保护参与者，符合《赫尔辛基宣言》。
纳入和排除标准
纳入15-49岁的育龄妇女，无论是否怀孕或哺乳，而年龄<15岁的女孩和年龄>49岁的妇女被排除在外。在研究开始前至少一个月内服用抗生素或服用维生素矿物质补充剂的妇女也被排除在研究之外。
知情同意和参与者招募
在招募前，向所有愿意参与的育龄妇女获得知情同意（向所有育龄妇女宣读，识字者签名，不识字者按手印）。对于18岁以下的妇女，在入组前还需获得其本人同意以及法定监护人或父母的同意。使用半结构化问卷收集招募的育龄妇女的人口统计学信息。本研究招募了40名参与者，包括10名哺乳母亲、10名孕妇和20名非孕妇非哺乳（NPNL）妇女（表1）。招募的育龄妇女被分为两个饮食队列，分别喂食大豆奶-布基纳（SMB）（5名哺乳母亲、5名孕妇和10名既不怀孕也不哺乳的妇女）或大豆奶-小米混合饮料（5名哺乳妇女、5名孕妇和10名NPNL）。
大豆奶-布基纳（SMB）和大豆奶-小米混合饮料（SMMB）的生产
SMB和SMMB的制备原料包括大豆、珍珠小米、糖和适量盐。生产包括四个不同阶段：大豆奶生产、大豆奶发酵成酸奶（用于SMB）、小米粉蒸煮以及将蒸煮后的小米粉与新鲜大豆奶或大豆酸奶混合（补充图1）。
大豆奶生产
大豆奶使用内部定制程序生产。简而言之，2千克整粒大豆在室温（28°C）下用饮用水浸泡8小时。随后用电动研磨机将大豆与6升水一起研磨成糊状。再加入8升水，持续搅拌形成浆液。然后将浆液在压力锅中以110°C和1巴压力煮15分钟。过滤煮熟的浆液以提取12-15升大豆奶。每升大豆奶添加45克糖和1克盐以改善口感。然后添加香草调味。使用折射仪评估白利糖度，确保每轮生产的大豆奶具有最佳一致性。
大豆酸奶生产
大豆酸奶的制备方法与牛奶酸奶基本相似。从AECI食品与饮料公司（AECI Limited的子公司）采购了酸奶 starter culture（YC-380，版本：5 PI EU EN 11-11-2019）。以每升大豆奶0.1克的比例添加starter culture，并加热至45°C并充分混合。接种后的大豆奶在预设温度45°C下培养8小时，制成"可饮用"的大豆酸奶。
蒸小米凝集物生产
1千克小米洗净并浸泡8小时。然后沥干、冲洗并研磨成粗粉。将粗粉洒上水，用手掌揉搓形成生凝集物。在中火上煮沸2升新鲜水。将生凝集物加入沸水中，持续搅拌20分钟，直至达到结块和粘稠的质地。将结块的小米（蒸凝集物）从沸水中取出，在室温下冷却。
SMB和SMMB的配制
将1升大豆酸奶测量到混合碗中。加入600克蒸小米凝集物，用叉子捣碎结块，然后舀入含有大豆酸奶的混合碗中。使用气球搅拌器将大豆酸奶和蒸小米碎屑充分混合，直至碎屑均匀分散在整个酸奶中，形成SMB。SMMB的配制遵循相同程序，用未发酵的大豆奶替代大豆酸奶。生产的SMB和SMMB在5°C下冷藏，直到准备食用。
参与者喂养和粪便样本收集
这项单盲集群随机对照试验于2022年9月至11月进行。集群是接收SMB或未发酵产品（称为大豆奶-小米混合饮料，SMMB）的不同社区。每名育龄妇女在直接观察下每天喂食300毫升SMB或SMMB，持续八周，以确保依从性。使用OMNIgene-gut（OM-200）样本收集套件在基线（干预前第0周）、干预期间（第6周和第8周）和终点（干预后第10周和第12周）收集粪便样本，并在-80°C下储存，直到准备进行DNA提取和宏基因组研究。我们选择这些干预前、干预中和干预后研究设计，以确保在干预前有明确的基线信息，检测干预的潜在影响，并检测干预的影响是短暂的还是持续存在的。
粪便样本DNA提取用于宏基因组分析
在无菌条件下，让冷冻样本在室温下解冻，然后使用DNeasy PowerSoil® Pro试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）根据制造商的协议进行DNA提取。简而言之，将约1000 µL的每种液化粪便样本添加到含有裂解缓冲液的Power Bead Pro管中，并在Bead Genie bead beater（Scientific Industries Inc.，纽约，美国）中以最大速度机械均质化5分钟。去除抑制剂后，DNA结合到固体界面进行洗涤。然后洗脱纯DNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，马萨诸塞州）检查其质量。DNA样本在-80°C下储存，直到作为60 µL等分试样在密封的96孔板中运送到美国明尼苏达大学基因组中心（UMGC），用于16S rRNA V3/V4区域文库制备和使用Illumina平台的测序，遵循制造商的协议。
序列生物信息学分析
使用fastp去除Illumina适配器序列并过滤低质量读数，对解复用的配对端序列读数进行修剪。使用kraken2和标准32gb kraken微生物数据库对过滤后的读数进行各种分类群的分类分配。将分类分配的相对丰度合并为单个.csv文件，导入R进行进一步分析。将样本元数据导入R并与合并的kraken2报告结合，使用R的phyloseq包生成系统发育序列（phyloseq）对象，用于下游分析。使用R中实现的RStudio中的vegan包的rarefy_even_depth函数进行稀疏化（稀疏深度为1000，低于序列深度最小的样本的深度）后，使用vegan包的多样性函数生成特征表和数据摘要，以确定每个样本的序列分布和使用R中实现的加权UniFrac度量的β-多样性（两个或多个样本之间物种组成的差异），以及样本的α-多样性（样本内微生物物种的多样性）。
统计分析
在指定时间点，使用95%置信水平的Fisher精确检验和PERMANOVA分析进行两组之间的α-多样性和β-多样性分析。我们使用Bonferroni校正进行多次假设检验，以避免犯I类错误（拒绝真实的零假设）。在alpha水平为0.05的情况下，哺乳母亲和孕妇之间比较的调整p值≤0.01被认为具有显著性，而非孕妇非哺乳妇女之间比较的调整p值≤0.005被认为具有显著性。
结果
肠道微生物群的多样性
肠道微生物群的Beta（β）-多样性
我们使用加权UniFrac度量评估两组之间的β-多样性，该度量考虑了分类群的系统发育关系和相对丰度。我们发现，通过主坐标分析（PCoA）（图1），ASV没有按组特异性聚类。PCoA图将ASV投影到二维空间，点之间的距离反映了微生物组成的差异。位置更近的样本代表相似的微生物群落，而距离更远的样本具有更不相似的群落。PERMANOVA分析证实，组间β-多样性差异在统计学上不显著（p=0.056），表明无论干预和/或时间点如何，研究参与者中任何特定肠道微生物的存在和/或相对丰度没有差异。
肠道微生物群的Alpha（α）-多样性
我们分析了参与者肠道微生物组的微生物多样性（图2）。我们发现，在喂食SMB和SMMB四周后，两组女性肠道微生物组的物种丰富度（Chao1指数，p=0.09）没有显著差异，尽管第1队列的Chao1指数相对较高。在研究期间，两组之间的物种丰富度差异保持不显著（p>0.01）。同样，在喂食四周后，SMB和SMMB之间的物种均匀度（Shannon多样性）和已识别物种的相对丰度（Simpson指数）相当（p>0.01）。喂食八周后，两组之间肠道微生物的相对丰度和/或均匀度没有差异。尽管SMB喂食队列中肠道微生物的相对丰度有轻微增加，但与SMMB队列相比，总体丰度仍然不显著（p>0.01）。此外，在喂食后四周，两组之间在物种均匀度和/或相对丰度方面没有观察到显著差异（p>0.01）。
最丰富肠道微生物的描述
除了评估整体微生物多样性外，我们还分析了所有组和时间点中20种最丰富的细菌物种。我们在合并数据集中确定了前20种细菌物种，并按其相对丰度排序，如下所示（表2）。这些按丰度递减顺序排列为：普拉梭菌、Enoeca普雷沃菌、Jejuni普雷沃菌、直肠真杆菌、Eligens真杆菌、脆弱拟杆菌、Ruminicola普雷沃菌、Valericigenes颤菌、Champanellensis瘤胃球菌、Phocaeense梭菌、Dentalis普雷沃菌、Aerofaciens柯林斯菌、Blautiasp. N6H1-15、Hadus厌氧孢杆菌、Hallii真杆菌、Marseille-P5638戴阿利斯特菌、Hominis罗斯伯里菌、Helcogenes拟杆菌、Pectinilyticus单球菌、Bicirculans瘤胃球菌。如热图所示（图3），这些物种的相对丰度在喂食前、喂食期间和喂食后四周在各组之间有所变化。
我们搜索了现有文献，了解从分析中识别出的二十种最丰富细菌对肠道健康的潜在影响（表2），并确定了13种有益细菌（普拉梭菌、Eligens真杆菌、脆弱拟杆菌、Ruminicola普雷沃菌、Champanellensis瘤胃球菌、Phocaeense梭菌、Blautiasp. N6H1-15、Hadus厌氧孢杆菌、Hallii真杆菌、Marseille-P5638戴阿利斯特菌、Hominis罗斯伯里菌、Helcogenes拟杆菌、Bicirculans瘤胃球菌）和七种有害细菌（Enoeca普雷沃菌、Jejuni普雷沃菌、直肠真杆菌、Valericigenes颤菌、Dentalis普雷沃菌、Aerofaciens柯林斯菌、Pectinilyticus单球菌）。
使用每种一个例子来评估食用SMB与SMMB对肠道健康的潜在影响，我们发现食用SMB显著（p<0.0001）降低了肠道中直肠真杆菌（与结肠癌相关）的比值比（OR），从1.15降至0.88（表3）。相比之下，尽管SMB在喂食前对普拉梭菌（肠道丁酸生产者）携带的OR高于SMMB（OR=1.07，95% CI=1.06-1.08，p<0.0001），但在干预期间后，携带情况没有显著差异（OR=0.99，95% CI=0.99-1.01，p=0.5375）。
有益和有害肠道微生物的分布
在喂食干预前，SMB和SMMB的已识别有益肠道微生物的总相对丰度分别为31.69%和31.52%（图4）。喂食八周后，这些有益微生物的丰度显著（p=0.0001）增加，SMB和SMMB分别达到21.15%和21.31%。喂食终止四周后，SMB的这些有益微生物比例显著（p<0.0001）降低至30.14%，但在SMMB中保持较高，为32.40%。相比之下，SMB中有害肠道微生物的比例在喂食干预前为32.72%，喂食四周后降至32.31%，八周时进一步轻微降至32.26%，干预后四周丰度急剧增加至34.27%（图4）。SMMB中也有类似趋势，干预前为32.89%，喂食四周时达到峰值33.31%，喂食八周时显著（p<0.0001）降低至32.00%，喂食后四周保持恒定（32.01%）。
讨论
人体肠道微生物组是一个复杂的生态系统，对健康和疾病至关重要，而饮食干预是调节其组成和功能的重要途径。⁴,⁵ 我们的研究特别旨在调查两种大豆食品——新型加纳发酵饮料大豆奶-布基纳（SMB）和大豆奶-小米混合饮料（SMMB）——对加纳育龄妇女（WRA）肠道微生物组的影响。这一目标源于SMB可能作为传统乳制品布基纳的经济实惠、营养丰富和易于获取的替代品的潜力，以解决经济受限社区中WRA的高营养需求。
我们发现SMB和SMMB队列之间的β-多样性（整体群落组成）没有显著差异。同样，α-多样性指数（Chao1、Shannon、Simpson）在物种丰富度、均匀度或多样性方面没有显著差异。这表明，在广泛的生态层面，两种大豆干预都促进了一个相对平衡的肠道生态系统，这对维持整体健康至关重要。³⁸ 然而，这一观察结果与一些早期报告形成对比，这些报告强调了肠道微生物组对各种饮食输入的快速、广泛反应。⁶,¹²⁻¹⁴ 一些早期报告展示了短期内的饮食相关微生物组变化，与本研究的观察结果相反。³⁹⁻⁴¹ 然而，我们的发现与现有文献的一些对比表明，尽管整体多样性可能保持不变，但在更细的分类水平上需要更仔细地检查具体组成。
确实，我们对20种最丰富细菌物种（占序列读数的64.41%）的详细分析揭示了有益和潜在有害分类群之间的动态相互作用，提供了对干预效果的更细粒度理解。我们特别注意到健康促进细菌的存在，如普拉梭菌、Eligens真杆菌、Ruminicola普雷沃菌和脆弱拟杆菌，它们分别以生产丁酸、抗炎特性、辅助植物丰富饮食的消化以及对肠道屏障完整性的贡献而闻名。²¹,²⁴⁻²⁶ 同时，也识别出潜在有害细菌，如Enoeca普雷沃菌、Jejuni普雷沃菌和直肠真杆菌，它们分别与机会性感染、牙周炎和结直肠癌相关。²²,²³ 然而，这些微生物的相对丰度在研究期间波动，表明受饮食组成的特定影响。⁴⁰,⁴²
关键的是，当专注于与肠道健康结果相关的指示物种时，我们的研究提供了直接证据，支持SMB消费的潜在益处，与我们的总体目标一致。SMB消费与直肠真杆菌（与结直肠癌相关的细菌）丰度的显著降低（p<0.001）相关，同时普拉梭菌（一种广泛认可的对肠道健康至关重要的有益细菌）的丰度增加（p<0.001）。⁴³,⁴⁴ 这种特定的调节表明，SMB可能通过抑制潜在致病分类群同时促进有益分类群来积极促进更健康的肠道环境。鉴于开发具有切实健康益处的发酵植物性产品的背景理由，这一发现尤为重要。
然而，一个关键观察是这些有益变化的短暂性。干预期间观察到的积极变化，特别是SMB队列中有害微生物减少和有益微生物增加，在干预后四周内往往会逆转。这突显了饮食建立的肠道微生物组变化的短暂性³⁹⁻⁴¹，并强调了持续饮食模式的必要性，如先前报道的那样。⁴⁰,⁴⁵ 虽然短期益处是明确的，但这种短暂效应强调，持续消费SMB可能是维持其对结直肠癌等疾病的保护作用并提供持续健康益处所必需的。不幸的是，大多数此类饮食昂贵且对弱势群体不可负担。⁴⁶⁻⁴⁹ 然而，SMB由相对便宜的大豆和小米制成，可以相对便宜地提供给这些弱势群体，帮助弥合营养差距。
我们的研究结果有助于理解植物性食品干预（特别是涉及发酵的干预）如何调节微生物组成。通过证明SMB消费的特定益处，本研究支持传统发酵食品在改善肠道健康方面的效用，特别是在当地食品系统和可负担性的背景下。这对旨在促进WRA和类似人群肠道健康和整体福祉的公共卫生策略具有重要意义，特别是在无法获得多样化和昂贵益生菌食品的地区。未来研究，包括更大的队列和代谢分析，对于进一步阐明这些有益饮食效应的机制和长期影响至关重要。
局限性和未来方向
本研究受限于从加纳单一社区招募参与者。这一限制可以通过在多个社区使用更大队列重复研究来缓解，以确认其稳健性，并调查潜在效应是否因人口统计学、遗传或基线健康差异而异。其次，未来研究必须通过粪便样本的代谢物分析来补充肠道微生物群组成分析，以阐明饮食修改在肠道环境中的功能后果，因为微生物丰度的变化并不总是转化为改变的宿主-微生物代谢相互作用。此外，检查观察到的微生物变化（特别是普拉梭菌增加和直肠真杆菌减少）如何与从富含纤维和蛋白质的SMB和SMMB中增强的营养吸收相关将至关重要，尤其是对于营养需求升高的育龄妇女。此外，鉴于本研究中观察到的有益效应的短暂性，长期可持续性的关键考虑因素，包括对饮食模式和一致性的理解，是必要的。这将有助于维持有韧性的肠道微生物组成和功能，确保像SMB这样的经济实惠解决方案能在资源有限的环境中提供持久的健康益处。最后，缺乏一个不食用大豆餐的对照组限制了对观察到的变化的解释。因此，未来的研究应纳入这样的对照组，以评估每种干预与定义的安慰剂组相比的特定效果。
结论
本研究旨在评估消费新型发酵大豆-小米饮料大豆奶-布基纳（SMB）对加纳育龄妇女（WRA）肠道微生物组多样性的潜在益处，特别是作为传统乳制品布基纳的更经济实惠和易于获取的替代品。我们的研究结果为这种植物性饮食干预与肠道微生物群之间的动态相互作用提供了有价值的见解。虽然整体α和β多样性分析显示，食用SMB和食用未发酵大豆奶-小米混合饮料（SMMB）的妇女之间在微生物丰富度、均匀度或群落组成方面没有显著的长期差异，但观察到了特定且临床上相关的微生物丰度变化。关键的是，SMB的消费显著降低了与结肠癌相关的直肠真杆菌的丰度，同时增加了有益的普拉梭菌的丰度。这些有针对性的变化表明肠道微生物组向更健康谱型的积极调节，直接解决了我们确定潜在健康益处的目标。然而，这些有益变化的短暂性——在干预后四周微生物组成恢复到基线——强调了持续消费以维持有韧性和促进健康的肠道微生物组的重要性。这项研究表明，像大豆奶-布基纳这样的经济实惠的传统发酵食品影响肠道健康的潜力，为改善弱势人群的营养结果提供了一条有希望的途径。需要进一步研究以阐明这些效应的精确机制，探索持续SMB消费的长期影响，并调查其对加纳和类似环境中WRA健康结果的更广泛影响。
数据共享声明
本研究中生成并使用的所有DNA序列及其登录号（补充表1）已存入NCBI数据库，登录号为SUB13443825。所有相关元数据可通过向通讯作者书面请求获取。
致谢
Richard LK Glover和Mary Glover-Amengor是本研究的共同资深作者。我们感谢比尔及梅琳达·盖茨基金会的资助，没有这一资助，本研究无法进行。此外，感谢加纳沃尔特地区霍霍埃市的育龄妇女自愿参与本研究，以及在整个研究过程中支持她们的家庭。我们向加纳阿克拉CSIR食品研究所（CSIR-FRI）的管理层、行政和实验室工作人员表示衷心感谢，感谢他们做出的巨大贡献，包括产品配方、初步测试和项目全过程的行政支持。感谢加纳霍霍埃健康与 allied 科学大学Fred N. Binka公共卫生学院的管理层主办干预研究。加纳阿克拉Legon大学Noguchi纪念医学研究所细菌学部门也值得特别提及，感谢他们提供实验室设施和技术人员进行DNA提取和其他确认性基因组研究。我们还感谢健康与 allied 科学大学Fred N. Binka公共卫生学院的学生，他们协助招募参与者和管理食品配方。
作者贡献
所有作者对报告的工作做出了重要贡献，无论是在概念、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面；参与起草和批判性审查文章；批准要发表的版本；同意向提交文章的期刊投稿；并同意对工作的所有方面负责。
资助
本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会为期18个月的资助（INV-033569），用于探索传统发酵食品对孕产妇营养的潜在健康益处的"将传统与技术整合用于发酵食品"大挑战项目。
披露
作者报告在本工作中无利益冲突。
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