摘要
引言
阿尔茨海默病(AD)中常见脑血管损伤，但其与β-淀粉样蛋白(Aβ)和tau蛋白病理以及认知衰退的时间关系仍不明确。
方法
我们测量了75名阿尔茨海默病神经影像倡议(ADNI)研究参与者的脑脊液(CSF)和血清中基线血管标志物水平，这些参与者被分为认知正常(CU)、轻度认知障碍(MCI)和AD组(n=25/组)，并研究了其与疾病病理(脑脊液和正电子发射断层扫描[PET]β-淀粉样蛋白[Aβ]和tau)及认知功能(临床痴呆评定量表[CDR]、蒙特利尔认知评估、简易精神状态检查和阿尔茨海默病评估量表)的关联。
结果
阿尔茨海默病患者中，脑脊液内皮细胞(胎盘生长因子、血管生成素2、血管紧张素转换酶-1[ACE-1])和周细胞(可溶性血小板衍生生长因子受体β[sPDGFRβ])损伤标志物水平升高。大多数标志物在CDR 0.5组中也高于CDR 0组，并与CU和MCI组中的脑脊液tau蛋白和认知功能障碍相关，特别是在PET Aβ阳性(Aβ+)参与者中。血清sPDGFRβ、酪氨酸激酶与免疫球蛋白和表皮生长因子同源结构域-2(TIE-2)和ACE-1与脑脊液测量值相关。
讨论
脑血管损伤先于痴呆的发展，并且特别是在PET Aβ+个体中，与脑脊液tau蛋白和认知衰退密切相关。
研究亮点
- 我们测量了ADNI研究中CU、MCI和AD参与者基线时血清和脑脊液中多种神经血管损伤标志物的水平，并研究了其与脑脊液和PET疾病病理标志物以及认知衰退的关联。
- 神经血管损伤的脑脊液标志物，特别是胎盘生长因子(PlGF)，在阿尔茨海默病的非常早期阶段(包括MCI和PET Aβ+认知正常个体)升高。这些标志物水平与脑脊液总tau蛋白(t-tau)、磷酸化tau蛋白(p-tau)和认知衰退密切相关。
- 血清中仅少数神经血管标志物的水平与脑脊液中水平相关：sPDGFRβ、TIE-2和ACE-1。
1 背景
阿尔茨海默病(AD)的特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块和神经原纤维缠结病理，但脑血管病理，包括散发性脑淀粉样血管病(综述见Greenberg等人)和脑小血管病(综述见Kim等人)，也经常存在。疾病建模表明，血管功能障碍先于Aβ沉积和tau蛋白病理，并且可能在临床症状出现前20年就已发生。脑血流量减少(综述见Korte等人)和血脑屏障(BBB)渗漏(综述见Barisano等人)在AD早期先于并预测认知衰退。神经病理学研究提供了证据，表明AD神经病理学改变(ADNC)伴随着反映广泛脑氧合减少的生化变化，这与内皮素-1(一种强效血管收缩剂)水平升高、周细胞变性和BBB渗漏相关。最近对人类死后脑组织微血管富集样本的单核RNA研究发现，全基因组关联研究(GWAS)相关的AD风险基因不仅在小胶质细胞中富集，还在内皮细胞中富集，并且AD中内皮细胞和周细胞基因表达失调。这些研究共同证明了脑血管功能障碍与疾病发病机制之间存在双向关系，这是AD的核心病理特征。
脑血管功能障碍、ADNC和认知衰退之间的时间关系仍不明确。在早期AD(即临床痴呆评定量表[CDR]=0.5)中报告了海马中的BBB渗漏，这独立于Aβ和tau蛋白病理。脑脊液内皮损伤标志物(如细胞间粘附分子1[ICAM-1]、血管细胞粘附分子1[VCAM-1]和胎盘生长因子[PlGF])水平与皮质变薄和认知衰退强烈相关，这些关系在PET Aβ阳性(Aβ+)参与者中更为明显。主要来源于脑内内皮细胞的脑脊液血管紧张素转换酶-1(ACE-1)在AD中升高。在腰椎脑脊液中，来自受损周细胞的可溶性血小板衍生生长因子受体β(sPDGFRβ)水平在AD中更高，并与脑脊液tau蛋白水平强烈相关。脑脊液sPDGFRβ在痴呆发展前升高，特别是在进行性轻度认知障碍(MCI)人群中，并与简易精神状态检查(MMSE)评分的后续变化相关。脑脊液sPDGFRβ也与BBB渗漏标志物(通过Qalb评估)、对比增强磁共振成像(MRI)以及神经炎症和神经元损伤标志物相关。血管生成素-2(ANGPT2)是一种与血管不稳定性相关的ANGPT/TIE信号通路中的诱饵激动剂，在MCI中升高，与脑脊液磷酸化tau蛋白(p-tau)水平以及BBB渗漏、神经炎症和神经元损伤标志物强烈相关。
脑脊液sPDGFRβ水平在MCI和AD中升高，并与整个AD谱系中的脑脊液总tau蛋白(t-tau)和p-tau水平以及Qalb相关。同样，脑脊液内皮损伤标志物，包括ICAM-1和VCAM-1，在前驱期AD中与脑脊液tau蛋白、皮质变薄和认知衰退相关。最近一项研究发现，脑脊液血管生成标志物与脑脊液p-tau181水平、皮质厚度和认知衰退特别相关。我们先前表明，健康捐赠者血清中的sPDGFRβ水平与来自同一捐赠者的匹配脑脊液样本中的水平呈正相关；血清和脑脊液ANGPT2水平也呈正相关，血清ANGPT2与Qalb相关。促血管生成细胞因子PlGF在MCI和AD中均升高。PlGF通过血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)介导多种细胞过程，并可将血管内皮生长因子A(VEGF-A)从VEGFR1中置换出来，以增强经典的VEGFR2介导的血管生成。
在本研究中，我们检查了来自ADNI研究中一部分参与者(包括认知正常或患有MCI或AD)的配对脑脊液和血清样本中内皮细胞和周细胞损伤及BBB渗漏的标志物水平，这些标志物如何随AD相关神经病理学改变(ADNC)和认知功能的变化而变化。我们探讨了脑血管损伤在AD早期阶段就很明显并密切与ADNC和认知衰退相关的假设。我们还研究了血清中血管损伤标志物水平的改变是否反映了匹配脑脊液样本中的变化。我们的研究进一步证明，神经血管标志物的脑脊液水平改变与Aβ+个体中的BBB渗漏、tau变化和认知衰退密切相关。血清中大多数血管损伤标志物的水平通常不反映脑脊液中的水平；然而，血清sPDGFRβ、TIE-2和ANGPT2与ADNC、BBB渗漏和记忆标志物呈弱相关。
2 方法
2.1 研究队列
从ADNI研究的75名参与者中获取基线脑脊液和血清，这些参与者被分为认知正常(CU)对照组、MCI和AD组(n=25/组)。基线脑脊液：Aβ1-42、Aβ1-40、总tau和p-tau水平以及影像学生物标志物：PET-Aβ(百位点)和PET-tau(内嗅皮层标准化摄取值比[SUVR])来自ADNI研究。AD病例根据AD病理脑脊液标志物的既定临界值选择：总tau > 400 pg/mL，p-tau > 60 pg/mL，Aβ1-42 < 550 pg/mL，根据Hansson等人。MCI病例基于MCI-AD临床诊断和中间脑脊液Aβ和tau水平选择。CU对照组无痴呆临床诊断，脑脊液Aβ和tau水平在正常范围内。表1总结了三个诊断组的基线年龄、性别、APOE ε4携带者状态以及平均脑脊液Aβ1-40、Aβ1-42、总tau和p-tau浓度，以及PET Aβ和tau水平。所有参与者都接受了详细的认知评估，包括记忆临床痴呆评定量表(CDR-M)、总体(CDR-G)和总和(CDR-SB)；蒙特利尔认知评估(MoCA)；简易精神状态检查(MMSE)；阿尔茨海默病评估量表-认知分量表(ADAS-COG)和扩展ADAS-COG-13。基线认知评估得分来自ADNI研究。
表1. 研究队列的人口统计学、病理和认知特征总结
人口统计学 | CU | MCI | AD | p值
-- - | --- | --- | --- | ---
数量 | 25 | 25 | 25 | —
年龄 | 69.5 ± 5.3 | 71.7 ± 6.9 | 73.0 ± 9.1 | 0.23
男性:女性 | 10:15 | 13:12 | 15:10 | NS
APOE ε4携带者，n (%) | 2/25 (8) | 14 (56) | 18 (72) | p < 0.0001
病理标志物 | CU | MCI | AD |
-- - | --- | --- | --- |
脑脊液Aβ1-40 (pg/mL) | 17,549.6 ± 4493.0 | 18,240.0 ± 5179.9 | 18,880.8 ± 5336.7 | NS
脑脊液Aβ42 (pg/mL) | 1514.6 ± 574.2 | 964.8 ± 488.2 | 580.5 ± 179.4 | p < 0.0001
脑脊液总tau (pg/mL) | 183.1 ± 37.4 | 274.1 ± 73.6 | 405.6 ± 117.2 | p < 0.0001
脑脊液p-tau (pg/mL) | 15.3 ± 2.9 | 26.4 ± 9.9 | 43.7 ± 16.5 | p < 0.0001
PET Aβ+ | 0/24 | 18/25 | 25/25 | p < 0.0001
PET Aβ (百位点) | 1.9 ± 8.9 | 48.2 ± 37.6 | 107.5 ± 30.4 | p < 0.0001
PET-tau (SUVR) | 1.1 ± 0.2 | 1.29 ± 0.1 | 1.6 ± 0.1 | p < 0.0001
认知评估 | CU | MCI | AD |
-- - | --- | --- | --- |
CDR-M (0: 0.5: 1-2) | 24:01:00 | 10:14:01 | 02:11:12 | p < 0.0001
CDR-G (0: 0.5: 1-2) | 24:01:00 | 10:14:01 | 02:17:06 | p < 0.0001
CDR-SBR (均值 ± 标准差) | 0.0 ± 0.2 | 1.0 ± 1.4 | 2.8 ± 2.0 | p < 0.0001
MoCA (均值 ± 标准差) | 26.3 ± 2.5 | 23.8 ± 4.6 | 19.0 ± 4.8 | p < 0.0001
MMSE (均值 ± 标准差) | 29.3 ± 1.0 | 28.6 ± 1.7 | 23.8 ± 3.7 | p < 0.0001
ADAS-COG (均值 ± 标准差) | 4.9 ± 1.8 | 8.2 ± 5.8 | 16.8 ± 9.5 | p < 0.0001
ADAS-13 (均值 ± 标准差) | 7.1 ± 2.8 | 13.2 ± 8.7 | 25.7 ± 12.7 | p < 0.0001
缩写：Aβ, β-淀粉样蛋白；AD, 阿尔茨海默病；ADAS, 阿尔茨海默病评估量表-认知分量表；APOE, 载脂蛋白E；CDR-M, 临床痴呆评定记忆；CDR-G, CDR总体；CSF, 脑脊液；CU, 认知正常；MCI, 轻度认知障碍；MMSE, 简易精神状态检查；MoCA, 蒙特利尔认知评估；PET, 正电子发射断层扫描；SD, 标准差；SUVR, 标准化摄取值比。
为准备本文所用数据来自ADNI数据库(adni.loni.usc.edu)。ADNI于2003年作为公私合作伙伴关系启动，由首席研究员Michael W. Weiner博士领导。ADNI的主要目标是测试序列MRI、PET、其他生物标志物以及临床和神经心理学评估是否可以结合使用来衡量MCI和早期AD的进展。
研究背景
- 系统综述：最近研究表明，脑脊液甚至可能血清中的内皮和周细胞损伤标志物在AD早期与BBB渗漏和tau蛋白病理相关。我们分析了ADNI研究中CU、MCI和AD参与者脑脊液和血清神经血管标志物与认知、Aβ和tau的关系。
- 解释：内皮(PlGF、ANGPT2、ACE-1)和周细胞(sPDGFRβ)损伤的脑脊液标志物在MCI和PET Aβ+ CU参与者中，在痴呆发展前升高，并与脑脊液tau蛋白和认知衰退相关。只有少数血清标志物的水平与脑脊液中的测量值相关，但其中一些与BBB渗漏、疾病病理和认知衰退呈弱相关。
- 未来方向：需要纵向研究来阐明脑血管损伤的时间与大脑Aβ和tau变化的关系，特别是在高风险CU个体中。
2.2 sPDGFRβ ELISA
使用夹心ELISA(Invitrogen目录号：EHPDGFRB，Thermo Fisher Scientific，英国)测量脑脊液和血清中sPDGFRβ浓度。脑脊液样本(100 µL未稀释)和血清(在试剂盒提供的专用稀释缓冲液中稀释1:10)以复孔测量。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech，Aylesbury，英国)中读取450 nM处的吸光度。数据表中报告的重现性表明批间变异系数(CV) < 12%，批内CV < 10%，血清、血浆和细胞培养基的加标回收率为90%-110%。通过与重组sPDGFRβ(18,000-24 pg/mL)系列稀释的标准曲线插值计算样本中的sPDGFRβ浓度。
2.3 血管生成素-2 (ANGPT2) ELISA
使用ELISA(Quantikine试剂盒，R&D Systems，英国)测量脑脊液和血清中ANGPT-2浓度。脑脊液稀释两倍，血清稀释五倍于试剂盒提供的专用稀释缓冲液中。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nm处的吸光度。测量以复孔进行，ANGPT-2浓度通过与重组ANGPT-2(3000-23.5 pg/mL)系列稀释生成的标准曲线插值得出。
2.4 TIE-2 ELISA
使用DuoSet Human TIE-2 ELISA(R&D Systems，英国)按照制造商指南测量TIE-2浓度。血清样本在1% PBS:BSA中稀释1:50。脑脊液样本直接使用。标准品、样本和空白(1% PBS:BSA)以复孔添加。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nM处的吸光度。TIE-2浓度通过从重组TIE-2(1000-156.25 pg/ml)两倍系列稀释获得的标准曲线插值得出。
2.5 白蛋白ELISA
使用夹心ELISA(目录号：108788)(Abcam，剑桥，英国)测量脑脊液和血清中白蛋白浓度。脑脊液样本稀释1:2000，血清样本稀释1:500,000于试剂盒提供的专用稀释缓冲液中。标准品、样本和空白以复孔添加。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nM处的吸光度。白蛋白浓度通过与重组人白蛋白(200-3.125 ng/mL)系列稀释生成的标准曲线插值得出。
2.6 胎盘生长因子(PlGF)酶联免疫吸附测定(ELISA)
根据制造商指南，使用高灵敏度ELISA(Quantikine试剂盒，R&D Systems，英国)测量脑脊液和血清中PlGF浓度。脑脊液样本稀释1:4，血清稀释1:2于试剂盒提供的专用稀释缓冲液中。标准品、样本和空白以复孔添加。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nM处的吸光度。PlGF浓度通过与重组PLGF(200-3.125 pg/mL)系列稀释获得的标准曲线插值得出。提供复孔测量的平均值。
2.7 VEGF-A ELISA
根据制造商指南，使用DuoSet VEGF-A ELISA试剂盒(R&D Systems，英国)测量血清中VEGF-A浓度。血清样本在1% PBS:BSA中稀释1:4。标准品、样本和空白以复孔添加。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nM处的吸光度。VEGF-A浓度通过与试剂盒提供的重组VEGF-A(2000-31.25 pg/mL)系列稀释获得的标准曲线插值得出。提供复孔测量的平均值。
2.8 VCAM-1 ELISA
根据制造商指南，使用DuoSet VCAM1 ELISA试剂盒(R&D Systems，英国)测量脑脊液和血清中VCAM-1浓度。血清样本稀释1:1000，脑脊液稀释1:4于1% PBS:BSA中。标准品、样本和空白以复孔添加。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取450 nM处的吸光度。VCAM1浓度通过与试剂盒提供的重组VCAM1(1000-15.625 pg/mL)系列稀释获得的标准曲线插值得出。提供复孔测量的平均值。
2.9 ACE-1酶活性测定
如先前所述，使用荧光活性测定法测量脑脊液和血清中ACE-1酶活性。血清稀释1:10，脑脊液稀释1:5，与ACE1特异性FRET肽底物(10 µM)(Abz-FRK(Dnp)-P)(Biomol International，Exeter，英国)在黑暗中于26°C孵育2.5小时，同时加入和不加入卡托普利。在FLUOstar VANTI板读数仪(BMG Labtech)中读取320 nm激发和405 nm发射处的荧光。标准品、样本和空白以复孔运行，ACE-1活性通过从未经处理的孔中减去卡托普利抑制孔中的荧光信号来确定。每块板上都包含重组人ACE-1(1000-31.1 ng/mL)(R&D Systems，英国)的系列稀释，以保持板间一致性。ACE-1活性表示为相对荧光单位(r.f.u.)。
2.10 统计分析
每个标志物在两个ELISA板上独立测量，两次测定在不同日期进行，并计算平均值。使用SPSS生成的箱线图和Q-Q图目视检查每个数据集的分布，并移除极端异常值。使用Dunnet多重比较校正的独立单因素方差分析(ANOVA)比较每个病理和血管标志物的均值。使用SPSS计算皮尔逊相关系数，以探索脑脊液和血清血管标志物与BBB渗漏、ADNC和认知标志物之间的关系。显示相关系数和p值。
3 结果
3.1 研究队列的人口统计学、病理和临床特征
从ADNI研究的75名参与者中收集基线脑脊液和血清样本(表1；有关每个参与者的更详细信息，请参见表S1)。病例根据临床诊断和已建立的脑脊液Aβ和tau临界值分为以下三组：CU对照组、MCI和AD(n=25/组)。基线时参与者的年龄在各组之间没有差异，性别比例也没有差异。MCI和AD中的APOE ε4携带者比CU对照组更常见(独立单因素方差分析，p < 0.0001)。脑脊液总tau、p-tau和Aβ1-42(但不是Aβ1-40)水平在各组之间存在差异(独立单因素方差分析，p < 0.0001)。PET Aβ+参与者比例(p < 0.0001)，以及PET Aβ百位点和PET内嗅皮层tau SUVR(两者p < 0.0001)在各组之间显著不同。CDR-M和CDR-G评分、CDR-SB、MoCA、MMSE、ADAS-总分和ADAS-13评分也存在显著的组间差异(所有p < 0.0001)。研究队列的人口统计学、病理和临床特征总结在表1中，并在表S1中详细显示。
3.2 脑脊液神经血管损伤标志物与早期AD中脑脊液Aβ1-40和tau相关
脑脊液中几种神经血管标志物的水平在MCI和AD中往往高于CU对照组。独立单因素方差分析显示，PlGF(η² = 0.23, p = 0.0001)、ANGPT2(η² = 0.11, p = 0.014)和ACE-1(η² = 0.12, p = 0.016)存在显著的组间差异，效应量中等至较大(η² > 0.06)，而sPDGFRβ接近显著(η² = 0.08, p = 0.056)，但VCAM1或TIE-2则无(图1A)。事后比较显示，ANGPT2(p < 0.01)、PlGF(p < 0.0001)和ACE-1酶活性(p < 0.01)在AD中高于对照组，而sPDGFRβ在MCI与对照组(p = 0.06)和AD与对照组(p = 0.07)之间接近显著。
我们研究了整个队列中脑脊液神经血管标志物与脑脊液和PET成像ADNC标志物之间的关系，如图1B中的热图所示。所有血管标志物与脑脊液总tau和p-tau呈正相关，除PlGF外，所有标志物与脑脊液Aβ1-40呈正相关。PlGF与脑脊液Aβ1-42呈负相关，与PET Aβ和PET tau呈正相关。脑脊液ANGPT2也与PET Aβ呈正相关。
我们接下来研究了各个诊断组内的相关性，如图1C中的热图所示。相关系数和p值显示在表S2中。脑脊液sPDGFRβ在MCI中与总tau(r = 0.75, p < 0.0001)和p-tau(r = 0.70, p < 0.0001)强烈相关，在AD中与Aβ1-40(r = 0.76, p < 0.0001)和Aβ1-42(r = 0.58, p = 0.002)以及总tau(r = 0.54, p = 0.01)和p-tau(r = 0.42, p = 0.04)强烈相关。
ANGPT2在对照组中与脑脊液Aβ1-40(r = 0.55, p = 0.004)、Aβ1-42(r = 0.52, p = 0.008)、总tau(r = 0.53, p = 0.007)和p-tau(r = 0.49, p = 0.014)呈正相关。在MCI中，相关性较弱，ANGPT2与Aβ1-42不相关。在AD中未观察到显著相关性。与ANGPT2一样，TIE-2在CU对照组中与Aβ1-42、Aβ1-40、总tau和p-tau呈正相关。在MCI中，与总tau(r = 0.66, p < 0.0001)和p-tau(r = 0.59, p = 0.002)的相关性更强，而与Aβ1-40和Aβ1-42的相关性不显著。在AD中，TIE-2仅与Aβ1-40相关。
脑脊液VCAM-1仅与脑脊液总tau和p-tau呈正相关，在CU对照组中接近显著相关于脑脊液Aβ1-40和Aβ1-42。在MCI中，脑脊液VCAM-1与总tau(r = 0.65, p < 0.001)、p-tau(r = 0.60, p < 0.01)和Aβ1-40(r = 0.43, p = 0.03)强烈相关。在AD中，脑脊液VCAM-1与Aβ1-40(r = 0.55, p = 0.01)和总tau(r = 0.47, p = 0.02)相关。
3.3 脑脊液血管损伤标志物在PET Aβ+个体中与脑脊液tau的相关性更强
整个队列中脑脊液sPDGFRβ与Aβ1-40和总tau之间的相关性在PET Aβ+个体中更强(图2A-B)，脑脊液PlGF与总tau/p-tau之间的相关性也是如此(图2C-D)。相反，ANGPT2与脑脊液Aβ1-40和Aβ1-42之间的相关性在PET Aβ阴性(Aβ−)组中更强。根据PET Aβ状态分层的组中所有脑脊液神经血管标志物的相关系数和p值显示在表S3中。
脑脊液ANGPT2(η² = 0.058, p = 0.04)和PlGF(η² = 0.139, p = 0.0013)在PET Aβ+个体中高于PET Aβ−个体(图3A-B)。sPDGFRβ水平和ACE-1活性在PET Aβ+个体中也数值上更高，但均无显著差异(图3C,D)。VCAM-1和TIE-2保持不变。与PET Aβ状态相关的每个脑脊液标志物的均值、标准差(SD)和p值显示在表S4中。
3.4 血清血管标志物水平与ADNC相关性差
在同一捐赠者基线时测量了血清中的相同标志物组，包括VEGF-A。血清标志物水平在诊断组之间没有显著差异(图S1)，通常不与脑脊液或成像ADNC标志物相关(表S5)。例外的是血清ANGPT2，在整个队列中与Aβ1-40呈正相关(r = 0.29, p = 0.013)，在AD亚组中与Aβ1-40(r = 0.40, p = 0.046)和Aβ1-42(r = 0.41, p = 0.042)呈弱正相关。血清TIE-2在AD中与脑脊液总tau呈弱正相关(r = 0.42, p = 0.037)，并与p-tau和Aβ1-42接近显著。血清sPDGFRβ仅在MCI中与脑脊液Aβ1-42呈正相关(r = 0.5, p = 0.015)。
3.5 脑脊液神经血管损伤标志物PlGF和ANGPT2与认知衰退相关
队列根据CDR-M状态分为CDR 0、CDR 0.5和CDR 1-2亚组。独立单因素方差分析表明，在所有脑脊液标志物中，ANGPT2(η² = 0.10, p = 0.026)和PlGF(η² = 0.15, p = 0.0026)根据CDR显著改变。多重比较测试显示，脑脊液PlGF和ANGPT2水平在CDR 0.5中高于CDR 0(两者p < 0.05)(图4A)。脑脊液PlGF在CDR 1-2中也高于CDR 0(p < 0.01)。
我们接下来研究了脑脊液标志物与基线记忆评分的关系。脑脊液PlGF与所有三个CDR领域以及ADAS-总分和ADAS-13评分呈正相关，与MoCA呈负相关，并接近显著相关于MMSE(图4B)。脑脊液ANGPT2也发现了一组类似但较弱的相关性。未观察到其他脑脊液标志物的显著相关性。脑脊液标志物的相关系数和p值总结在表S6中。包括VEGF-A在内的相同蛋白质组的血清水平与认知评分不相关。血清标志物的相关系数和p值总结在表S7中。
3.6 BBB渗漏标志物与Aβ病理和认知衰退相关，在Aβ+个体中更高
脑脊液白蛋白水平在CU、MCI和AD之间(η² = 0.13, p = 0.0063)以及根据CDR(η² = 0.17, p = 0.0010)显著不同。多重比较分析显示，AD中的脑脊液白蛋白高于CU对照组(p < 0.01)，CDR 0.5(p < 0.01)和CDR 1-2(p < 0.01)中的水平高于CDR 0(图5A,B)。Qalb在诊断组之间(η² = 0.20, p = 0.0005)以及根据CDR(η² = 0.11, p = 0.017)显著不同，并且AD中高于对照组(p < 0.01)，CDR 1-2中高于CDR 0(p < 0.01)(图5C-D)。脑脊液白蛋白和Qalb在PET Aβ+个体中高于PET Aβ−个体(两者p < 0.05)(图5E,F)。
在整个队列中，脑脊液白蛋白和Qalb与PET Aβ呈正相关，与脑脊液Aβ1-42呈负相关。脑脊液白蛋白与脑脊液总tau(r = 0.307 p = 0.007)和p-tau(r = 0.326, p = 0.004)呈正相关，但与QAlb的关系未达到统计学显著性。相关系数和p值显示在表S8A中。脑脊液白蛋白和Qalb与CDR评分呈正相关，与MoCA和MMSE呈负相关。只有脑脊液白蛋白与ADAS-总分和ADAS-13呈正相关。脑脊液白蛋白和Qalb与认知状态的关系显示在表S8B中。
脑脊液白蛋白和QAlb与脑脊液PlGF呈正相关(r = 0.44, p < 0.0001和r = 0.54, p < 0.0001)(图6)。在整个队列中，脑脊液白蛋白也与脑脊液ANGPT2呈正相关(r = 0.346, p = 0.002)，与PDGFRβ的相关性接近显著(r = 0.223, p = 0.059)(表S9)。脑脊液PlGF在MCI中与脑脊液白蛋白(r = 0.529, p = 0.007)和在AD中与Qalb(r = 0.552, p = 0.006)呈正相关(表S9)。血清TIE-2与脑脊液白蛋白呈负相关，并与Qalb呈负相关，接近显著。然而，其他血清标志物不随BBB渗漏标志物变化(表S10)。
在PET Aβ+和Aβ−组中，Qalb和脑脊液白蛋白与AD病理、认知以及脑脊液和血清神经血管损伤标志物之间关系的相关系数和p值显示在表S11中。在PET Aβ+个体中，Qalb和脑脊液白蛋白均与脑脊液PlGF相关。脑脊液白蛋白也与ANGPT2相关。在PET Aβ−个体中，脑脊液白蛋白与sPDGFRβ相关。
3.7 神经血管标志物在脑脊液中密切相关，但在血清中不相关
脑脊液中不同血管损伤标志物(sPDGFRβ、ANGPT2、PlGF、VCAM-1、TIE-2和ACE-1活性)之间存在多种正相关(图7A)。血清中的显著相互关系较少且较弱(图7B)。脑脊液中的sPDGFRβ、TIE-2和ACE-1活性水平与匹配血清样本中的水平呈正相关(图7C)。相关系数、n数和p值显示在表S12中。
4 讨论
本研究的结果证实了先前的研究，表明升高的脑脊液神经血管损伤标志物与BBB渗漏、tau病理和认知衰退标志物密切相关。这些关系从AD的无症状阶段开始，在PET Aβ+个体中更强。脑脊液PlGF、ANGPT2和sPDGFRβ水平从AD早期阶段(即CDR 0.5)升高，并与脑脊液Aβ1-40、总tau、p-tau和跨多个领域的认知衰退强烈相关：CDR、MoCA、MMSE和ADAS。PlGF与Qalb(一种BBB渗漏标志物)特别强烈相关。数据支持先前的证据，表明神经血管损伤、tau病理和认知衰退之间的密切关系与AD无症状阶段开始的BBB渗漏相关。相同标志物组的血清水平通常不反映脑脊液中的发现，与疾病病理或认知基本无关，除了血清ANGPT2和TIE-2与病理或认知衰退的弱相关，这值得在更大独立队列中进一步研究。
本研究中包含的所有脑脊液神经血管损伤标志物均与脑脊液总tau和p-tau相关。这建立在先前的发现基础上，包括我们自己的发现，表明脑脊液周细胞标志物sPDGFRβ和脑脊液内皮损伤(包括VEGF-A、ICAM-1、VCAM-1、ANGPT2和钙粘蛋白)水平在早期AD中与脑脊液总tau和p-tau相关。在本研究中，脑脊液sPDGFRβ和PlGF在PET Aβ+个体中与脑脊液tau的相关性更强。先前报道了脑脊液内皮标志物VEGF-A、ICAM-1和VCAM-1与脑脊液tau，以及脑脊液sPDGFRβ和tau在PET Aβ+个体中更强的关系。最近一项研究表明，脑脊液p-tau水平与一组血管生成标志物强烈相关，表明血管重塑和tau密切相关。tau低聚体在死后AD脑组织中积累在内皮细胞内，并在tau蛋白病小鼠模型(P301S)中驱动微管不稳定，与内皮细胞衰老的诱导相关。纤维状tau使内皮细胞代谢转向糖酵解，在年轻P301S小鼠中诱导炎症和BBB渗漏。这些数据共同表明，血管损伤和tau病理密切相关，从AD早期阶段开始，特别是在Aβ+个体中，即处于AD通路上。血管损伤与tau变化映射的相关性在于，tau低聚体和缠结与AD中认知衰退的开始比Aβ更密切相关。中介分析揭示神经炎症介导了sPDGFRβ与突触重塑和神经退行性变标志物之间的关联。我们先前表明，脑脊液ANGPT2也与脑脊液神经炎症(YKL-40和TREM-2)和神经退行性变(总tau和α-突触核蛋白)标志物强烈相关，表明涉及类似的通路。
我们在CU、MCI和AD组中的组内分析表明，脑脊液血管损伤标志物与AD病理之间的关系根据疾病阶段而不同。脑脊液sPDGFRβ在MCI中与总tau和p-tau的相关性最强，这一发现与最近的其他研究一致。在AD中，脑脊液sPDGFRβ也与脑脊液Aβ1-40和Aβ1-42强烈相关。Lv等人还报道，脑脊液sPDGFRβ在CDR 0.5个体中与脑脊液总tau和p-tau相关，并且在CDR 1-2中还与脑脊液tau和Aβ1-42相关。AD中升高的脑脊液sPDGFRβ被认为反映了对Aβ和tau的反应中，周细胞上细胞表面PDGFRβ的ADAM-10介导脱落，这已在体外和体内得到证实。Aβ、tau和其他未识别的周细胞变性诱因的相对贡献可能在MCI和已建立的AD中不同。
ANGPT/TIE信号通路调节血管和BBB稳定性——先前报道了AD中基因ANGPT2表达升高和脑脊液ANGPT2水平升高。在本研究中，脑脊液ANGPT2和可溶性TIE-2在CU和MCI中与脑脊液tau强烈相关，但在AD中不相关。我们先前表明脑脊液ANGPT2在MCI中升高。在本研究中，我们同样发现ANGPT2水平在CDR 0.5中高于CDR 0。与sPDGFRβ和PlGF不同，脑脊液ANGPT2在PET Aβ−个体中与总tau和p-tau的相关性更强。这些发现可能表明，ANGPT2/TIE信号的改变独立于Aβ积累发生，或与tau病理更密切相关。先前的一项研究报道，CDR 0.5中脑脊液sPDGFRβ水平升高独立于Aβ和tau病理，表明在病理条件下，血管受体和标志物的切割或分泌由Aβ和tau无关的通路负责。
在我们研究的神经血管标志物组中，PlGF在AD中最显著升高，并且这种增加从CDR 0.5(即早期疾病阶段)就很明显。与其他标志物一样，脑脊液PlGF与脑脊液总tau和p-tau相关，但独特的是，脑脊液PlGF水平也与脑脊液Aβ1-42呈负相关，与PET Aβ和PET-tau呈正相关。PlGF水平在PET Aβ+个体中升高，并且脑脊液PlGF与脑脊液tau之间的相关性强度受Aβ状态影响。脑脊液PlGF还与Qalb(BBB渗漏的测量)和所有领域的认知评估强烈相关。这些发现可能表明，额外的因素(如BBB渗漏)介导了AD中PlGF与认知衰退之间的关系。这与报道的血管性痴呆(VaD)、帕金森病和额颞叶痴呆(FTD)以及AD中脑脊液PlGF升高一致。升高的脑脊液PlGF与白质高信号(WMH)体积增加相关，独立于CU和MCI中的Aβ状态。这些发现表明，血管对BBB渗漏和认知衰退的贡献可能在AD中独立于Aβ和tau病理发生。
Qalb是BBB完整性的金标准测量，在AD中升高，在PET Aβ+个体中显著更高。Qalb与较低的脑脊液Aβ1-42和较高的PET Aβ水平相关，而与PET-tau的关联未达到显著性。这些发现与其他证据一致，表明Aβ和tau导致BBB渗漏。Qalb在导致痴呆的其他疾病(包括路易体痴呆、VaD和FTD)以及2型糖尿病中也升高。脑脊液内皮损伤标志物(如VEGF-A、ICAM-1和VCAM-1)与升高的Qalb相关，在其他痴呆相关疾病中也升高，表明这些变化可能不是AD特异性的。脑脊液sPDGFRβ也被证明与MCI-AD中的Qalb相关，尽管我们在本研究中没有复制这一点，在本研究中，脑脊液PlGF是唯一与Qalb相关的标志物。脑脊液标志物无法提供关于BBB完整性脑区域差异的见解，可能不足以检测限于特定脑区域的BBB渗漏，例如通过高对比度MRI在CDR 0.5个体中检测到的海马BBB破裂。
神经血管损伤的外周标志物将提供一种非侵入性、成本较低的替代脑脊液腰椎穿刺的方法。最近的一项纵向研究表明，在具有脑Aβ的人群中，认知加速下降与较低的血浆VEGF-A和较高的PlGF相关，后者又与新皮质tau的加速积累相关。血浆和血清PlGF水平也与AD中的脑血管损伤和WMH严重程度相关。在本研究中，测试的大多数神经血管标志物的血清水平，包括VEGF-A和PlGF，与其脑脊液对应物或ADNC和认知衰退标志物没有强烈相关。这可能是由于多种因素，包括脑：脑脊液、脑脊液：血清和BBB通透性/运输的差异；血清神经血管标志物的颅外贡献；以及它们的稳定性、细胞相互作用和外周代谢。
观察到血清ANGPT-2和Tie-2与ADNC之间的弱但显著相关性：血清ANGPT2与脑脊液Aβ1-40呈正相关，血清TIE-2与AD中的脑脊液总tau呈正相关。血清TIE-2也与BBB渗漏标志物呈负相关——Qalb和脑脊液白蛋白。血清和脑脊液PDGFRβ水平呈正相关，支持我们在健康志愿者匹配脑脊液和血清中的先前观察。血清和脑脊液Tie-2和ACE-1活性也呈正相关。这些弱相关性可能反映了某些神经血管标志物直接释放到脑脊液中，也直接通过受损BBB释放到血液中。尽管当前数据主要反映CSF和血清中神经血管标志物之间的有限关联，但需要更大规模的独立研究来排除一些较弱但显著的发现，这些发现表明外周ANGPT/TIE和sPDGFRβ信号标志物与ADNC、BBB渗漏和认知衰退之间存在潜在联系。
本研究的主要局限性是其横断面设计和相对较小的队列规模，这限制了我们探索神经血管损伤基线标志物(在脑脊液和血清中)与ADNC和认知标志物之间关系的能力。需要后续研究在更大规模的纵向研究中探索因果关系，以阐明疾病病理、不同的脑脊液神经血管标志物和认知变化之间的时间关系，并确认血清标志物与神经血管功能和疾病之间一些较弱关系的有效性。尽管有这些局限性，本研究为进一步证据提供了支持，即血管功能障碍和BBB渗漏的脑脊液标志物与tau病理和认知衰退的发展密切相关，特别是在Aβ+个体中，从疾病的非常早期阶段开始。该研究还强调PlGF是认知衰退相关的脑血管损伤和BBB破裂的介质和潜在生物标志物，从AD发展的早期开始。需要更大规模的独立研究来确认神经血管损伤血清标志物一些较弱关系的有效性。
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