LAMP2A调控外泌体生物发生过程中的内体蛋白质组成和膜特性 - 外泌体知识

摘要

内溶酶体系统通过蛋白质降解和介导细胞间通讯的外泌体释放来维持细胞稳态。跨膜蛋白LAMP2A已被发现参与选择性货物装载到外泌体中，即eLLoC。本研究利用人视网膜色素上皮细胞的内体和外泌体组分的质谱分析，研究了LAMP2A如何影响内体蛋白质组成和功能。LAMP2A的缺失改变了Rab GTP酶分布，降低了皮质肌动蛋白的关联，并改变了磷脂酰肌醇动力学，导致内体酸化和成熟增强。这些变化超出了含有ExoSignals（经典靶向基序）的蛋白质的损失，表明LAMP2A广泛参与内体特性的形成。实验验证证实，LAMP2A缺乏将内体命运重编程为降解途径，同时影响外泌体组成。这些发现突显了LAMP2A在协调膜特性、内体成熟和通过外泌体进行细胞间通讯方面的作用，为内体重塑与细胞信号传导和清除途径耦合的机制提供了见解。

引言

内溶酶体系统由通过内吞作用从质膜衍生的细胞内膜性区室组成。这些区室经历从早期内体(EE)到晚期内体(LE)并最终到溶酶体的动态转变。在此过程中，来自反式高尔基网络(TGN)的囊泡运输提供了内体成熟所需的关鍵蛋白质。此外，内体通过其限制膜的内陷形成腔内囊泡(ILVs)，这一过程涉及运输所需的内体分选复合物(ESCRT)以及由CD63、syntenin-1和神经酰胺等替代分子组分介导的非ESCRT机制。当多囊泡内体与溶酶体融合时，这些机制促进蛋白质和脂质的靶向降解；而当多囊泡内体与质膜融合时，则形成外泌体。

我们最近的研究揭示了一种非ESCRT机制，称为"外泌体LAMP2A装载货物"(eLLoC)，可将蛋白质分选到外泌体中。LAMP2A是一种内溶酶体系统中的跨膜蛋白，在ILVs形成过程中定位于内体膜，并与含有特定肽序列（称为ExoSignals）的蛋白质结合，从而将它们捕获在ILVs内部。有趣的是，在观察内体时，我们发现LAMP2A的不对称分布，一些内体富含LAMP2A，而另一些则缺乏LAMP2A，这表明LAMP2A在货物装载中的作用可能仅限于特定的内体亚群。另一方面，对LAMP2A敲除(KO)细胞中外泌体的质谱(MS)分析显示，外泌体组成的变化超出了含有ExoSignal蛋白质的损失，表明eLLoC机制可能比最初估计的更为复杂，涉及意想不到的分子参与者。

为进一步研究这一点，我们对LAMP2A KO后的内吞途径组分进行了MS分析。我们使用亚细胞分级分离技术检查了外泌体和分离的EE和LE的蛋白质含量。这种综合方法提供了LAMP2A在内吞途径和外泌体生物发生中作用的空间和时间分辨率，阐明了eLLoC的分子机制。LAMP2A KO内体的MS显示肌动蛋白解聚和重塑机制增加，表明内体在皮质肌动蛋白中的存在减少。LAMP2A的KO还影响了Rab GTP酶的存在，以及与磷脂酰肌醇信号系统的蛋白质，特别是磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)，表明内体分泌和成熟途径发生改变。此外，实验验证证实了MS功能分析的关键发现。这些发现为LAMP2A在内体动态中的作用及其对细胞间通讯和蛋白质降解的影响提供了关键新细节。

结果

内体组分的特征

我们使用不连续蔗糖梯度分离了内体区室。使用这种方法，可以获得两个组分，一个富含EE标记物EEA1，另一个富含LE标记物Rab7。这些组分缺乏线粒体标记物TOMM20和溶酶体标记物组织蛋白酶B。当使用透射电子显微镜(TEM)比较这两个组分时，图像显示Rab7丰富的区室在其限制膜内有更多的ILVs，这与该组分代表较晚的内体区室一致。

对内体组分进行的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)用于进一步表征组分的蛋白质含量。数据显示，LAMP2A亚型仅在野生型细胞的所有组分中被鉴定出来。代表三个生物重复的维恩图显示，所有组分之间共享超过2700种蛋白质，代表至少94%的所有已鉴定蛋白质。主成分分析显示同一样本组分之间的变异性较低，这证实了重复的相似性。此外，观察到小细胞外囊泡(sEVs)、EE和LE组分沿PC1的清晰聚类，表明每个组分具有独特的蛋白质组谱型。对于sEVs中LAMP2A KO后显著调控的蛋白质(p < 0.05)，有302种下调蛋白质和322种上调蛋白质；在EE中有224种下调蛋白质和165种上调蛋白质；在LE中有251种下调蛋白质和327种上调蛋白质。内体组分中一些调控的蛋白质通过Western blot得到确认。在下调的蛋白质中，sEVs、EE和LE分别有66.34%、68.89%和71.03%含有至少一个ExoSignal（五肽基序）。数据分析还显示，在调控的蛋白质中，sEVs和EE之间有67种共同蛋白质，sEVs和LE之间有88种，EE和LE之间有79种，而所有区室之间仅有18种是共同的。此外，主成分分析(PCA)数据显示EE组分和LE组分最为相似，而LE受LAMP2A KO的影响最大。

LAMP2A KO对小细胞外囊泡和内吞途径相关内体区室的功能影响

为了探索LAMP2A KO对sEVs和内吞途径相关内体区室的功能影响，我们使用基因本体论(GO分子功能、GO生物过程、GO细胞组分)和KEGG通路数据库对LAMP2A KO后上调和下调的蛋白质进行了详细的富集分析。

GO分子功能分析显示，在sEVs中，下调的蛋白质在PDZ结构域结合(GO:0030165)方面表现出显著富集，已知该结构域将膜蛋白锚定到细胞骨架并与其相互作用。此外，sEVs中下调的蛋白质在磷脂酰肌醇结合(GO:0043325)方面富集。在LE中，KEGG分析显示磷脂酰肌醇信号蛋白显著富集，特别是与PI(4,5)P2相关的蛋白质，这进一步表明LAMP2A KO后PI(4,5)P2受到强烈调控。

GO分子功能分析还揭示了Rab GTP酶和Rab相关蛋白质在sEVs中的显著富集。Rab蛋白是囊泡形成、运动和融合的核心调节因子，通常与磷脂酰肌醇协同作用以建立膜特性并指导囊泡运输。其中，Rab27亚型在LAMP2A KO后表现出不同的模式：Rab27b在EE中上调，而Rab27a下调。鉴于Rab27b与外泌体释放密切相关，这种亚型转换与内体命运的转变一致。同时，我们还观察到EE和LE中与肌球蛋白结合的蛋白质富集。肌球蛋白是基于肌动蛋白的马达蛋白，介导内体运输和囊泡融合事件。特别是，肌球蛋白V家族成员以其将内体拴在质膜上的作用而闻名。Rab-肌球蛋白的相互作用提供了一个机制框架，其中Rab重塑直接与驱动囊泡定位和胞吐作用的细胞骨架马达耦合。

GO生物过程分析显示，sEVs下调的蛋白质在多囊泡体蛋白质和神经酰胺生物合成过程调节方面富集，神经酰胺参与内体膜上的ILVs出芽。关于上调的蛋白质，EE在与胞吐作用相关的众多术语方面富集。此外，与高尔基体相关的蛋白质仅在sEVs中上调，而与TOR信号相关的蛋白质仅在LE中上调。

在KEGG通路分析中，除了LE中磷脂酰肌醇信号系统的上调外，LAMP2A KO还导致sEVs组分中与mTOR信号通路相关的蛋白质下调。在LE中，下调的蛋白质与肌动蛋白细胞骨架的调节相关联。

GO细胞组分分析显示与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质在所有组分中均上调。有趣的是，与肌动蛋白细胞骨架通路调节相关的另一组蛋白质也下调。

使用ClueGO分析显示，LAMP2A的KO导致调控的蛋白质聚类在肌动蛋白细胞骨架(在所有组分中上调)、Rab GTP酶和磷脂酰肌醇(在sEVs和LE中上调)、内溶酶体(在EE和LE中上调)和囊泡分泌(在EE和LE中上调而在sEVs中下调)以及神经酰胺(在sEVs中下调)等群组中。

总的来说，我们的研究结果表明LAMP2A缺失在内体区室和sEVs中诱导了协调但不同的变化。在EE中，我们观察到Rab重塑(从Rab27A到Rab27B)、皮质肌动蛋白拴系的丧失以及偏向于胞吐作用的磷脂酰肌醇组成的转变。LE显示出Rab7、v-ATPase/LAMTOR和溶酶体酶的增加，与增强的酸化和成熟一致。最后，sEVs富含Rab GTP酶、肌球蛋白结合蛋白和肌动蛋白相关因子，反映了膜和货物组分的选择性分区。这些数据表明LAMP2A可以影响内体特性，将内体命运从分泌转变为降解，从而将蛋白质组特征与内吞途径中的功能后果联系起来。

LAMP2A KO细胞内体内体区室术语富集分析的实验验证

为进一步确认LC-MS/MS数据分析的功能影响并评估LAMP2A KO对内体的影响，我们从野生型、LAMP2A KO和LAMP2A拯救细胞中分离了这些亚细胞区室。LAMP2A拯救细胞显示出与野生型无法区分的LAMP2A定位以及CD63和EEA1分布。Western blot分析显示，LAMP2A KO导致Rab27a水平下降，而Rab27b水平上升。LC-MS/MS数据最初强调的这种Rab27亚型的差异变化在我们的实验中得到证实。此外，我们观察到包括Rab3、Rab7、Rab8和Rab35在内的其他几种Rab蛋白水平升高，与我们之前的发现一致。重要的是，在KO细胞中恢复LAMP2A的表达将所有Rab蛋白的水平恢复到野生型水平。

此外，LAMP2A KO细胞的内体组分显示出肌动蛋白水平降低。从内体富集组分中进行的肌动蛋白免疫沉淀进一步显示与内体的共沉淀减少，如内体标记物CD63水平降低所证明。使用胰蛋白酶孵育分离的内体进行的蛋白酶抗性测定显示，虽然EEA1和Rab7部分受到保护，但肌动蛋白几乎无法检测到，表明其定位仅限于内体限制膜。肌动蛋白丝的鬼笔环肽标记显示与内体标记物CD63和EEA1的共定位减少，LAMP2A拯救后这一缺陷得到恢复。

为了评估LAMP2A KO细胞中的内溶酶体酸化和组织蛋白酶D活性，我们使用了pH敏感探针以及组织蛋白酶D活性染料。LAMP2A KO增加了两种pH指示剂和组织蛋白酶D报告基因的荧光，表明腔内pH值降低和组织蛋白酶D活性升高。此外，数据还显示酸性、酶活性区室的数量增加。LAMP2A表达的拯救将pH和组织蛋白酶D活性恢复到野生型水平。

为了监测细胞中PI(4,5)P2的水平，我们表达了PI(4,5)P2结合RFP融合蛋白，而对于PI4P，我们表达了单独的GFP标记探针。然后我们评估了这些磷脂酰肌醇探针与内体标记物CD63的共定位。结果显示LAMP2A KO降低了PI(4,5)P2探针的共定位，同时增加了PI4P探针与CD63的共定位。同样，这些效应通过LAMP2A拯救得以逆转。

总体而言，这些验证实验表明LAMP2A缺乏导致内体Rab蛋白群和肌动蛋白关联发生显著变化，表明内体与质膜和分泌途径的关联减少，以及内溶酶体成熟增强。这些发现通过溶酶体酸度和磷脂酰肌醇动态变化得到证实，得到了LC-MS/MS分析观察的支持。

讨论

在本文中，我们展示了LAMP2蛋白的单一亚型LAMP2A的敲除导致内体区室蛋白质组成的显著变化。LAMP2A已与通过分子伴侣介导的自噬(CMA)在溶酶体中选择性降解蛋白质相关联，这是一种涉及识别与KFERQ基序生物化学相关的五肽序列的机制，该序列在约25%的细胞蛋白质中活跃存在。最近，我们还揭示这些组分参与eLLoC，促进蛋白质的分类和装载到外泌体中。本文提供的数据证明LAMP2A KO进一步改变了内体的蛋白质含量，表明LAMP2A在膜特性和内体成熟中具有基本作用。

数据显示LAMP2A KO后，外泌体和EE中与肌动蛋白细胞骨架调节相关的蛋白质增加。例如Cofilin1、Cofilin2和Destrin等蛋白质在LAMP2A KO后上调。这些蛋白质通过结合肌动蛋白并将丝状体切断成小分支发挥作用。相反，在外泌体中，Arp2/3复合物组分ARPC2减少，这是肌动蛋白分支成核所必需的。据报道，围绕内体的肌动蛋白丝抑制内体成熟和沿微管的逆行运动。此外，肌动蛋白丝对内吞作用中的膜弯曲和再循环内体管化至关重要。

我们的结果还表明LAMP2A KO后与内体相关的Rab蛋白质发生重塑。我们在所有分离组分中鉴定出至少41个含有RAS结构域的蛋白质上调或下调。Rab27a及其效应物SYTL4在LAMP2A KO后在EE中减少，而Rab27b则呈现相反趋势。Rab27a及其效应物SYTL4对内体与质膜的对接和融合至关重要，而Rab27b参与内体沿微管的运动。因此，EE中Rab27a/Rab27b比例的降低可能表明EE在细胞外围的存在减少，导致与质膜的融合减少。

LAMP2A KO后内体的一个显著特征是与磷脂酰肌醇信号系统相关的蛋白质调控，主要与PI(4,5)P2相关联。在LE中，激酶如PIP4K2A和PIP4K2B增加。相反，在EE中，PIP4K2B和PIP5K1A均下调。这些变化表明LAMP2A KO后LE中PI(4,5)P2水平升高而EE中降低。PI(4,5)P2在质膜中非常丰富，它通过调节肌动蛋白丝重塑与内吞/胞吐事件相关联。

总体而言，我们的研究为LAMP2A KO对内体和外泌体蛋白质组成和成熟的影响提供了有价值的见解。研究结果表明LAMP2A在膜特性和内体成熟中起着关键作用。与磷脂酰肌醇信号相关的蛋白质调控以及Rab GTP酶组成的改变表明LAMP2A在为内体区室提供特定膜特性方面很重要，有可能影响外泌体分泌和蛋白质降解。与衰老相关的一个重要因素是LAMP2A水平的下降。由于LAMP2A水平在衰老生物体中下降，合理预期LAMP2A表达减少可能影响eLLoC的效率，导致外泌体中蛋白质组成改变，进而可能对其与邻近细胞和组织的通信能力产生负面影响。此外，内体功能的破坏会影响细胞清除机制，导致有害废物积聚、蛋白质降解受损和细胞稳态受损。靶向内溶酶体系统中的关键参与者如LAMP2A可能为旨在维持细胞间通信和细胞稳态的治疗干预提供潜在途径。