急性缺血性心脏病的表现是动脉粥样硬化过程中最严重且致命的后果之一。本研究假设可溶性前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）、可溶性骨形态发生蛋白4（BMP-4）、可溶性E-选择素（sE-selectin）、可溶性内皮糖蛋白（sENG）和可溶性内皮细胞特异性分子-1（Endocan）在无心血管病史且未服用心脏保护药物的心肌梗死（MI）患者中与健康对照组存在差异。该研究采用横断面设计。
我们分析了79名患者（平均年龄54.1 ± 8.9岁，女性占18%）的数据，这些患者因首次出现MI而住院，并且在事件发生前没有使用过心脏保护治疗。作为对照组，我们分析了17名年龄匹配的健康志愿者（平均年龄51.5 ± 8.6岁，女性占47%）。除了常规获取临床和实验室数据外，我们还使用ELISA和Luminex分析法测定了上述生物标志物的血浆浓度。
MI患者与健康对照组在总胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）、非高密度脂蛋白（HDL）和甘油三酯水平上没有差异。PCSK9、BMP-4和sE-selectin水平在MI组和对照组之间没有显著差异。MI患者的sENG和Endocan水平显著高于对照组。此外，较高体重指数（BMI）和吸烟者的sENG水平显著更高。
我们证明，sENG可以作为反映未经心血管风险因素治疗的MI患者内皮功能障碍的生物标志物。
【关键词】：心肌梗死，可溶性内皮糖蛋白，可溶性内皮细胞特异性分子-1。
引言
在全球范围内，心血管疾病仍然是导致总体死亡率居高不下的主要原因，急性冠状动脉综合征常常是其首个表现症状[1]。这是由于冠状动脉内的动脉粥样硬化斑块破裂，导致心肌缺血、坏死及随后的临床表现。因此，早期诊断和风险评估对于指导及时治疗和改善患者预后至关重要[2]。
内皮在冠状动脉疾病中起着至关重要的作用。在存在诸如高血压、高血脂或高血糖等心血管风险因素时，它从静止状态转变为激活状态，表达粘附分子和炎症标志物，从而改变内皮的通透性和血管活性特性[3]。因此，内皮功能障碍（ED）与心肌梗死（MI）的风险增加密切相关[3,4]。
已有多项关于内皮功能障碍的ED标志物的研究，其中一些在不同血管病理学背景下显示出或多或少的特异性。然而，目前尚无冠状动脉疾病的“金标准”循环生物标志物[3]。我们介绍了可能新颖且有趣的内皮功能障碍和炎症生物标志物，相关于那些无症状心血管疾病但遭受MI发作的未接受治疗的个体。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）是胆固醇代谢中的关键参与者，与内皮功能障碍、炎症和动脉粥样硬化有关[5]。此外，它被认为是除血脂异常外的心血管风险的不利因素[6]。骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子β（TGFβ）超家族的成员，其中BMP-4被证实为血管生物学中的关键调节因子。其在血管炎症期间白细胞招募中的关键作用[7]，以及其在高血压发展中的潜在参与已得到证明[8]。包括E-选择素在内的几种粘附分子在血管内皮的炎症反应中表达。此外，研究表明sE-selectin水平升高可作为反映冠状动脉疾病负担的循环标志物[3]。
内皮糖蛋白（ENG，CD105）是一种180 kDa的跨膜糖蛋白，被认为是TGFβ超家族配体的共受体[9]。有两种不同的膜结合ENG异构体由各种细胞（内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞）表达，以及在血浆或细胞培养基中循环的可溶性内皮糖蛋白（sENG）[10]。sENG是由基质金属蛋白酶活动形成的ENG胞外域N端切割产物[11-13]，并释放到循环中。除了基质金属蛋白酶，最近还描述了凝血酶生成sEng[14]。sENG可检测并用作多种心血管和代谢紊乱的生物标志物，如子痫前期[15]、高胆固醇血症[16]、家族性高胆固醇血症[17]、动脉粥样硬化[18]、动脉高血压[19]、败血性休克疾病[20]和肝脏病变[21]。此外，基于我们的实验数据，在早期主动脉内皮功能障碍的发展中[22]和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展过程中的肝窦内皮功能障碍中，sENG水平升高并与体内总胆固醇水平和动脉粥样硬化的进展相关[23]，表明其在内皮功能障碍发展中的重要性。此外，我们证明高sENG水平加重主动脉内皮功能障碍[24]和内皮炎症[25]，表明其对血管内皮具有潜在有害影响。
然而，急性冠状动脉综合征（ACS）和冠状动脉疾病（CAD）中sENG水平的变化显示了有争议的数据。例如，Cruz-Gonzalez等人发现急性心肌梗死患者的sENG水平低于健康个体[26]。相反，sENG水平在破裂斑块和不稳定斑块患者中高于稳定斑块患者，表明sENG反映了斑块稳定性和急性冠状动脉综合征的风险[27]。
内皮细胞特异性分子-1（ESM-1），一种硫酸皮肤素蛋白聚糖，主要由血管内皮表达，并已被发现在血液中自由循环为可溶性内皮细胞特异性分子-1（Endocan）[28]。事实上，升高的Endocan血浆水平可能反映内皮激活和功能障碍[29]。此外，Endocan被证明是心力衰竭的独立预测因子[30]，高血压的替代标志物[31]，冠状动脉疾病、冠状动脉缓慢血流[32]、心绞痛和亚临床动脉粥样硬化的标志物[33]。
我们之前广泛的实验研究以及其他人的研究表明，高sENG水平对内皮功能障碍的发展[24]和肝脏代谢[34]具有强烈的潜在负面影响。在这项研究中，我们专注于人类群体。具体来说，我们探讨了MI患者和对照组之间上述内皮功能障碍生物标志物是否存在任何差异。此外，我们分析了这些生物标志物与传统脂质风险因素和吸烟习惯之间的潜在关联。
材料与方法
分析了招募入AMBITION（临床与实验医学研究所急性心肌梗死登记处）登记处的患者数据。该登记处自2017年6月以来收集了所有连续住院MI患者的所有临床和实验室数据[35]。这项观察性研究于2018年6月13日获得布拉格Thomayer医院和临床与实验医学研究所伦理委员会批准，注册号为G-18-52。该项目数据在2023年11月20日至2024年5月14日期间访问和分析（去除了参与者的任何个人信息），同时测量可用冷冻血液样本中的可溶性内皮糖蛋白和其他因子。该研究方法已在先前描述过[36]。简而言之，在医院内，所有患者都接受了详细的健康状况访谈，其他信息则来自医疗记录和实验室研究。定义MI之前已存在的心血管风险因素如下：如果患者报告在MI发病前12个月每天至少吸一支烟，则视为吸烟者；糖尿病史定义为住院时正在使用口服降糖药或胰岛素（本研究排除了使用包括胰岛素在内的药物治疗的患者）；高血压定义为自我报告的高血压和/或住院时使用抗高血压药物（本研究排除了用药患者）。本研究的目的是检查有糖尿病和高血压病史但未接受任何药物治疗的人群。布拉格临床与实验医学研究所机构审查委员会批准了该研究，所有参与者签署了知情同意书。调查符合《赫尔辛基宣言》规定的原则。排除标准为不愿签署知情同意书和年龄超过65岁。
该项目是一项回顾性研究，包括79名既往无心血管病史也未接受过心脏保护药物治疗的MI患者血浆样本。患者在布拉格临床与实验医学研究所心脏病科住院。对照组包括17名年龄匹配的健康志愿者（男女均有），他们是从预防性体检中招募的，以评估研究参数的差异。两组的临床数据，包括年龄、性别、糖尿病、高血压和吸烟习惯均被收集。研究方案经当地机构审查委员会批准，所有患者均签署知情同意书。表1总结了研究中两组受试者的临床特征。
血液样本和分析
所有患者用于实验室分析的血液均在入院次日早晨空腹状态下采集。脂质参数使用全自动酶法（COBAS MIRA S分析仪，罗氏诊断，瑞士巴塞尔）进行分析，使用的酶试剂盒由同一制造商生产。本研究中仅使用以下脂质参数：总胆固醇、LDL、HDL、甘油三酯和非HDL胆固醇。
在本研究中，分析了2020年至2023年间因MI住院且年龄小于65岁的患者数据。布拉格临床与实验医学研究所机构审查委员会批准了该研究，所有参与者签署了知情同意书。调查符合《赫尔辛基宣言》规定的原则。排除标准为不愿签署知情同意书和年龄超过65岁。血液样本在MI患者入院次日早晨或健康对照者定期体检时采集。血液采样在含EDTA的试管中进行，并在室温下以1500g离心15分钟，然后立即分装血浆样品并储存在-80°C下，以备生化和蛋白质组学分析。
表1
对照组和心肌梗死患者临床数据
| 对照组
(n=17)| MI患者
(n=79)| p
--- |---|---|---
年龄| 51.5 ±8.6| 54.1 ±8.9| 0.1599
女性 (%)| 47| 18| 0.0142*
吸烟状态 (%)| 18| 65| 0.0005***
糖尿病 (%)| 0| 8.9| 0.3464
高血压 (%)| 18| 8.9| 0.3753
总胆固醇 (mmol/L)| 5.6 ±0.7| 5.5 ±1.1| 0.6123
甘油三酯 (mmol/L)| 1.2 ±0.3| 1.6 ±1.2| 0.0985
LDL (mmol/L)| 3.6 ±0.6| 3.9 ±1.1| 0.0836
HDL (mmol/L)| 1.6 ±0.4| 1.2 ±0.4| <0.0001****
非HDL (mmol/L)| 4.0 ±0.6| 4.3 ±1.2| 0.1477
BMI| 28.2 ±4.4| 26.6 ±3.6| 0.1116
值为均值±标准差，显著值标有星号，缩写：
MI - 心肌梗死患者，LDL - 低密度脂蛋白，HDL - 高密度脂蛋白，BMI - 体重指数。
内皮功能障碍生物标志物分析
使用夹心酶联免疫吸附测定技术（ELISA）通过Quantikine人内皮糖蛋白/CD105 ELISA试剂盒（R&D Systems，美国明尼苏达州）根据制造商说明测定血浆样本中可溶性内皮糖蛋白（CD105）的浓度。样品未稀释。试剂盒的灵敏度为0.007 ng/mL。使用Multiskan RC ELISA读数仪（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州）在450 nm处测量吸光度值。使用Human Premixed Multi-Analyte Magnetic Luminex试剂盒（R&D Systems，美国明尼苏达州）根据制造商协议测定Endocan、PCSK9、BMP-4和sE-selectin的水平。
统计分析
统计分析使用GraphPad Prism软件版本9.2（GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。临床数据表示为均值±标准差（SD）。内皮功能障碍标志物的实验室数据表示为中位数和四分位距（IQR）。首先对所有数据进行正态性检验，并基于此使用非参数检验进行进一步分析。直接组间比较使用非参数Mann-Whitney检验进行。使用Spearman r和p值确定相关性。线性回归分析使用Beta系数、95%置信区间和p值确定。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
MI患者与健康对照组在总胆固醇、LDL、甘油三酯和非HDL水平方面无差异
如表1所示，MI组中女性比例显著较低，吸烟者比例显著较高。脂质参数分析显示，MI患者与对照组在总胆固醇、LDL、非HDL胆固醇和血浆甘油三酯水平上没有差异。两组在BMI值上也没有差异。相比之下，MI组的HDL水平显著低于对照组。
MI患者的血浆中sENG和Endocan水平显著高于对照组
血浆标志物分析显示，MI患者中的sENG水平显著高于对照组：4.56 (3.97-5.12) vs 3.92 (3.62-4.69)，p = 0.0113（图1A）。同样，MI患者与对照组之间的Endocan水平差异也显著：868.4 (654.4-1631.0) vs 308.3 (245.1-358.0)，p < 0.0001（图1B）。相反，两组之间PCSK9（图1C）、BMP-4（图1D）和sE-selectin（图1E）的水平没有显著差异。
BMI高风险和吸烟MI患者的sENG水平显著更高
根据BMI（超过25 kg/m²视为高风险）和吸烟习惯将MI患者分为两组。高风险BMI的患者（图2A）和吸烟者（图2B）中，sENG显著更高，而Endocan在BMI组（图2C）和吸烟者（图2D）之间没有显著差异。
由于MI组中吸烟者的比例显著较高（表1），我们决定进一步评估。简单线性回归分析最初显示，MI患者的血浆sENG水平显著高于非MI个体（β = 0.59 ng/mL，95% CI [0.15, 1.03]，p = 0.009）。然而，鉴于吸烟是MI和内皮功能障碍的已知风险因素，我们进行了多变量线性回归分析，调整了吸烟状态。
调整吸烟状态后，MI与sENG水平之间的关联不再具有统计学显著性（β = 0.25 ng/mL，95% CI [-0.19, 0.69]，p = 0.256），而吸烟仍是sENG高水平的强烈独立预测因子（β = 0.71 ng/mL，95% CI [0.37, 1.05]，p <0.0001）。调整后的模型解释了sENG水平方差的22%（R² = 0.22），相比未调整模型的7%（R² = 0.07）。
LDL水平仅与MI队列中的sENG和Endocan水平呈弱相关
最后的评估搜索了sENG和Endocan与MI传统风险因素之间的可能相关性。我们发现总胆固醇与sENG（r=0.01902；P=0.8687）或Endocan（r=0.1974；P=0.0989）之间无相关性，甘油三酯与sENG（r= -0.03969；P=0.7301）或Endocan（r=0.06089；P=0.6139）之间无相关性，HDL与sENG（r= -0.06275；P=0.5852）或Endocan（r=0.03664；P=0.7616）之间无相关性，非HDL与sENG（r=0.1785；P=0.1179）或Endocan（r=0.1770；P=0.1398）之间无相关性。
我们在MI患者中发现了LDL水平与sENG（图3A）以及LDL水平与Endocan（图3B）之间的弱、非显著相关性。这两个相关性在对照组中也不显著（图3C，3D）。数据以相关系数和p值形式展示在图3中。
讨论
在我们的研究中，我们首次证明MI幸存者的血浆sENG水平显著高于健康对照组。此外，在幸存者中，吸烟者的sENG水平比非吸烟者高，这表明sENG与这一强大的内皮功能障碍风险因素相关联，并间接表明sENG可能是严重血管损伤的重要标志物。
尽管有重要的科学进展，MI仍然是全球死亡原因的首位[1]。寻找这些病理的高度敏感预测指标因此非常重要。内皮功能障碍标志物似乎在评估冠状动脉疾病的负担方面合理[3]，并且可能为MI带来早期诊断和预后工具[2]。已经研究了一些已建立和新的ED标志物。然而，我们特别关注sENG、Endocan、PCSK9、BMP-4和sE-selectin的水平。
在这项研究中，我们假设上述提到的内皮功能障碍循环生物标志物在首次心肌梗死患者与健康对照组之间会有差异。我们纳入了一组特定的MI患者，他们既往无症状性心血管疾病，且在冠状动脉事件之前未接受心血管治疗。选择这个特定队列的原因基于这样的假设：几类常用于心血管代谢疾病的药物可能会因其多效性效应显著改变循环ED标志物的值和内皮状态[37,38]。因此，这些患者与未接受任何心血管代谢治疗的健康志愿者进行了比较。
图1
对照组和心肌梗死患者内皮功能障碍参数。柱状图表示对照组和MI患者之间sENG（A）、Endocan（B）、PCSK9（C）、BMP-4（D）和sE-selectin（E）的水平。所有数据均以中位数和四分位距表示。Mann-Whitney检验，*p < 0.05，****p < 0.0001。
图2
MI患者血浆中sENG和Endocan水平与BMI和吸烟习惯的关系。柱状图表示MI患者根据BMI（A）和吸烟习惯（B）的sENG水平。柱状图表示MI患者根据BMI（C）和吸烟习惯（D）的Endocan水平。所有数据均以中位数和四分位距表示。Mann-Whitney检验，*p < 0.05，****p < 0.0001。
图3
MI患者和对照组中LDL与sENG和Endocan水平的相关性分析。设计了MI患者中LDL与sENG（A）、MI患者中LDL与Endocan（B）、对照组中LDL与sENG（C）和对照组中LDL与Endocan（D）的线性回归图。定义了Spearman r值。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
MI组和对照组在总胆固醇、甘油三酯、LDL和非HDL水平上没有差异。相比之下，HDL水平存在显著差异。这种现象部分归因于MI患者普遍观察到的次优值以及对照组中女性比例较高。总体而言，这些结果表明主要致动脉粥样硬化脂质参数可能不足以预测无既往心血管事件史患者的MI。
在初步比较中，只有sENG和Endocan在MI组和对照组之间达到了统计学显著性。值得注意的是，已有几篇论文关注了sENG在MI中的作用，但观察结果不一致[39-42]。有趣的是，sENG不仅可能是一个潜在的MI循环生物标志物。已证明高sENG水平会加重内皮功能障碍[22]并诱导炎症标志物的表达[25]。这表明高sENG水平可能通过加重内皮功能障碍和炎症促进MI的进展或表现[43]。值得一提的是，sENG调节血管生成相关蛋白的表达，导致抗血管生成效果[44]。此外，升高的sEng水平与脑部血管生成失调和血管重塑相关[45]。确实，血管重塑，包括新血管生成，在心肌梗死后急性阶段后发生[46]。因此，我们认为升高的sENG水平可能影响心脏中的这种血管生成过程，这是一个值得在未来前瞻性研究中调查的方面。
Endocan被认为是一个潜在的冠状动脉疾病预后工具的生物标志物[2]。一项荟萃分析发现，冠状动脉疾病患者的Endocan水平高于对照组，表明其在反映动脉粥样硬化进展中的潜在作用[47]。有趣的是，与sENG类似，Endocan不仅是MI的生物标志物。广泛接受的观点是，Endocan通过主要贡献于内皮功能障碍参与动脉粥样硬化的形成[29]。此外，本研究的数据表明，在未接受治疗的患者中评估Endocan水平可能有助于反映风险群体中的内皮功能障碍。
我们的研究还评估了BMI高风险、吸烟习惯与MI患者中sENG和Endocan水平之间的关系。分析显示，只有sENG水平，而不是Endocan水平，在BMI超过25 kg/m²的患者中显著更高，并且在吸烟者中发现更显著的增加。应该强调的是，我们的MI组包括的吸烟者数量明显多于对照组。我们的多变量分析还证明吸烟是高sENG水平的独立预测因子。如果我们考虑到吸烟对内皮功能障碍、基质金属蛋白酶（MMPs）上调和斑块不稳定性的贡献[48]，以及MMPs在内皮糖蛋白脱落和sENG水平升高中的作用[12,49]，这是一个有趣的发现。
我们还发现sENG与LDL之间存在弱的非显著相关性，表明sENG相对独立于MI患者的LDL。这与一篇显示在接受心脏导管插入术的慢性冠状动脉疾病患者中LDL与sENG之间无相关性的论文一致[50]。
研究的优势和局限性
我们研究的优势在于强有力的实验数据，这些数据强烈支持我们在一个明确的患者群体中的生物学合理性发现，表明sENG也可能在人类中引起血管损伤的潜力。
尽管如此，我们完全意识到研究的局限性，包括回顾性/横断面设计，这不允许我们可靠地建立因果关系。另一个限制是，sENG测量的样本是在MI的急性期收集的，可能受到此期间发生的急性病理生理变化的影响。另一个限制是我们在此研究中没有完全匹配的对照组。然而，患者和对照组之间的主要致动脉粥样硬化脂质参数没有差异，而且HDL胆固醇最近不被认为是一个抗动脉粥样硬化的脂质因素[51]。
研究的一个重要限制可能是MI和对照组的性别分布及其对sENG水平相关性的潜在影响。然而，我们从一开始就考虑到了这一点。最初，我们进行了统计分析，结果显示无论是MI组还是对照组，男性和女性之间的sENG水平均无显著差异。此外，在分别分析男性和女性时，MI患者与对照组之间的sENG水平差异仍然具有统计学显著性。因此，我们选择将两种性别一起纳入MI和对照组，以增强统计能力和我们发现的生物学合理性。我们可以推断，在MI患者中观察到的升高的内皮糖蛋白浓度突显了其作为增加心血管代谢风险标志物的重要性。
结论
我们首次在患者中证明，sENG可以作为未接受过心血管风险因素治疗的MI患者的内皮功能障碍生物标志物。需要前瞻性研究来确认监测sENG水平在预防和管理内皮功能障碍相关疾病中的价值。
(全文结束)
