摘要
纤维化以不适当的伤口愈合并导致过量纤维结缔组织积聚为特征，特别是细胞外基质(ECM)中的积聚。这种情况可能发生在多个器官中，最终导致器官衰竭。尽管纤维化负担很高，但治疗选择只能延缓疾病进展。因此，我们利用公开可用的蛋白质组学数据，研究了不同器官（心脏、肝脏）中是否存在共同的纤维化蛋白特征和差异调节通路，以定义与纤维化相关的潜在核心变化。我们在心脏纤维化中识别出124个显著差异表达的蛋白，在早期对轻度肝纤维化中识别出4个蛋白，在轻度对重度肝纤维化中识别出135个蛋白，在早期对重度肝纤维化中识别出160个蛋白。对这些蛋白组的功能注释显示ECM蛋白一致上调，而与线粒体活性相关的蛋白一致下调。利用这些数据进行药物重定位，提出了26种化合物进行进一步研究，其中20种已显示出有希望的抗纤维化效果。心脏和肝脏纤维化之间共享一组18个蛋白，这些蛋白在纤维化与非/早期纤维化阶段相比表现出一致的上调，主要与ECM相关（基于matrisomeDB注释，n=14）。这种方法可以推广到其他病理，增进对受影响分子通路的认识，并基于此识别潜在的药物候选物/化合物。
缩写词
BH 多重检验的Benjamini–Hochberg校正 DDA 数据依赖采集 DIA 数据非依赖采集 ECM 细胞外基质 EMT 上皮-间质转化 GSVA 基因集变异分析 Nedrex 基于网络的药物重定位与探索
纤维化以不适当的伤口愈合为特征，可因各种组织损伤而在多个器官（如肝脏、心脏、肾脏、肺）中表现出来。尽管存在器官特异性差异，但在所有受影响器官中，通常都观察到炎症增加和细胞外基质(ECM)蛋白沉积，最终导致器官衰竭。最常受影响的器官是肝脏（影响全球人口的四分之一）、肾脏（影响六分之一）、心脏（影响六十分之一）和肺（影响一千五百分之一）。尽管纤维化负担很高，但临床治疗只能延缓疾病进展，尽管在肝纤维化领域最近已取得进展。因此，迫切需要更好地了解纤维化疾病机制，以推动基于证据的抗纤维化药物筛选。为了促进在分子水平上研究纤维化，我们建立了一个蛋白质组学资源库，汇编了通过系统搜索获取的现有相关数据集。利用这一资源，我们研究了是否能识别出在不同器官（心脏、肝脏）中共享差异调节通路的共同纤维化蛋白特征。最后，我们进行了分子驱动的药物重定位，并进一步通过计算机验证了所识别药物候选物的生物学相关性。这种方法可以推广到不同疾病，有助于更好地理解疾病相关分子变化，并利用这些知识提出药物候选物。
从ProteomeXchange及其存储库PRIDE和MassIVE中识别出公开可用的蛋白质组学数据集，重点关注与心脏、肝脏或肾脏纤维化相关的慢性疾病。包含标准和使用关键词的更多细节见支持信息。总共选择了三个心脏数据集（心脏纤维化数据集1 (PXD008934)、心脏纤维化数据集2 (PXD012467)、心脏纤维化数据集3 (PXD054266)）、三个肝脏数据集（肝纤维化数据集1 (PXD001474)、肝纤维化数据集2 (PXD027722)和肝纤维化数据集3 (MSV000094959)）和两个肾脏纤维化数据集（PXD006339和PXD040617）（表S1）。简而言之，使用Proteome Discoverer v1.4（用于数据依赖采集(DDA)）或DIA-NN v1.9.1（用于数据非依赖采集(DIA)）重新分析数据。对于通过质量控制的数据集，蛋白导出可在表S2中获得。对于心脏和肝脏数据集，在去除缺失值超过70%的样本和蛋白后，使用Wilcoxon Rank Sum检验识别差异蛋白表达，随后进行Benjamini–Hochberg (BH)多重检验校正。由于质量问题（主要是血液污染，详见支持信息），两个肾脏数据集未被纳入进一步分析。对于剩余数据集，考虑显著的蛋白需满足：BH校正后的p值<0.05，在至少一个其他研究同一器官的数据集中具有名义显著性，以及在该器官所有数据集中log2倍变化趋势一致。进一步应用STRING网络分析和基于MSigDB的基因集变异分析(GSVA)对差异表达蛋白进行通路映射。最后，使用基于网络的药物重定位与探索(NedRex)和Cytoscape版本3.10.3进行药物重定位分析，筛选出针对纤维化关键蛋白和通路（独立于病因）的有趣化合物。
在心脏纤维化中，124个蛋白在三个数据集中的至少两个中共享（在至少一个数据集中经BH校正后显著，在至少一个其他数据集中名义显著，且在所有心脏数据集中log2倍变化趋势一致）（表S3）。类似地，在早期对轻度肝纤维化中识别出4个共享蛋白（表S4），在轻度对重度肝纤维化中识别出135个（表S5），在早期对重度肝纤维化中识别出160个（表S6）。在表S3-S6中，报告了每个蛋白和数据集的病例和对照的ppm标准化和log2转换的平均丰度值、标准差、log2倍变化以及(未)校正p值。早期对轻度肝纤维化中共享蛋白数量较少已在先前研究中报道。此外，值得注意的是，在早期对轻度比较中的所有四个蛋白在肝纤维化数据集2 (PXD027722)中经BH校正后显著，在肝纤维化数据集3 (MSV000094959)中名义显著。18个蛋白在心脏纤维化和肝纤维化之间共有，表现出纤维化与非/早期纤维化阶段相比的一致上调，主要是ECM相关蛋白（基于matrisomeDB注释，n=14）（表S7，也提供了每个独立数据集的统计分析结果），并与它们在心脏和肝脏纤维化中的作用一起列于表B（支持信息）中，并在图1中图示。
图1 心脏和肝脏纤维化中筛选蛋白作用概述。完整蛋白名称见表S7，连同本图中显示的基因名称。灰色显示名称的蛋白未被检测到，仅用于说明黑、白标签蛋白的功能。
利用蛋白-蛋白相互作用数据库StringDB，对心脏纤维化中共享的差异表达蛋白以及随后在三个肝纤维化比较中的蛋白进行了计算机分析。考虑到早期对轻度肝纤维化中共享、一致的蛋白变化数量较少（n=4），无法生成网络。其余三个网络（使用124个心脏纤维化蛋白、135个轻度对重度肝纤维化蛋白和160个早期对重度肝纤维化蛋白生成），如图S7-S9所示，使用Markov聚类算法进行聚类，显示出与ECM相关的蛋白上调和参与细胞代谢的蛋白下调（图S10和S11）。
如支持信息中所述，GSVA分析进一步支持了心脏纤维化和肝纤维化之间共享（共同）通路反映了线粒体活性和分解代谢过程降低，同时ECM合成（特别是胶原蛋白和蛋白聚糖）和降解、细胞-基质相互作用、对转化生长因子β相关信号的反应以及上皮-间质转化(EMT)增加，这与早期发现一致。心脏纤维化与轻度对重度肝纤维化之间、心脏纤维化与早期对重度肝纤维化之间共享的十五个最显著（去）激活通路如图S12所示，完整列表见表S8和S9。
最后，使用NedRex，以124个心脏纤维化蛋白、135个轻度对重度肝纤维化蛋白或160个早期对重度肝纤维化蛋白作为输入。综合这三项分析的结果，基于心脏纤维化蛋白和任一肝纤维化比较的蛋白，识别出26种化合物作为潜在治疗候选物（图2，表S10）。这些药物的靶点在图2中显示（如果与我们筛选的蛋白直接相互作用）或在表S10中列出（针对所有药物，同时指明相互作用是直接还是间接）。其中20种药物，临床前研究或早期临床试验支持其在心脏和肝脏纤维化中的相关性（锌、早期临床试验；槲皮素；伊马替尼；尼达尼布，已获批用于特发性肺纤维化；达沙替尼；索拉非尼；阿昔替尼；厄洛替尼；他莫昔芬）；仅对心脏纤维化有效（吡哆醛磷酸；鲁比替尼；咪康唑；铜）；或仅对肝脏纤维化有效（舒尼替尼；尼洛替尼；鲁索替尼，已获批用于骨髓纤维化；奈拉替尼；帕唑帕尼；吉非替尼；氯丙嗪）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢(NADH)被预测但未报道在纤维化中的作用。描绘蛋白-化合物相互作用的网络如图2所示。
图2 蛋白-蛋白和化合物-蛋白相互作用网络。绿色表示与纤维化相关的药物候选物或化合物；蓝色表示它们靶向的蛋白。对于某些化合物，未识别出直接靶点；而是通过间接靶点（与筛选蛋白相互作用）识别（未显示）（表S10）。
有趣的是，26种化合物中有17种是蛋白激酶抑制剂（表S10）。事实上，如先前研究所示，激酶在纤维化中发挥着至关重要的作用，并代表了一个有吸引力的治疗靶点。然而，挑战仍然存在，例如导致毒性的脱靶效应。其他翻译后修饰也被报道在心脏和肝脏纤维化中发挥重要作用（例如，氧化、乙酰化、糖基化、琥珀酰化和S-棕榈酰化），目前正在努力探索其药物可及性。
这些结果表明，尽管存在组织特异性差异，心脏和肝脏纤维化之间可能存在共同的疾病过程。总体而言，利用公开可用的蛋白质组学数据，我们识别出心脏和肝脏纤维化中18个共享的差异表达蛋白，反映了成纤维细胞活化和ECM重塑。需要注意的是，在一般肝纤维化分析中，大多数蛋白在肝纤维化数据集2 (PXD027722)中经BH校正后显著，这可能归因于该数据集中患者在相应亚组中的更均匀分布。此外，值得注意的是，由于数据集之间识别蛋白数量的异质性，可能引入了无意的偏差。此外，我们不要求校正p值在所有数据集中都显著的标准可能无意中识别出假阳性。然而，我们要求在多个数据集中存在以减少偏差，并仔细验证了文献中的发现，这共同最小化了假阳性的风险。此外，据我们所知，这是第一个展示不同器官纤维化共享分子特征的资源。
该资源可可靠地用于改进对心脏和肝脏纤维化以及它们是否具有共享分子特征的理解，并有助于优先考虑对相关药物的进一步研究。所采用的流程可以推广并应用于其他疾病的背景下。
致谢
本研究由欧盟地平线欧洲玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动博士网络—工业博士项目（HORIZON—MSCA—2021—DN-ID）资助，项目编号101072828（Agnieszka Latosinska, Antonia Vlahou, Mayra Alejandra Jaimes Campos, Hanne Devos）。由欧盟资助。表达的观点和意见仅为作者个人观点，不一定反映欧盟的观点。欧盟或资助机构对此不承担责任。作者也是COST行动PerMediK (CA21165)的成员，感谢COST（欧洲科学与技术合作组织）的支持。
本文以开放获取模式发表得到了HEAL-Link的财务支持。
利益冲突
Mayra Alejandra Jaimes Campos、Marika Mokou和Agnieszka Latosinska受雇于Mosaiques Diagnostics GmbH。Hanne Devos现受雇于Nordic Bioscience A/S。其余作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
相关数据已存入ProteomeXchange（心脏纤维化数据集1 (PXD008934)、心脏纤维化数据集2 (PXD012467)、心脏纤维化数据集3 (PXD054266)、肝纤维化数据集1 (PXD001474)、肝纤维化数据集2 (PXD027722)、PXD006339和PXD040617）或MassIVE（肝纤维化数据集3 (MSV000094959)）。蛋白鉴定和丰度数据可在表S2中获得。
【全文结束】
