摘要
脑内出血(ICH)是一种致命且致残率高的卒中类型，目前尚无特异性治疗方法。ICH后的炎症是继发性损伤的重要机制，而ICH中发炎的血管内皮是极具潜力的治疗靶点，因为它是外周炎症细胞进入大脑的门户。针对炎症的全身性疗法在卒中治疗中未能成功，部分原因是副作用或脑部递送效果不佳。我们假设，将编码强效抗炎细胞因子IL-10的mRNA靶向递送至脑血管，将改善实验性小鼠ICH模型的预后。我们利用微流控技术制造脂质纳米粒子(LNPs)，装载IL-10 mRNA，并与针对血管细胞粘附分子(VCAM)的抗体结合，该抗体可在ICH后与发炎的脑内皮结合。与非特异性LNPs相比，VCAM-LNPs在脑内的分布量提高了约4倍，其携带物在脑内的表达水平提高了10倍。使用含IL-10 mRNA的VCAM-LNPs治疗后72小时，组织学检测显示血肿体积减少约69%，MRI显示病灶体积减小，运动行为改善约65%。最后，我们提出VCAM-IL10-LNPs通过调节脑巨噬细胞表型发挥其治疗益处。我们的数据提出了一种有前景的ICH治疗和递送策略，并阐明了急性炎症靶向对ICH病灶大小和行为的影响。未来实验将探究连续给药如何影响LNPs在我们模型中的表达，以及ICH后较晚时间点的治疗是否仍能产生治疗效果。
引言
脑内出血(ICH)在所有卒中类型中致残率和死亡率最高，治疗主要以支持性治疗为主[1,2,3]。ICH患者通常在发病后2-4小时就医，血肿可能在最初24小时内继续扩大[4,5,6,7]。除占位效应外，炎症等继发性损伤机制被认为在ICH的有害后果中起主要作用[8,9]。出血导致血脑屏障(BBB)破坏后，活化的内皮细胞招募外周免疫细胞，这些细胞加剧了炎症反应[10,11]。这种招募需要粘附分子如血管细胞粘附分子(VCAM)的参与，VCAM在发炎的内皮细胞中表达，在白细胞亚群中表达程度较低[12,13,14,15,16,17,18]。
在ICH后免疫调节的候选疗法中，IL-10尤为突出。这种强效抗炎细胞因子可限制内皮-白细胞相互作用，降低氧化应激，并改善神经元和胶质细胞存活[19,20,21,22,23]。临床上，ICH患者体内较高的IL-10水平与90天后更好的预后相关[24,25]，临床前通过重组蛋白递送增强IL-10也改善了行为预后[26]。然而，重组IL-10在血液中迅速被清除，全身递送在炎症疾病模型中导致脱靶效应，阻碍了临床转化[27,28]。
我们先前的工作表明，尽管ICH中存在血管渗漏，但通过静脉注射系统递送治疗性蛋白时，其在脑内的积累量较低[29]。然而，我们通过将治疗蛋白与针对VCAM的抗体结合的纳米粒子耦合，大大提高了治疗蛋白向脑部的递送。这一概念验证工作表明，VCAM-纳米粒子靶向在实验性ICH中可大大超过治疗药物的被动递送。
在此基础上，我们使用VCAM靶向递送装载mRNA的脂质纳米粒子(LNPs)。与递送蛋白相比，递送mRNA有几个优势：mRNA可以在靶向部位产生更多的蛋白；当与纳米粒子耦合时，治疗性蛋白常会受损；而装载多种不同mRNAs并不比装载一种mRNA更难，但每种新蛋白治疗都需要独特的制造和与纳米粒子的耦合。作为原型装载mRNA，我们选择了IL-10 mRNA，以及一种我们先前观察到体内耐受性良好的LNP配方[30]。
我们首先证明，与非特异性LNPs相比，我们的VCAM-LNPs在脑内的表达水平提高了10倍。利用我们在ICH中的治疗效果筛选策略，我们证明当装载IL-10 mRNA时，我们的VCAM-LNPs导致小鼠血肿体积减小和行为预后改善。我们发现，这些LNPs不仅在脑内皮细胞中表达，而且在浸润的白细胞亚群中也有表达。最后，我们证明VCAM-IL10-LNP治疗导致巨噬细胞表型向抗炎群体转变。这项工作标志着靶向mRNA-LNP技术作为有效递送策略在实验性ICH中产生治疗效果的首批出版物之一，ICH是一种毁灭性的人类疾病，目前治疗选择有限。
结果
VCAM靶向LNPs在ICH损伤小鼠中表现出优于非特异性对照的脑递送和表达
我们先前已证明，在ICH背景下(以及假手术损伤小鼠中)，VCAM靶向脂质体相比非特异性对照具有更好的脑递送效果，即使在血管渗漏高的时期也是如此[33]。然而，我们也曾证明静脉注射LNPs可引起显著的体内免疫反应，影响递送和装载物表达[30,34,45,46]。因此，我们先前在卒中小鼠中进行的LNP递送研究依赖于商业来源的LNPs，由于其组成的专有性，这些LNPs不太适合我们应用的修饰。为此，我们使用可电离脂质4A3-SC8(图1A)重新设计了我们的VCAM靶向LNPs，我们先前的工作表明，与商业可用电离脂质相比，这种脂质具有更优越的表达效果。这些LNPs在大小、耦合效率和稳定性方面与我们先前发表的脂质体和商业获取的专有LNPs相似(补充图1-2)。然后我们测试了损伤小鼠是否能耐受我们的新配方，结果与我们在VCAM靶向脂质体对应物中观察到的结果相似。小鼠接受了纹状体内胶原酶注射(图1B)。在损伤后4小时注射放射性标记的抗VCAM修饰LNPs(以及IgG-LNP对照)，循环30分钟后收获组织。通过放射示踪，我们观察到VCAM靶向LNPs在脑内的积累量比非特异性对照高约10倍(图1C)，且在损伤半球显著更高。其他器官的生物分布如图3A-B所示；VCAM-LNPs在脾脏的生物分布显著高于对照，这与我们之前报道的其他VCAM靶向纳米粒子一致[33]。当归一化到血液时，VCAM-LNPs在同侧半球的定位比率高6倍(补充图3C)。在额外的放射示踪实验中，脑内VCAM信号在注射后随时间下降(补充图4)。
为测试装载物表达，我们生成了含荧光素酶mRNA的LNPs，并比较了通过VCAM-LNP递送mRNA与IgG对照的脑荧光素酶表达。我们在损伤后2小时注射这些LNPs，并允许它们循环4小时，因为先前研究表明这是LNP递送mRNA表达最高的时间[47,48]。我们发现，在ICH后两个半球中，VCAM-LNP处理组的脑荧光素酶表达比IgG对照组高约10倍(图1D)。在另一个实验中，我们在ICH后2小时注射含荧光素酶mRNA的VCAM LNPs，并允许它们循环4小时和22小时。结果显示，在较长的循环时间下，单剂量VCAM-LNPs在同侧(损伤)半球的脑荧光素酶表达甚至更高(图1E)。综上所述，这些数据证实我们新设计的VCAM靶向LNPs靶向ICH受影响的脑部，并与非特异性对照相比，在ICH损伤脑中导致候选mRNA的更高表达。
纹状体内注射胶原酶构成了急性抗炎治疗的高通量筛选范式
纹状体内注射胶原酶是小鼠模型中实验性ICH的金标准方法之一。与其他脑血管损伤模型相比，这种手术方法简单直接，胶原酶剂量可以调整以获得可预测的表型，具有高生存率，这是建立治疗筛选疾病模型的重要步骤。我们先前已证明，在我们手中，该模型导致血肿大小在24小时内最初扩大29，随后在48小时内血肿大小保持稳定。在这里，我们扩展这些观察结果，显示血肿大小在72小时开始减小(图2A)。与血肿平行，如预期的那样，小鼠在损伤对侧出现偏瘫表型，这种缺陷在此时间范围内也保持稳定(图2B)。我们先前观察到，在胶原酶模型中，放射性标记的白蛋白在ICH后最初几小时内渗入脑内，但在24小时时消退。我们现在通过放射示踪脑内的白蛋白，检查了ICH后长达72小时的血管渗漏(图2C)。我们观察到，在此时点，损伤半球出现白蛋白渗漏的第二波(图2D)，这可能代表ICH后的炎症，可能成为治疗的靶点。这三个读数(血肿大小、运动行为和血管渗漏)构成了我们在实验性ICH中筛选有希望的LNP治疗的高通量治疗筛选策略的基础。因此，我们试图通过检查VCAM-LNP介导的抗炎细胞因子IL-10编码mRNA的递送是否足以减少ICH后的损伤大小、减少血管渗漏和改善运动行为，来测试该平台。
VCAM-IL10 LNPs导致血肿大小减小和行为改善
我们在高通量ICH筛选策略中测试了含IL-10 mRNA的VCAM靶向LNPs。基于前一节的数据，我们关注了损伤后72小时的结果。考虑到72小时时血管渗漏增加，我们首先将此作为主要终点。小鼠接受ICH手术，并在胶原酶注射后0.5小时、24小时、48小时和68小时注射LNPs。在最后一次给药前记录行为并进行盲法评分。初步实验表明5μg将是看到VCAM-IL10-LNPs行为改善的最低有效剂量(补充图5)。小鼠被处死，收集大脑用于通过白蛋白放射示踪测量血管渗漏以及血肿大小的盲法分析(图3A)。对照组用含mCherry mRNA的VCAM靶向LNPs或未靶向LNPs(与非特异性IgG耦合)含IL-10 mRNA处理。我们观察到，与所有其他对照相比，用VCAM-IL10 LNPs处理的小鼠血肿大小显著减小(图3B)，运动行为显著改善(图3D)。与对照相比，用VCAM-IL10 LNPs处理的小鼠在任一半球中白蛋白渗漏量均无减少(图3C)。在72小时，我们还测量了血浆中的IL-10表达(图3E)和脑组织中的IL-10表达(图3F)，发现VCAM-IL10-LNP组的水平显著高于对照组。然后，我们试图确认在72小时组织学中观察到的变化是由于ICH后血肿形成减少还是血肿再吸收增加。为此，小鼠在ICH和用VCAM-IL10-LNPs或PBS治疗后进行MRI检查，方法同前。我们观察到，在24小时，两组之间的血肿大小没有差异(图4A)。然而，随时间推移，两组之间的病变大小变化存在显著差异——PBS处理的小鼠在T2*-加权成像上病变随时间扩大，而VCAM-IL10-LNP小鼠的病变保持稳定(图4C，补充图6)。值得注意的是，LNP处理组之间体重或肾功能无显著变化。在VCAM-mCherry-LNP对照组中观察到肝酶升高(补充图7)，但在VCAM-IL10或IgG-IL10-LNP组中未观察到。
在脑内，VCAM-LNPs主要靶向ICH后招募的白细胞
为调查在VCAM-LNP治疗后ICH脑内被靶向的细胞群体，我们获得了Ai6小鼠，这些小鼠含有loxP侧翼增强型绿色荧光蛋白变体(ZsGreen1)，在Cre介导的重组后表达。我们生成了含cre重组酶mRNA的VCAM-LNPs，并按我们的治疗范式每天给药3天。在此时间段结束时，我们收获大脑进行免疫组织化学，观察到大部分信号局限于血管中的内皮细胞(补充图8)。在单独的实验中，小鼠接受ICH手术，随后给予含FLAG标记IL10 mRNA序列的VCAM-LNPs。组织学显示脑FLAG信号在血管周围最为显著(补充图9)。然后我们通过流式细胞术识别靶向细胞(图5A；门控策略总结在补充图10)。在回收的细胞中(图5B)，与左侧相比，右侧(损伤)半球中的白细胞显著更丰富。在回收的细胞中，损伤半球中的小胶质细胞(CD45midCd11b+)和白细胞(CD45+)以最高比率呈ZsGreen阳性(图5C)，尽管在评估的细胞类型中这些差异无统计学意义。在损伤半球中，双阴性细胞(CD31-CD45-)的ZsGreen阳性率<20%，未进一步表征。在首次识别Zsgreen阳性细胞时，白细胞代表了表达LNP装载物的大多数细胞(图5D)，这与它们也是回收细胞的大多数相关。对于所有动物，针对单个细胞类型门控后的ZsGreen表达的个体直方图包含在补充图11中。
巨噬细胞是VCAM-LNP治疗后ICH脑内最被靶向的白细胞
接下来，我们检查了单个白细胞亚群。我们主要关注表征在ICH后已知参与初始先天免疫反应的细胞，仅大致表征此实验的淋巴细胞。在回收的白细胞中，巨噬细胞(CD45+CD64+Ly6G-)代表右侧(损伤)半球中回收细胞的大多数，且它们比左侧半球显著更丰富(图6A)。图6B是代表性直方图；所有个体直方图见补充图11。我们注意到，CD64-中性粒细胞(非活化中性粒细胞)在右侧(损伤)半球表达显著更多的ZsGreen(图6C)。然而，当首先通过所有ZsGreen阳性细胞门控时，被认为在ICH后对先天免疫反应关键的细胞类型(巨噬细胞、小胶质细胞和中性粒细胞)在同侧半球均表达显著更多的ZsGreen阳性(图6D)，表明它们是装载mRNA从我们新型VCAM靶向LNPs诱导的表达的主要驱动因素。
VCAM-IL10-LNPs导致ICH后脑内M2巨噬细胞增加
为阐明VCAM-IL10-LNPs的作用机制，我们像之前一样(图3A)用PBS或VCAM-IL10 LNPs处理小鼠群组。72小时后，收获大脑用于流式细胞术。CD45+细胞的回收在各组间相当(图7A)。从这些细胞中，巨噬细胞(CD45+, CD11b+)的数量无差异(图7B)。两组之间经典活化(M1)巨噬细胞(CD86+, MHCII+)的数量也无差异(图7C)。然而，与PBS相比，VCAM-IL10-LNP处理的小鼠中M2巨噬细胞(CD206+, Arg1+)显著更高(图7D，补充图12)。门控策略包含在补充图13中。个体直方图包含在补充图14中。
讨论
ICH是一种毁灭性的卒中类型，目前没有疾病修饰治疗。在我们之前的工作中，我们观察到靶向递送到内皮和白细胞(使用针对这些细胞中常见表达的粘附分子VCAM的靶向部分)导致假定治疗蛋白在脑中的积累更高。在这篇新论文中，我们试图将这一策略与不同类型的纳米粒子LNPs一起应用，因为这些纳米粒子通过其核酸装载物具有调节蛋白表达的巨大治疗潜力。具体而言，我们想看看编码抗炎细胞因子IL-10(有大量临床前证据支持其在ICH中的潜在治疗作用)的mRNA是否可以通过这一策略递送，并在不同的临床相关结果上比对照产生更好的靶向和治疗效果(参见图8的图形摘要)。
为测试这一点，我们采用了我们实验室开发的一种新型LNP配方，使用可电离脂质4A3-SC8。我们实验室的先前工作表明，与标准配方相比，这种配方减少LNP相关副作用并增加装载物表达[30]，但该配方从未在ICH等脑损伤模型中使用过。我们证明，即使在已经患有ICH的小鼠中，这些LNPs也能在脑中递送和表达mRNA装载物，水平显著高于非特异性对照。VCAM在发炎的血管、脾脏的基质细胞以及在较小程度上在白细胞中表达[15,16,17,18]，我们没有看到LNPs能在内吞后以完整形式转胞吞过血脑屏障的证据。因此，脑中LNP装载物表达可能由内皮和浸润的白细胞摄取驱动，正如我们后来的组织学和流式细胞术数据所示。其他高度血管化的器官如肺并未表现出如此高的摄取，突显了VCAM靶向发炎内皮的优势。值得注意的是，之前已经尝试过许多其他脑靶向策略，如最近检查angiopep-2[51]或更经典靶点如转铁蛋白受体[52]的工作。我们先前将VCAM靶向与其他纳米粒子的转铁蛋白受体靶向进行了比较，观察到VCAM更优越[31,33]，为我们在脑疾病应用中持续开发这种靶向部分奠定了基础。小鼠对配方的耐受性良好，体重、肝脏或肾功能无显著变化。因此，考虑到LNPs可以将大量核酸装载物递送到靶点，这些数据为我们的后续治疗实验奠定了基础。
尽管我们对ICH有前景的递送策略，但考虑可以测量的治疗结果以真正筛选有希望的治疗候选物非常重要。为此，我们设计了一个多模式策略来测试我们筛选模型中的行为和组织结果。我们在设计中考虑了三个结果测量：血肿大小、运动行为结果和血管渗漏。我们观察到，我们的模型在盲法实验中对所有这三个变量都有稳健的表型，因此对测试治疗效果足够敏感。我们最初假设抗炎装载物如IL-10的递送将导致我们在模型中72小时后看到的白蛋白渗漏减少(因此改善行为结果)，通过放射性白蛋白追踪脑内渗漏来测量，并选择72小时作为我们初步治疗试验的终点。
我们在手术后立即通过VCAM靶向LNPs递送IL-10 mRNA，然后每天直到72小时时间点，每个动物共4剂。作为对照，我们还通过与非特异性IgG对照耦合的LNPs递送IL-10 mRNA，以及含mCherry mRNA的VCAM-LNPs(作为在ICH后可能对调节免疫反应几乎没有作用的未标记荧光蛋白)和PBS处理的对照。我们观察到，只有VCAM-IL10-LNP组有治疗效果——该组小鼠通过组织学观察到血肿大小显著减小，因此运动行为也得到改善。我们通过在治疗后获取连续MRI进一步确认了这一点，证实小鼠在24小时时有相似的病变，但在72小时时有显著差异——PBS处理的小鼠在该时间点病变更大。值得注意的是，在T2*-加权成像中病变大小增加已在实验性ICH中报道，可能代表血肿降解/再分布和炎症变化的组合。血肿负担增加与ICH后更差的预后密切相关[7,50,53,54]，因此许多人试图开发针对血肿的ICH疗法，如血小板输注或促进凝血[55,56]，但这些策略已失败。我们的数据表明，血肿大小可能不仅由于血管破裂，炎症也在这一过程中发挥作用。这一观点得到文献中其他观察的支持，表明缺血性卒中后的出血转化受浸润巨噬细胞调节[57]，ICH中高中性粒细胞-白细胞比率也与血肿扩大相关[58]。虽然炎症长期以来被假设为亚急性ICH中可靶向的损伤机制，但我们的数据表明，炎症也可能是急性/超急性治疗中可靶向的机制，作为减少病变大小的一种方式。
有趣的是，我们在任何治疗组中均未看到损伤半球中72小时白蛋白血管外渗程度的降低。这可能是由于在此疾病模型中我们的靶向部分对脑内皮靶向不足，或IL-10给药不足，导致在我们的实验范式中未能实现血脑屏障恢复。最近的一篇出版物显示，增加的IL-10确实导致周边血肿水肿减少[59]，但这是通过脑水含量而非直接外渗来量化的。这种技术反映了随时间累积的水肿(包括来自其他水源如脑脊液)。未来的实验可以在我们的实验范式中测试其他LNP剂量或更晚时间点的白蛋白渗漏，还可以测试除白蛋白外不同大小分子的渗漏。尽管治疗后血管渗漏持续存在，我们的治疗性VCAM-IL10-LNPs仍导致运动行为改善，证实即使没有血管渗漏变化，减少血肿大小最终足以影响ICH后的急性运动结果。
我们试图确认装载的IL-10 mRNA是否在治疗动物中表达。确实，与PBS处理组甚至IgG-IL10-LNP处理组相比，用VCAM-IL10-LNPs处理的小鼠血浆IL10水平显著更高(图3E)。与PBS对照相比，用VCAM-IL10 LNPs处理的小鼠在损伤半球中IL-10表达也显著增加，尽管这种效果不如我们的治疗所见的IL-10外周升高那么显著。我们怀疑这可能是由于VCAM-LNPs的内皮靶向，允许IL-10分泌到脑等组织的实质/腔外和腔内隔室中。这一观察突显了外周免疫反应在ICH结果中的作用(特别是脾脏)，并让人希望靶向外周免疫系统中的关键细胞参与者(比实质靶向更容易实现的药物递送目标)可能对ICH有益。未来的实验将通过在缺乏脾脏靶向的情况下(即使用脾切除动物)评估治疗反应，来阐明这种外周表达的贡献。值得注意的是，IL-10是可装载到靶向LNPs用于ICH治疗的众多可能治疗装载物之一。其他细胞因子如IL-4和TGF-beta在临床前ICH中已显示改善预后[60,61]，靶向LNPs可能允许将它们转化为临床实践。在本文中，我们关注IL-10，因为有关于ICH中前景良好的临床前数据的文献，使其成为我们靶向LNP平台的初始治疗。最后，我们仅评估了ICH后的短期结果，因为在急性环境中减少病变负担已被证明可改善ICH结果[62]。未来的实验将寻求评估我们的治疗范式对神经炎症和功能结果(如认知)的长期后果。
我们先前在脂质体中的数据表明，VCAM靶向LNPs将优先在脑内皮和浸润的白细胞中积累。在我们的实验范式中，我们观察到LNP编码蛋白的表达在中性粒细胞和巨噬细胞中最高，其次是小胶质细胞和内皮细胞。这可能是由于使用Ai6小鼠的特定实验设计，其中一份cre重组酶拷贝可能足以修饰细胞基因组以表达ZsGreen。因此，重复给药更可能影响外周白细胞(分裂更快的细胞)，而不是内皮细胞。此外，中性粒细胞和巨噬细胞也可能吞噬邻近细胞释放的ZsGreen，而不是由于VCAM-LNPs靶向而直接产生ZsGreen。无论如何，巨噬细胞和中性粒细胞是ICH后炎症反应的关键参与者，考虑到IL-10是一种分泌蛋白，本实验中ZsGreen的分布可能代表产生和受IL-10影响的细胞，从而导致我们用LNPs看到的治疗反应。为此，我们注意到VCAM-IL10-LNP处理的小鼠表现出向抗炎群体的巨噬细胞表型转变。虽然巨噬细胞活化存在于一个谱系上，但M1(促炎)与M2(抗炎)框架有助于理解假定治疗后免疫环境的变化。我们发现，与PBS处理的对照相比，VCAM-IL10-LNP治疗显著增加了脑中的M2型巨噬细胞，这已被证明可改善ICH后的结果[63,64]。我们认为这种变化可能是由于脑IL-10水平升高(可能是由于通过浸润的白细胞和内皮细胞直接脑表达VCAM-LNPs，以及在一定程度上，VCAM-IL10-LNPs在外周诱导的IL-10)导致的，这有助于实现脑内的局部浓度，从而帮助调节脑内巨噬细胞分化。关于外周表达的VCAM-IL10，我们先前的工作表明，小蛋白在静脉给药后不会在脑中积累(即使在血管渗漏高的时期)，因为它们会迅速从循环中清除[29]。因此，除了增强脑递送(如我们的数据所示)外，mRNA在VCAM-LNPs内的表达可能通过允许IL-10的循环水平比重组蛋白单剂量预期的更长，以及比非特异性IgG LNPs所见的水平更高，从而比重组蛋白具有优势。
这项工作紧随我们团队最近发表的数据，该数据也显示了在使用不同配方的商业可得LNPs靶向VCAM的实验性缺血性卒中模型中IL-10 mRNA的治疗功效[33]。虽然缺血性和出血性卒中是不同的疾病，但两者免疫反应中的共同元素表明共同治疗可能有助于调节任一种卒中形式中的神经炎症。我们在此提出的治疗的一个优势是其在临床环境中可能非常早的给药，因为在干预前可能不需要区分卒中类型。
本文是该领域首批描述在实验性ICH模型中使用静脉递送的mRNA LNPs产生治疗反应的论文之一。这里呈现的数据为未来使用各种mRNA(甚至mRNA组合)来调节ICH后的免疫反应的治疗实验奠定了基础，特别是考虑到血脑屏障(脑内皮和募集的外周白细胞)作为此模型中靶点的可及性。
结论
我们证明，与非特异性对照相比，VCAM LNPs在实验性ICH中导致装载mRNA在脑中的表达显著更高。我们利用这种靶向策略在ICH后递送IL-10 mRNA，并证明这通过组织学和MRI减少血肿大小，并改善运动行为方面具有治疗效果。我们的纳米粒子在ICH脑中优先在浸润的白细胞中表达，其中巨噬细胞构成最大组分。VCAM-IL10-LNPs导致巨噬细胞表型转变，促进增加抗炎/M2巨噬细胞亚群。这些数据是首批报告mRNA LNPs在实验性ICH中治疗功效的数据之一，该疾病在人类对应物中治疗选择有限且死亡率高。
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