CRISPR是一种基因编辑工具，科学家过去曾尝试用它来针对唐氏综合征的突变，但一直面临挑战。直到最近，这项技术主要局限于实验室研究，但现在研究人员成功利用改良版CRISPR工具在临床前研究中使突变基因"沉默"，希望这种方法能在人类身上得到复制。
唐氏综合征，也称为21三体综合征，在全球范围内大约每1000至1100名婴儿中就有1例。它是由于异常的细胞分裂导致21号染色体出现完整的或部分的额外拷贝而引起的。这可能会影响大脑和身体的发育，通常与发育迟缓和认知障碍相关。
尽管已有多种疗法被尝试用于治疗症状，但没有一种能接近解决根本原因——染色体突变。然而，马萨诸塞州贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院的科学家们已经找到了一种使用改良版CRISPR的方法。
"CRISPR很擅长切割DNA，但不太擅长插入DNA。所以，这里的思路是将XIST插入到21号染色体的三个拷贝中的一个。从实践角度来看，这非常困难，因为CRISPR在插入方面的效率不高。"贝斯以色列女执事医疗中心的研究负责人沃尔尼·希恩指出。
改良版CRISPR如何靶向唐氏综合征
CRISPR，即成簇规律间隔短回文重复序列，是一种从细菌防御机制改编而来的基因编辑技术，允许精确编辑、关闭或替换DNA序列。CRISPR被誉为分子剪刀，可以关闭唐氏综合征中21号染色体的额外第三个拷贝。马萨诸塞州的研究团队已经在实验室中实现了这一点，但对工具本身做了轻微修改。
"这不仅仅是CRISPR单独使用，"贝斯以色列女执事医疗中心的研究负责人沃尔尼·希恩指出。他解释说，该研究使用了一种名为XIST的长非编码RNA，这种RNA能在雌性哺乳动物中使X染色体沉默。在正常发育过程中，XIST会随机激活，关闭一条X染色体。这是CRISPR技术单独使用时一直难以实现的。
希恩解释道："CRISPR很擅长切割DNA，但不太擅长插入DNA。所以，这里的思路是将XIST插入到21号染色体的三个拷贝中的一个。从实践角度来看，这非常困难，因为CRISPR在插入方面的效率不高。"
希恩的实验室采集了唐氏综合征患者的细胞和干细胞，将改良版CRISPR系统引入这些细胞。这导致了整个XIST序列的整合，以及更高的同源定向修复效率——一种高精度修复受损DNA的机制——达到30%至40%，相比传统CRISPR技术有显著提高。
希恩表示："通常，单独使用CRISPR的插入效率可能不到1%或2%。因此，在我们看来，30%的效率已经足够高，可以得到临床上适当的反应。"
此外，CRISPR使用引导RNA，这是一种特定的RNA序列，可将CRISPR相关（Cas）核酸酶引导至精确的DNA靶点进行基因编辑。要使这种方法起作用，需要有一个PAM位点。唐氏综合征的突变是由于减数分裂I期不分离，即同源染色体在后期未能分离。这是细胞分裂的关键阶段，复制的染色体或同源染色体分离并向细胞的相反极移动，确保正确分裂。但当它们未能分离时，可能导致同一染色体的两个拷贝。
希恩表示："三个拷贝并不相同。换句话说，它们有不同的单核苷酸多态性（SNP）位点。因此基本上，你可以选择一个PAM位点，以便只针对21号染色体的三个拷贝中的一个。" "这克服了将XIST插入21号拷贝并靶向21号染色体三个拷贝之一的障碍。"
希恩解释说，当CRISPR与XIST结合时，改善的效率意味着该技术可能进入临床应用。
"这是下一步，"他说。"CRISPR本身实际上无法靶向三体。你可以尝试以这种方式插入，但效率太低，不切实际。论文的重要性在于我们开发了一种改良版CRISPR方法，我们使用了四个引导RNA，而不是通常的两个。通过使用四个引导RNA，我们有重叠的臂。我们拥有单链DNA，因此同源修复效率大幅提高。这就是关键所在，我们获得了将XIST整合到靶位点的更高效率。"
该过程使用DNA悬垂，即双链DNA分子末端的短单链序列。供体DNA经过修饰，使DNA的臂在附着于CRISPR的外切核酸酶修剪DNA之后。
虽然实现足够效率以进行进一步试验的障碍似乎已经克服，但这些科学家面临的下一个挑战是在活体内实施这一方法。
希恩表示："一旦我们能将其送入细胞，我们就处于良好状态。"
目前，该团队正在小鼠模型中测试这种潜在疗法，并考虑如何将这些构造物尽可能多地递送到脑细胞中。但递送是基因疗法普遍面临的问题。确保治疗到达正确位置的正确细胞仍然是细胞和基因治疗（CGT）领域的主要障碍。
这种方法能否预防早发性阿尔茨海默病？
靶向突变意味着可以治疗唐氏综合征患者出生时就出现的认知障碍，以及早发性阿尔茨海默病。根据美国国家医学图书馆发表的一份报告，大约40%至80%的唐氏综合征患者在五六十岁时会发展出类似阿尔茨海默病的痴呆症。
唐氏综合征患者患上阿尔茨海默病的原因是21号染色体上有三个淀粉样前体蛋白拷贝。这些蛋白在突触形成（连接神经的连接点）和神经可塑性中起作用。但这些蛋白在斑块中的积累是阿尔茨海默病的标志。
希恩表示："如果你有效地使三个拷贝中的一个沉默，基本上你也治疗了早发性阿尔茨海默病。"
根据希恩的说法，基于临床前研究的进展，这项研究可能成为治疗任何类型疾病的起点。
他说："这里的方法是尝试找出最佳方式来递送CRISPR；将带有XIST的改良版CRISPR方法递送到大脑，然后我们将评估能在多大程度上挽救认知表型。"
创新突破：非传统CRISPR工具应对突变
与此同时，日本三重大学的科学家们也成功使用另一种称为等位基因特异性编辑的CRISPR技术靶向额外的21号染色体。这种方法用于修改或沉默特定的基因拷贝或等位基因，同时保持其他拷贝不受影响。一旦去除额外染色体，细胞恢复了正常的基因表达。
研究表明，没有额外染色体的细胞显示出更高的存活率，以及称为活性氧的有害代谢副产物水平较低。这也改善了细胞的线粒体功能。
随着非传统CRISPR方法取得进展，这可能解决与唐氏综合征突变相关的各种失调通路。
希恩表示："对于唐氏综合征的治疗，你不能只靶向几个基因。要挽救表型，这不是一个实际可行的方法。我的感觉是，因为有太多不同的通路被破坏，你怎么知道哪一个会是相关的？你不知道。因此，如果你无法决定哪些基因是最相关的，那么沉默所有基因将是一个更好的方法。"
作为首批使用人类细胞来靶向突变的科学家之一，这绝非易事。此前，希恩团队已对人类胎儿细胞进行了研究——包括转录谱分析和表观遗传甲基化——以了解唐氏综合征中通路如何失调，这些研究最终促成了改良版CRISPR试验。
希恩表示："我们已经克服了将XIST放入适当位置的重大障碍。我们能够挽救细胞中的表型，至少从转录谱分析来看是这样。所以，我认为如果我们能在适当的时间靶向大脑中足够多的细胞，这将会起作用。这就是下一步。" "我认为这是一个非常激动人心的时刻。"
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