摘要
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）在早期通常无症状，但可能进展为肝硬化等不可逆状况。由于人类肝活检获取受限，系统性和整合性的分子资源仍然稀缺。本研究对无肝脏病理或处于MASLD早期阶段的严重肥胖个体进行了肝脏转录组分析以及肝脏和血浆样本的代谢组分析。尽管血浆代谢组谱并不能完全反映肝脏组织学特征，但肝脏样本的双组学整合揭示了显著重塑的脂质和氨基酸代谢通路。整合网络分析表明，代谢重塑和基因表达分别是肝脂肪变性和纤维化进展的独立特征。值得注意的是，GTPases及其调节因子被确定为与早期肝纤维化相关的一类新基因。本研究提供了肥胖人群中早期MASLD的详细分子图谱，并突出了肥胖相关肝纤维化的潜在治疗靶点。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是最常见的慢性肝病，影响全球超过30%的成年人。MASLD的患病率与肥胖流行密切相关，在肥胖人群中患病率估计为75%，而普通人群仅为32%。作为代谢综合征的肝脏表现，MASLD可导致并由肥胖个体中常见的并发代谢异常引起，如胰岛素抵抗、糖尿病、血脂异常和高血压。
MASLD的早期阶段以肝脂肪变性为特征，即肝脏实质内三酰甘油（TAG）富集脂滴（LD）的过度沉积，通常是可逆的。然而，在部分患者中，疾病可发展为炎症和气球样变阶段，称为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），这是一种更严重的形式，纤维化发生率和严重程度增加。纤维化可出现在MASLD疾病谱的任何阶段，在每个阶段都与治疗并发症、肝相关死亡率和总体死亡率增加相关。未解决的纤维化可进展为终末期疾病，包括肝硬化和肝细胞癌，这些是治疗选择有限的致命恶性肿瘤。
代谢功能障碍是MASLD发病机制的主要特征和促成因素。肝脂肪变性通常伴随葡萄糖生成增加、新生脂质生成升高和胆固醇稳态破坏。在线粒体呼吸方面，为防止肥胖中脂质积累，其会适应性上调；但随着MASLD进展，线粒体可能功能障碍并加剧代谢失调。这些相互关联的代谢表型构成了MASLD发展的基础。代谢组学的最新进展大大增强了对MASLD分子系统生物学的理解，然而，很少有研究将此类分析与转录组学相结合，以提供对人类疾病发病机制的整合见解。
纤维化是MASLD中唯一与肝相关死亡率和发病率相关的组织学特征。在受损肝脏中，受损和凋亡的肝细胞通过释放促纤维化细胞因子（如TGF-β）并激活多条信号通路，调节肝细胞、肝脏巨噬细胞（库普弗细胞）和肝星状细胞（HSCs）之间的串扰。作为多细胞反应的结果，HSCs转分化为活性的、产生胶原蛋白的肌成纤维细胞，驱动纤维生成和细胞外基质（ECM）的过度沉积。由于纤维化是MASLD进展的关键预后标志物，从脂肪变性到纤维化的转变标志着疾病的关键点，为预防进一步进展提供了关键干预机会。尽管有某些MASLD临床管理指南可用，但在肥胖背景下，驱动疾病进展的关键转变背后的分子和代谢变化仍知之甚少。这给早期疾病管理和预防带来了挑战。
在本研究中，我们生成了基因表达和代谢组谱的综合图谱，以阐明肥胖中早期MASLD进展相关的分子事件。利用这一多组学资源，我们将调查重点放在与(a)从无肝脏组织学异常的肥胖到MASLD的转变以及(b)肝纤维化发生相关的关键分子变化上。我们的数据揭示了支撑脂肪变性和纤维化进展的不同分子特征，提供了早期MASLD中肝脏的详细分子图景，并突出了在初始阶段逆转纤维化的潜在治疗靶点。
结果
研究概述
我们分析了在澳大利亚墨尔本The Avenue、Cabrini或Alfred医院接受减肥手术前招募的109名肥胖个体的样本（表1和表S1）。根据材料和方法中描述的排除标准，33名个体缺乏组织学异常（无MASLD），76名患有MASLD（图1A）。值得注意的是，该队列中83名（76%）为女性。大多数肥胖个体处于早期疾病阶段，74名（68%）显示0-1级脂肪变性，83名（76%）显示0-1级纤维化。肝炎症和气球样变较轻，9例出现2级或更高炎症，仅1例显示2级气球样变（图1B和表1）。在临床检测中，与"无MASLD"相比，MASLD患者表现出更差的肝功能（更高的丙氨酸转氨酶[ALT]/天冬氨酸转氨酶[AST]比值和γ-谷氨酰转移酶[GGT]水平）、更高的非高密度脂蛋白胆固醇和血液甘油三酯水平、更高的C肽和胰岛素抵抗（表1，p<0.05），证实了正确分类。肝纤维化与胰岛素抵抗强烈相关，而脂肪变性分级与血浆脂质水平最相关（图1C）。
图1：研究概述。
(A) 总体研究设计。(B) 肝组织学特征分组的患者组成河流图。(C) 临床检测结果与肝组织学特征阶段之间的关系。节点大小由ANOVA测试中的–log10(p值)确定。颜色表示显著程度[–log10(p值)]和从早期到晚期阶段变化的方向。(D) 分析的肝脏和血浆中代谢物数量。(E-F) 肝脏代谢组、血浆代谢组和肝脏转录组的主成分分析。(G) 本队列涵盖的疾病谱以及与两个已发表数据集的比较。
我们进行了肝脏切片的平行转录组分析和肝脏和血浆样本的代谢组分析（见材料和方法）。非靶向代谢组学（涵盖极性和非极性代谢物，包括脂质）实现了对1104种肝脏和962种血浆代谢物的半定量（图1D）。非靶向代谢组学中的血浆尿素和肌酐水平与临床检测密切相关（图S1A），支持数据可靠性。主成分分析（PCA）显示肝脏代谢组根据MASLD状态有明显聚类，但在血浆中则没有（图1E）。肝脏转录组在具有和不具有MASLD的个体之间沿着主要主成分有轻微分离（图1F），表明转录程序可能既受MASLD组织学进展又受肥胖个体中混杂的代谢和生物过程的影响（表S2）。
由于脂肪变性和纤维化是MASLD的关键组织学特征，我们的统计分析重点是识别与它们的进展线性相关的分子决定因素（表S3-5）。模型针对患者特征（年龄、性别和BMI）以及2型糖尿病进行了调整，后者是因为其在不同疾病组中的患病率不同（表1）。此外，我们将转录组数据与另外两个已发表队列进行了比较：弗吉尼亚队列（VA队列，GSE130970），其疾病谱与我们研究相当；以及欧洲队列（EU队列，GSE135251），其疾病谱更广，涵盖晚期MASLD病理（图1G）。
肥胖MASLD患者中代谢组的全局调查
正如预期，MASLD个体的肝脏代谢组被广泛重塑。脂肪变性是与肝脏代谢组相关的主要组织学特征，206种代谢物显示出显著正相关，242种显示出负相关（q<0.05，图2A和图S1B）。例如，我们观察到甘油酯类（GLs，如TAGs、二酰基甘油[DAGs]）水平升高，膜脂质类特别是甘油磷脂（GPLs）水平降低（图2A-B和图S1B）。具体而言，脂肪酰链中含0-5个双键的TAGs与组织学结果呈正相关，而至少含有一个多元不饱和脂肪酸（PUFA）链（如双键数>5）的TAGs与疾病进展呈负相关，尤其是与脂肪变性（图S1C）。我们的发现可能是由于新生脂质生成增加以及与饱和脂肪酸相关的肝毒性升高所致。
血浆代谢组与组织学特征的关联有限（图2A），具有统计学意义的关联主要与脂肪变性相关，如TAGs（q值<0.05，n=22）和醚连接TAG（TAG-O，q值<0.05，n=8）种类。为了更好地解释血浆代谢组数据，我们进行了偏相关网络分析，以评估肥胖个体中循环代谢物、临床变量和肝脏组织学之间的关联。该网络显示血浆代谢物与临床变量的连接度最高，与肝脏组织学特征的连接较少（图2C）。这表明血浆代谢组主要反映其他代谢状况，如肾功能、血脂异常和胰岛素抵抗，而非肝脏特征。大多数血浆脂质类别与血液脂蛋白胆固醇水平相关（图2D）。然而，在肥胖背景下，血液脂蛋白水平与MASLD进展没有很强的相关性（图S2），表明它们对血浆代谢组的广泛影响可能掩盖了肝脏异常的信号。
接下来，我们比较了肝脏和血浆中与脂肪变性和纤维化相关的代谢物变化（图2E）。与肝脏GLs相比，血浆GLs与肝脂肪变性的关联相似但较弱，而肝脏中PUFA含量TAGs的消耗在循环中并未反映出来。尽管血浆极性代谢物在脂肪变性背景下显示出变化，但出现了潜在的循环标志物用于肝纤维化，具有轻微的统计学意义。随着纤维化进展，血浆中酪氨酸、喹啉酸、乳酸和犬尿酸水平呈上升趋势（p<0.05，q>0.05）（表S3），这与其报道的作用一致，即作为涉及MASLD进展的关键肝代谢物以及作为MASLD严重程度或经活检证实的MASH的潜在循环生物标志物。总体而言，尽管TAG水平升高和潜在的纤维化指标存在，但在肥胖个体和与肥胖相关的合并症中，循环代谢组对早期MASLD相关变化的指示性较差。
肝脏代谢重塑的整合视图
接下来，我们整合了肝脏代谢组和转录组，以表征肥胖个体在早期疾病发展过程中的代谢重塑。
脂质代谢
在肝脏中，GLs的积累和GPLs的轻度减少是代谢组变化的主要特征（见图2）。与此观察一致，我们确定了参与GLs和GPLs稳态的基因（图3A和图S3）。DGAT2、PNPLA3和PLIN3等基因在LD形成和TAG及DAG代谢中发挥作用。GPL代谢也显著改变，包括LPCAT1、PLD2、PCYT2、ETNK2等关键基因，这些基因参与对磷脂代谢转变和GPLs周转增加的补偿反应。在肝纤维化晚期个体中，参与初级胆汁酸生物合成的基因表达水平较低，如SLC27A5、AMACR、ACOX2、AKR1C4和BAAT。此外，一组细胞色素P450（CYP）基因在纤维化进展过程中下调，特别是那些参与CYP依赖性PUFA代谢（即将亚油酸和花生四烯酸转化为生物活性分子）和类固醇激素生物合成的基因（图3A）。总体而言，我们的数据突出了早期MASLD中编码合成和分解脂质代谢酶亚基的多个基因，其中一些基因信号在EU和VA队列中均一致观察到。
脂肪变性进展期间失调的代谢通路
为了使用双组学描述符探索代谢活动的变化，我们优先考虑了具有失调代谢物和基因表达的关键通路（图3B）。除了显著的GL和GPL重塑外，我们还在两个组学水平上识别出氨基酸代谢的改变通路。脂肪肝中甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸和丙氨酸等氨基酸水平升高可能反映了MASLD进展期间胶原合成和ECM重塑的增加。值得注意的是，芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在晚期脂肪变性患者中较低（图3D）。双组学数据揭示了色氨酸代谢的一致下调，包括吲哚和褪黑素通路（图3C）。然而，作为色氨酸分解代谢产物和犬尿氨酸通路中的关键代谢物，喹啉酸与肝脂肪变性和纤维化均显著升高。总体而言，早期MASLD发展与芳香族氨基酸水平降低和肝脏中色氨酸分解代谢通量改变相关，可能反映了肥胖MASLD患者异常的肠-肝轴通信。
此外，同型半胱氨酸及其上游代谢物S-腺苷同型半胱氨酸水平在脂肪肝中显著升高，表明甲基化失调与过度脂质储存相关。然而，这些代谢物的积累被纤维化相关的GNMT、MAT1A和AHCY等关键酶下调所缓解（图3C），这些酶已在体内模型中与肝脏病理发生联系。这表明DNA和蛋白质甲基化反应的不平衡可能是肥胖个体中肝纤维生成的重要介质。
此外，我们观察到抗氧化辅酶Q10（CoQ10；泛醌）及其中间体CoQ6和CoQ9在脂肪肝中的水平升高。还检测到两种其他抗氧化剂，牛磺酸和α-生育酚（维生素E）的水平也较高。氧化应激的另一指标，羟基丁酸，在晚期脂肪变性中增加，也被认为是胰岛素抵抗的早期标志物。总体而言，肝脂肪变性的进展伴随着氨基酸代谢和氧化应激调节的广泛变化。
线粒体功能和自噬中失调的基因
在肝脏代谢组中，晚期脂肪变性中观察到肝长链酰基肉碱（CAR）种类水平降低（CAR 18:2和20:4，表S4），表明脂肪酸跨膜运输和β-氧化失调。为了系统地评估β-氧化以外的线粒体功能，我们将脂肪变性和纤维化相关基因映射到MitoCarta3.0。出现了不同的线粒体功能障碍模式：脂肪变性涉及26个下调和55个上调的线粒体功能基因，包括16个与线粒体DNA维持相关的基因，而纤维化与151个下调（深绿色）和仅15个上调（橙色）基因相关（图4A和表S6）。这些转录变化表明，肝纤维化涉及广泛的线粒体功能障碍，导致氧化应激和ATP产生减少，这可能有利于脂肪性肝炎的加剧。
自噬作为应对肝内TAG和胆固醇过载的关键细胞反应机制。代谢组分析显示游离胆固醇增加和CE 18:1和18:2水平降低，这是主要的肝CE种类，支持先前发现，即CE脱酯化有助于MASLD中游离胆固醇升高。尽管自噬与HSC活化有关，但其在MASLD进展中的作用仍不清楚。使用自噬激活预测基因列表，我们发现自噬激活和溶酶体生物发生与脂肪变性的关联比与纤维化更强，ULK1和MTOR等关键自噬基因上调（图4B）。对600多个自噬基因的进一步调查揭示了早期MASLD中活跃的自噬启动，其中mTORC和上游效应物、溶酶体和自噬核心组装基因等通路中的119个基因表现出改变的表达水平。这表明自噬在脂肪变性期间作为对肝脂毒性的适应性反应，但随着疾病进展，其激活可能下降，如NR1H4、SIRT5、FOS和EGR1等关键调节因子下调所示，从而损害肝脏代谢。
肝脂肪变性和纤维化的分子特征相互独立
为了进一步了解肝脏中的双组学数据，我们进行了偏相关网络分析，以整合肝脏转录组、代谢组和临床数据。由此产生的子网络突出了与脂肪变性和纤维化相关的不同分子特征（图5A）。脂肪变性主要与肝中性脂质积累和相关代谢组学改变相关，而纤维化主要与转录变化相关，包括ECM重塑（如TGFB3、FSTL1）、信号转导（如RHOU、DOK3）和代谢（如CYP2C19、PNPLA4、SGPL1）相关基因的上调。这些发现强调了驱动脂肪变性和纤维化进展的独特分子通路的存在。
在我们的转录组分析中，992个和1,251个基因标记分别被确定为与脂肪变性和纤维化的组织学特征显著相关，两组之间重叠有限（图5B和表S5，q值<0.05），表明每个特征都有独特的转录调控。功能富集分析进一步支持这一区分，揭示了与每个基因集相关的 largely非重叠的生物过程（图S5和表S8）。
为了区分仅与脂肪变性或纤维化相关的基因特征，我们在回归模型中包含了另一个组织学特征作为协变量。这使我们能够定义脂肪变性特异性基因（独立于纤维化）和纤维化特异性基因（独立于脂肪变性）（表S9）。由于在MASLD病理生理学中脂肪变性先于纤维化，脂肪变性和纤维化特异性基因的富集分析揭示了生物过程的"伪时间"进展（图5C）。与脂肪变性相比，更多通路与纤维化相关。脂肪变性特异性上调基因在蛋白质糖基化、炎症反应、脂质分解和溶酶体组织中富集。
相比之下，纤维化特异性基因显示各种代谢通路下调，以及与ECM重塑、缺氧、信号传导和细胞形态发生相关的通路上调。此外，凋亡相关通路在脂肪变性中被抑制但在纤维化中被激活，而核苷酸代谢则显示相反趋势，表明在MASLD发展中细胞死亡和增殖的动态调控。这些发现表明在早期MASLD进展中存在独特且病变特异性的基因调控程序。
此外，与先前观察一致，即肝纤维化在临床检测中与胰岛素抵抗参数相关（图1C），我们发现糖尿病MASLD个体在纤维化进展时比非糖尿病MASLD个体表现出更多下调基因（表S10）。由于糖尿病亚组中大多数受抑制基因参与代谢（如BAAT、G6PC1、SULT2A1、MAT1A），我们假设糖尿病可能加剧与肝纤维化进展相关的代谢功能障碍。
纤维化启动的基因特征
为了进一步探索纤维化发展中的代表性基因特征，我们通过将基因表达水平与两个不同基线（无MASLD和脂肪变性）进行比较，确定了213个基因作为进展标记（方法中提供详细信息；表S11）。其中，75个这些标记与VA队列中的纤维化相关基因重叠，35个与EU队列重叠（图6A），产生130个新的纤维化标记。这些纤维化标记的通路分析突出了信号转导和ECM组织/分解的突出作用，正如预期（图S6A）。为了推断来自整体测序信号的细胞类型来源，我们将进展性纤维化标记映射到人类肝脏单细胞图谱。上调基因似乎反映了不同细胞类型的变化，而下调标记主要是肝细胞特异性的（图6A，左侧面板）。这表明在肝纤维化发展的早期阶段，转录程序在不同细胞类型中被激活，而肝细胞功能在此过程中可能减弱。同时，我们观察到与TGF-β和SMAD信号级联（TGFB1、TGFB3和INHBA）、ECM激活剂、调节因子（CDK8、CTDSP2、HDAC1和HDAC7）以及下游靶点相关的纤维化相关基因上调（图S6B）。这与先前报道一致，即TGF-β信号和HSC活化在MASLD进展过程中驱动纤维化。
鉴于从单纯脂肪变性到纤维化发生的转变是疾病管理的关键窗口，我们将伴有脂肪变性的纤维化个体与仅有脂肪变性但无纤维化的个体之间的基因表达谱进行了比较（表S12）。值得注意的是，此比较中富集度最高的通路是GTPase信号及其调控、信号转导和先天免疫反应（图6B）。此外，我们确定了37个与纤维化进展显著相关的GTPase相关基因（图S7A和表S13）。为了探索GTPase信号在纤维化中的潜在作用，我们检查了编码GTPases、GTPase激活蛋白（GAPs）和鸟苷酸交换因子（GEFs）的251个基因的清单，使用Human Cell Map和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析其相互作用组。
在已测试与GTPase相关基因存在物理相互作用或亚细胞接近性的6,971种蛋白质中，508种在我们的队列中与纤维化进展显著相关（图6C）。该网络表明GTPases及其调节因子与各种纤维化基因相互作用，ARF3和RAC1是网络的中心枢纽。核心节点的功能富集揭示GTPase网络在纤维化进展过程中调节细胞内运输、肌动蛋白细胞骨架组织、胞吐作用和其他生物过程（图S7B）。因此，GTPases及其调节因子与编码其蛋白质相互作用伙伴的纤维化相关基因共调控，支持GTPases与肝纤维化之间可能存在功能联系。这得到了TGF-β基因与共表达GTPase相关基因正相关的支持（图S7C），表明TGF-β信号与GTPase通路之间可能存在联系。
为了实验验证我们的发现，我们在一个独立系统中使用建立的3D肝球体模型探索了GTPase相关基因表达的改变，在该模型中肝细胞可保持数周的活力和功能。具体而言，我们将来自经组织学证实的MASH患者的原代人肝细胞与库普弗细胞和星状细胞共培养，并检查了我们人类队列和体外系统之间GTPase调控基因的总体表达谱。在评估人类患者和3D球体系统时，GTPases的表达在很大程度上是一致的（图6D）。与对照组相比，MASH患者的球体显示24个编码GTPases及其调节因子的基因上调（图6E）。值得注意的是，用elafibranor（一种双重PPARα/δ激动剂）治疗肝球体，将17个（70%）GTPase相关基因的表达水平恢复到基线（图6E）。该独立系统进一步表明GTPases可能在MASLD发病机制和纤维反应中发挥作用。
由于HSCs是负责激活纤维化的主要肝细胞类型，我们接下来评估了在永生化HSC细胞系LX-2细胞中抑制GTPase活性是否能减弱纤维生成标志物（图S8A）。靶向Rac1（NSC23766）和Cdc42（ML141）的选择性GTPase抑制剂在基础条件下降低了COL1A1和COL1A2的mRNA表达以及前胶原分泌（图S8）。TGF-β1介导的激活诱导了预期的胶原分泌和基因表达增加，这被Rac1抑制剂（NSC23766）和在较小程度上被ML141减弱。此外，检查先前发表的从小鼠CCl4介导的肝纤维化中分离的HSCs的转录组数据，揭示了与我们人类队列中脂肪变性到纤维化的转变相当的GTPases上调，其时间模式与肝胶原沉积一致（图S9A）。此外，在人类肝类器官模型中，TGF-β诱导肝细胞和HSCs中GTPase相关基因表达增加，但在成纤维细胞中没有（图S9B），表明肝细胞和HSCs之间可能存在TGF-β/GTPase轴的前馈循环。为了研究GTPase调控中的细胞间串扰，我们检查了LX-2细胞、肝细胞单培养和球体共培养（包括肝细胞、HSCs、库普弗细胞）中的关键GTPase相关基因。如图S10所示，TGF-β1在共培养、肝细胞和LX-2细胞中一致地诱导了VAV1和DOCK2的潜在增加，而RAC1、RAB32和RHOU显示出细胞类型特异性反应。这些发现表明多种肝细胞类型介导GTPase调控，强调了细胞间串扰。
总体而言，这些额外实验和数据集分析确定了纤维化启动期间上调的GTPase相关基因（图S9C）。然而，需要进一步深入的机制研究来验证这种关联。
讨论
在本研究中，我们对109名早期MASLD肥胖个体进行了全面的组学分析。通过整合双组学方法，我们绘制了肝脏和血浆代谢组，并确定了与脂肪变性和纤维化进展相关的独特肝脏分子特征。值得注意的是，纤维化与肝脏基因表达的全局重编程密切相关，GTPase相关基因被确定为纤维化启动的可能介质。
在该肥胖队列中，血浆代谢组在MASLD中显示出有限的改变，除了升高的循环TAGs外。这与McGlinchey等人报道的血清代谢组中超过20种差异代谢物相矛盾。我们推测差异源于两项研究涵盖的不同疾病谱，因为另一项研究的队列包括NAS评分≥4（63.4%）的晚期MASLD病例。此外，我们的研究专门关注肥胖个体（中位BMI>43.0），明显高于另一项研究。最近的一份报告强调了肥胖和瘦MASLD个体之间不同的代谢物特征，指出肥胖个体中差异代谢物少于瘦个体。这表明在肥胖患者中，血浆脂质组对肝脏病理的反映不如瘦个体。同样，BMI分层的多变量模型揭示了不同肥胖程度下循环MASLD代谢物特征的差异，瘦亚组显示出显著改变的循环脂毒性中间体。因此，如图2C所示，我们假设肥胖中共存的合并症可能掩盖了早期MASLD中血浆中的肝脏衍生代谢信号。鉴于肥胖个体是受MASLD影响的主要人群，可以合理地得出结论，血液代谢物分析是否能在早期阶段达到识别疾病进展的诊断准确性，取决于研究中涵盖的疾病谱，并且仍然是特定于上下文的。然而，液体活检、细针肝活检和肝脏特异性细胞外囊泡的评估可能会开辟其他微创诊断机会。
我们研究的优势是通过转录组和代谢组范围的变化来表征与脂肪变性和纤维化相关的肝脏病理生理学。与一般预期一致，我们的工作在代谢物和基因水平上突出了肥胖患者人类肝脏组织中改变的肝脏脂质代谢。与GLs的变化一致，DGAT2、PNPLA3和PLIN3的更高表达水平与脂肪变性进展相关。编码催化新生TAG合成最后一步的关键酶的DGAT2的更高表达意味着在内质网中将TAGs整合到LDs中得到增强，这可能减轻脂质诱导的内质网应激并避免脂毒性脂质的积累。PLIN3的上调与纤维化和脂肪变性等级的提高相关。PLIN3编码的蛋白质与其他PLIN蛋白质一起，在LD稳定和防止TAG水解中发挥重要作用，因此可能有助于肝脂肪变性。此外，尽管先前的动物研究报道了MASLD模型中鞘脂水平的增加，但我们并未在早期阶段的肥胖患者中观察到这一点。鞘脂代谢在不同患者组成的队列中有所不同，表明鞘脂代谢可能取决于疾病阶段、肥胖状态，并且在人类和小鼠之间存在差异。
除了脂质代谢外，其他代谢通路和过程也在双组学水平上表现出失调。具体而言，随着过度脂质沉积，我们观察到具有抗氧化作用的牛磺酸和维生素E水平升高，这可能反映了肝脏对氧化应激的反应。重要的是，随着脂肪变性的进展，氨基酸代谢显著失调，表现为丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的肝脏水平升高，以及芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸水平降低。先前的体外研究也表明，棕榈酸补充会破坏PH5CH8和HepG2细胞中芳香族氨基酸的代谢。作为微生物群衍生的代谢物，这些氨基酸的失调可能反映了肠道功能紊乱，并可能影响MASLD患者中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的从头合成。此外，我们还观察到自噬激活与肝内脂质和胆固醇积累同时发生的证据，其中溶酶体相关基因与脂肪变性独特相关，如图4B所示，并通过脂肪变性特异性过程中溶酶体组织的富集在图5C中突出显示。这种自噬反应很可能是一种保护机制，以减轻脂肪变性；然而，纤维化发展过程中自噬调节因子的下调可能加剧肝脏代谢功能障碍。
随着肝纤维化的进展，参与初级胆汁酸生物合成、PUFA代谢和类固醇激素生物合成的基因表达水平较低，特别是ACADS、ACADSB和ACADM，它们编码催化脂肪酸β-氧化初始阶段的关键酶，以及HADH和ACAA1，它们编码在β-氧化晚期起作用的酶。此外，与纤维化进展相关的线粒体相关基因下调，特别是与线粒体内膜电子传递链相关的基因。这可能表明由早期线粒体功能障碍引起的病理性氧化应激和ATP产生受损可能加剧脂肪肝炎症，并且炎症反应的增强可能成为肝纤维化的重要原因。
通过单变量假设检验和偏相关分析，我们揭示了与纤维化和脂肪变性相关的不同分子特征。肝纤维化与基因表达改变相关，从中我们确定了200多个追踪其逐渐进展的进展标记。此外，GTPase相关基因在纤维化出现和进展时在mRNA水平上失调。GTPase调节因子的表达增加在3D原代人肝球体中得到独立确认，elafibranor将其表达恢复到基线水平（图6E）。elafibranor治疗后GTPase调节因子表达下调表明GTPase信号可能涉及潜在的抗纤维化机制。
GTPase蛋白质根据其序列和结构分为几个亚家族，如Rho-、Ras-和Arf-GTPase。GAPs和GEFs是GTPase活性的关键调节因子，调节内在GTPase功能和GTP结合状态。只有少数研究阐明了GTPases在肝脏病理中的作用。例如，Rap1a被确定为抑制糖异生和肝脂肪变性的信号分子。Rab23特异性GAP，GP73，已被牵涉触发非肥胖MASLD。此外，通过ROCK1/AMPK轴的Rho-GTPase信号调节营养过剩期间的新生脂质生成，而免疫相关GTPase触发脂噬并防止肝脂质储存。然而，关于GTPase调节在人类肝脏中作用的证据有限，特别是在肝纤维化启动和进展的背景下，需要彻底的机制调查以确定因果关系。
近年来，双组学和多组学策略在MASLD研究中逐渐出现。从EU队列的肝脏RNA测序数据和循环蛋白质组构建的蛋白质-转录组图谱确定了四个有希望的蛋白质生物标志物。其中，AKR1B10也在我们的研究中被确定为与脂质代谢相关的关键基因，与脂肪变性和纤维化均显示出强烈关联（图3A），这突显了其作为早期MASLD生物标志物的潜力。此外，我们观察到与肝纤维化进展相关的线粒体功能障碍（图4A）。与我们的发现一致，一项针对肥胖MASLD个体的多组学研究也在肝脏蛋白质水平上揭示了线粒体功能障碍。该研究进一步强调了脂肪组织中类似的线粒体紊乱，表明肥胖相关MASLD中的肝-脂肪组织相互作用。除了组织间相互作用外，Raverdy等人报道了MASLD分子特征的异质性，与不同程度的心血管风险和2型糖尿病相关。这进一步突显了系统性代谢状况对MASLD进展的影响。在我们对糖尿病个体的分析中，我们确定了更多与纤维化相关的下调代谢基因，支持胰岛素抵抗可能加剧代谢功能障碍并干扰疾病轨迹的观点。
总体而言，我们的整合调查提供了肥胖个体中早期MASLD最详细的分子图景之一，全面描述了脂肪肝中纤维化启动相关的早期肝脏代谢重塑。
研究局限性
本研究聚焦于109名早期MASLD患者，可能忽略了与后期疾病阶段相关的分子变化。为了解决这个问题，我们与两个外部队列（EU和VA）进行了交叉参考。此外，我们确定了GTPase相关基因作为逆转肝纤维化的未来潜在靶点。虽然已在不同系统中进行了初步验证，但需要进一步调查以确认特定GTPases在纤维化启动中的因果作用，特别是在HSCs中，并阐明GTPase信号如何在整个MASLD进展过程中促进胶原蛋白产生。
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