摘要
背景
症状性艰难梭菌感染(CDI)可导致显著的发病率和死亡率。相反，患者可能在没有症状的情况下被产毒艰难梭菌定植，称为无症状定植。我们先前证明，艰难梭菌毒素的存在和功能并不能区分儿童的无症状定植和CDI，表明其他因素的影响。本研究旨在探究CDI儿童和无症状定植儿童粪便样本中的肠道微生物组和丁酸盐。
方法
设计：病例对照研究。地点：三级护理儿童医院。参与者和测量：无症状儿童通过核酸扩增检测(NAAT)检测艰难梭菌，若阳性则视为定植(n=50)。还从症状性儿童(通过NAAT检测为艰难梭菌阳性)获取了剩余粪便样本(n=55)。通过16S rRNA测序和液相色谱-质谱法评估微生物组和丁酸盐。
结果
与临床协变量和合并症相比，艰难梭菌症状状态(即无症状定植vs症状性CDI)对肠道微生物表现出最强的差异丰度关联。症状性CDI与埃希氏菌/志贺氏菌(Escherichia/Shigella，Benjamini-Hochberg调整q=3.94×10^-5)、嗜血杆菌(Haemophilus，q=0.022)和吉米杆菌(Gemella，q=0.085)的丰度增加相关，而肠道共生菌如粪杆菌(Faecalibacterium，q=0.041)、布劳特氏菌(Blautia，q=0.041)和双歧杆菌(Bifidobacterium，q=0.063)的丰度减少。我们还观察到症状性CDI参与者的微生物丁酸盐生产者和粪便丁酸盐丰度降低。
结论
无症状艰难梭菌定植和症状性CDI参与者的肠道微生物群和丁酸盐存在差异，表明它们可能在症状发展中起作用。
关键词：毒素，儿科，携带，代谢物
艰难梭菌是一种与显著发病率和死亡率相关的胃肠道病原体。另一方面，由于机制尚不明确，艰难梭菌可以在不引起症状的情况下定植肠道，称为无症状定植。无症状定植率最高的儿童包括癌症、炎症性肠病(IBD)和囊性纤维化(CF)患者，他们也面临其他原因导致腹泻的风险。目前没有测试算法能可靠区分症状性艰难梭菌感染(CDI)和因其他原因腹泻的无症状定植者。尽管艰难梭菌毒素传统上用于诊断测试算法，但我们先前的工作表明，在儿科队列中它们无法区分症状性CDI和无症状定植。此外，与无症状定植相关的相同艰难梭菌菌株和细菌负荷在其他患者中可能与严重疾病相关。这突出了一个重要问题：如果艰难梭菌和毒素在无症状定植和症状性疾病患者之间相似，那么什么因素不同？这个问题对两方面很重要：(1)改进诊断测试和(2)了解影响艰难梭菌病理生理学的保护机制。
尽管发病机制与肠道微生物组密切相关，但关于儿科CDI患者与无症状定植者肠道微生物组和相关代谢物变化的已发表数据很少。先前的研究受限于样本量小或仅在成人中进行。
利用一个特征明确的儿科患者队列，我们比较了症状性CDI和无症状定植儿童的肠道微生物组和丁酸盐水平，以更好地理解这种重要细菌的病理生理学。
方法
研究设计
儿科参与者，年龄1至18岁，于2017年7月至2019年12月在范德比尔特大学摩纳哥·卡雷尔儿童医院前瞻性入组，获得家长知情同意和患者同意。范德比尔特机构审查委员会批准了该研究。数据使用REDCap数据库(REDCap软件，范德比尔特大学)保持保密。
无症状定植队列
患有癌症、CF或IBD诊断的无症状儿童有资格入组。要被视为无症状，参与者必须没有腹泻(Bristol粪便类型6或7)，且未接受艰难梭菌检测或治疗。获取粪便样本，取一份等分试样使用临床实验室的核酸扩增检测(NAAT)检测艰难梭菌。如果NAAT阳性，儿童被视为定植。
症状性队列
有腹泻(24小时内≥3次不成形大便且症状急性变化)并接受临床实验室检测且通过NAAT检测艰难梭菌阳性的症状性儿童入组。这包括先前健康的儿童和其他合并症患者。获得同意后，收集临床实验室的剩余粪便并储存在研究实验室。入组方案比较见表1。
样本处理和临床检测
收集后冷藏粪便，分装后储存在-80°C。对无症状和症状性参与者，使用Illumigene艰难梭菌检测(ARUP实验室)在医院临床实验室进行NAAT，这是一种检测编码毒素B的艰难梭菌基因tcdB的聚合酶链反应检测(灵敏度90%和特异性96%)。在研究实验室通过酶联免疫检测使用Meridian Biosciences的Premier®毒素A和B重复测定毒素存在(灵敏度80.8%，特异性97.5%)。通过Vero细胞圆化测定毒素功能，方法如前所述。
DNA提取和微生物组测序
如前所述，进行基因组DNA提取(Qiagen DNeasy PowerSoil试剂盒)、靶向PCR(16S rRNA基因V4区域)和配对末端测序(Illumina MiSeq 2×250 bp)。
16S rRNA数据处理
16S rRNA序列通过dada2流程(可在
微生物组分析的额外对照队列
从健康对照儿童粪便样本中获取的16S rRNA测序数据先前已发表并可用于本研究(表1)。健康对照也从摩纳哥·卡雷尔儿童医院招募，与无症状定植和CDI患者地理位置相同。
统计分析
大多数统计分析在开源R计算环境中进行。Alpha和beta多样性指标在ASV水平上使用R包vegan计算。Alpha多样性指标的差异关联基于非参数Kruskal-Wallis检验。使用99,999次置换的PERMANOVA评估beta多样性(Bray-Curtis)的显著关联。使用R包MaAsLin2中实现的微生物组多变量线性回归评估元数据与细菌分类群在门、属和ASV水平上的显著关联。我们主要调整了包括年龄、性别、合并症和暴露史(抗生素、酸阻滞剂、住院和手术)在内的协变量，但进行了额外的敏感性分析，其中(1)我们按合并症组分层以确保关联一致，(2)我们调整了协变量的不同子集，包括未调整分析和仅调整年龄、性别和合并症的分析，再次确保发现一致。使用Benjamini-Hochberg程序对不同微生物分类群的多重测试进行校正。根据发现过滤掉存在于<5个样本中的微生物。
如果P值或q值(适当情况下)分别<0.05和<0.10，则认为关联显著。
液相色谱-质谱法测定丁酸盐
从粪便样本中提取的丁酸盐使用丹磺酰肼衍生化，然后使用靶向反相液相色谱-质谱法分析。仪器和提取方法细节见补充方法。定量基于丁酸盐丹磺酰化类似物的单反应监测检测：丁酸盐，m/z 336→171，CE 30；丁酸盐-d5 m/z 341→170，CE 30。数据分析使用Thermo-Finnigan Xcaliber进行，定量水平使用校准曲线确定。样品通过内标(丁酸盐-d5)和粪便重量归一化，得到最终pmol/mg值。使用GraphPad Prism通过Mann-Whitney U检验进行统计分析。
结果
研究人群
研究人群包括50名无症状艰难梭菌定植儿科参与者和55名症状性CDI参与者(表1)。队列的中位年龄为10岁(四分位距(IQR)5-15)，55%为男性。无症状定植队列包括32名(64%)CF儿童、8名(16%)IBD儿童和10名(20%)癌症儿童。比较无症状定植和症状性CDI患者(表2)。症状性儿童年龄较大(中位数13[IQR 5-16] vs 9[IQR 4-12]岁，P=0.025)，且根据入组策略具有不同的合并症谱(P<0.001)。无症状定植儿童更可能在入组前30天内报告使用酸阻滞剂(76% vs 42%，P<0.001)。队列间的抗生素使用相似(54% vs 67%，P=0.23)。C反应蛋白(CRP)值在症状性队列中较高(中位数9.5[IQR 3.4-35.8] vs 2.6[IQR 0.2-7.4]，P=0.047)，但其余实验室值无显著差异。
ELISA和Vero细胞圆化结果与症状状态不符
使用ELISA和Vero细胞圆化评估艰难梭菌毒素存在和功能。该队列的一部分先前已发表。在症状性病例中，60.7%的样本艰难梭菌毒素A/B ELISA阳性，而无症状定植者为39.3%(P=0.32)(补充图1A)。此外，53%的症状性患者Vero细胞圆化检测阳性，而无症状定植者为51%(P=0.88)(补充图1A)。这些结果表明，基于毒素的测试无法区分症状性CDI和无症状定植儿科患者(以下简称艰难梭菌症状状态)。无论症状状态如何，ELISA和Vero细胞圆化阳性均与艰难梭菌丰度增加相关(补充图1B和1C)。丰富度和alpha多样性分析在ELISA和Vero细胞圆化阳性和阴性样本之间没有差异(补充图1D)。
无症状艰难梭菌定植者、症状性患者和健康儿科对照队列的肠道微生物组比较
使用16S rRNA扩增子测序(V4基因区域)进行微生物组分析，样本读取截止值>1000/样本，最低文库大小为1533个读数，90.7%的样本>10,000个读数。
我们观察到，根据艰难梭菌症状状态比较队列时，整体微生物组群落多样性存在显著差异(图1；补充图2)。无症状定植患者基于Shannon(Mann-Whitney U P=0.02352)和Simpson(Mann-Whitney U P=0.00515)指数的alpha多样性/均匀性较高(图1A)。ASV水平的beta多样性显示症状状态的群落组成显著分离(图1B；PERMANOVA P<10^-5)。补充图2中的主要肠道微生物属的堆叠条形图直接可视化了微生物组组成的差异。此外，本研究协变量的beta多样性分析揭示了各种暴露的影响。具体而言，受试者的肠道微生物组因药物史(抗生素和酸阻滞剂使用)、临床干预(住院和手术)和合并症而显著不同(PERMANOVA P<0.1)，但与年龄或性别无关，表明调整其潜在混杂效应的重要性(补充图3)。
个体微生物分类群与艰难梭菌症状状态强烈相关。症状性CDI患者的肠道微生物组以失调微生物扩张和共生菌减少为特征(图2A；补充图4)。与所有调整的协变量相比，艰难梭菌症状状态对肠道微生物表现出最强的差异丰度关联(通过Benjamini-Hochberg调整q<0.1确定)，有6个显著相关的属水平微生物(图2B；补充图4和补充表1)。症状性CDI与埃希氏菌/志贺氏菌(Benjamini-Hochberg调整q=3.94×10^-5)、嗜血杆菌(q=0.022)和吉米杆菌(q=0.085)丰度增加相关，以及粪杆菌(q=0.041)、布劳特氏菌(q=0.041)和双歧杆菌(q=0.063)等肠道共生菌丰度减少。在ASV水平(代表物种或亚物种水平分辨率)确认了这些关联，其中已识别属(Hemophilus、Escherichia/Shigella、Blautia和Bifidobacterium)的成员表现出类似关联。在门水平上，症状性CDI患者肠道微生物中厚壁菌门显著扩张，拟杆菌门显著减少。一些肠道微生物与暴露史显著相关，包括抗生素使用导致未分类梭菌科成员减少(q=0.057)和先前住院导致Epulopiscium减少(q=0.081)。我们的发现表明，在调整人口统计学、暴露和合并症后，无症状定植患者与症状性CDI患者的肠道微生物组显著不同。
这些从无症状到症状性患者的肠道微生物组组成变化，当与健康对照微生物组基线进一步比较时，代表了微生物失调的扩展(图3)。作为正常肠道微生物状态的参考，我们进一步纳入了具有相似年龄和性别特征的健康对照受试者人群(补充表2)。当与艰难梭菌定植患者一起检查时，与无症状患者相比，症状性患者在beta多样性排序中与正常对照受试者的距离进一步扩大(图3A)。在个体肠道微生物属的丰度中也观察到类似的"对照-无症状-症状性"趋势(图3B)。与上述在无症状和症状性患者之间差异丰度的微生物属相比，无症状患者中这些微生物的丰度与对照受试者更相似，而症状性患者则不然。因此，我们的发现表明，与无症状艰难梭菌定植相比，症状性CDI中微生物失调加剧，当两者都与健康肠道微生物组状态对比时。
最后，为确保观察到的关联不是由患者合并症混淆所致，我们进行了涉及特定患者队列的详细二次分析。我们分别分析了IBD和癌症参与者中微生物的差异丰度效应，这两类患者在症状性CDI和无症状定植队列中均有代表(图2；补充表3)。同样，我们通过调整人口统计学和暴露变量进行多线性回归。这些微生物在两个患者队列中具有一致的差异丰度效应。额外的敏感性分析表明，当调整不同的协变量时，肠道微生物与症状状态之间的关联也是一致的(补充图5和补充表4)。具体而言，我们比较了未调整的微生物组-症状关联(不包括协变量)、仅调整年龄、性别和合并症的关联以及完全调整(包括所有协变量；如补充图3所示)的关联，结果高度一致，支持肠道微生物与症状状态的关联对患者合并症或暴露不敏感。这些分析因此证实，我们观察到的关联可能由症状状态驱动，而非合并症谱等混杂因素。
丁酸盐和丁酸盐产生微生物可能是CDI的潜在缓解因素
据报道，丁酸盐和丁酸盐产生肠道微生物在CDI患者中显著减少，实际上可能作为缓解CDI的治疗手段。因此，我们调查了不同症状状态的丁酸盐产生生物和丁酸盐的差异。
我们观察到，与症状状态相比，队列中症状性患者的微生物丁酸盐产生者和丁酸盐浓度均显著减少(图4)。鉴于Singh等人汇总的主要丁酸盐产生者，我们观察到，在调整人口统计学、暴露和合并症后，症状性患者的总丰度显著减少(图4A)。进一步研究属和ASV水平的个体丁酸盐产生微生物表明，大多数与症状性CDI呈负相关(图4B)，尽管只有布劳特氏菌(q=0.041)和粪杆菌(q=0.041；补充表5)在统计学上显著，可能受样本量限制。与对照受试者相比，丁酸盐产生微生物通常丰度降低，症状性参与者往往比无症状参与者表现出更严重的减少(补充图6)。CDI中丁酸盐产生微生物的减少反映在症状性CDI样本中基于LC-MS的丁酸盐减少(图4C)。由于样品间水分含量可能不同，对子集进行了冻干，并重复LC-MS。趋势得以维持，无症状定植参与者携带的丁酸盐浓度约为症状性CDI参与者的10倍(补充图7)。我们的结果支持先前关于丁酸盐在CDI中保护作用的发现。
讨论
CDI是公共卫生威胁，与显著发病率和死亡率相关。尽管是一种毒素介导的疾病，但有报道称，艰难梭菌及其毒素高丰度的患者仍无临床症状，被视为无症状定植。这些患者可能作为传染载体，如果他们因其他原因出现腹泻，则会造成诊断挑战。然而，他们也可能提供有关防止症状性CDI发展的保护因素的见解，并值得针对性研究。
我们之前的工作评估了毒素在无症状定植儿科患者与CDI患者中的作用。毒素是症状性CDI的必要组成部分，因为它们会损害结肠上皮，导致液体分泌和腹泻。与毒素与炎症的关联相反，我们之前无症状定植儿科患者的队列显示，毒素存在和活性与症状性CDI患者相似。同样，在本研究中，毒素存在和活性无法区分症状状态。基于毒素ELISA或Vero细胞圆化的alpha多样性也没有差异。尽管毒素ELISA和Vero细胞阳性反映了样本中艰难梭菌丰度的增加，但先前的研究表明，无症状定植患者可能存在高相对丰度的艰难梭菌但仍无症状，再次表明影响症状状态的非艰难梭菌相关因素的作用。
与我们对艰难梭菌毒素的研究不同，我们发现肠道微生物组和丁酸盐存在显著差异，有效区分了这两种情况。我们的研究结果表明，肠道微生物组可能在症状发展中起关键作用。
在我们的队列中，无症状定植参与者比症状性疾病参与者具有更高相对丰度的常见肠道共生菌，如粪杆菌(q=0.041)、布劳特氏菌(q=0.041)和双歧杆菌(q=0.063)。症状性CDI患者具有更高相对丰度的变形菌门和埃希氏菌/志贺氏菌属。Crobach等人先前评估了成年CDI患者、无症状定植者和健康对照之间的差异，报告称CDI患者具有更高相对丰度的拟杆菌和韦荣球菌，以及瘤胃球菌科家族和放线菌门属的较低丰度。尽管本研究未报告代谢物，但手稿指出，CDI患者中许多低丰度属是已知的短链脂肪酸(SCFA)生产者，包括丁酸盐生产者。Zhang等人还比较了8名成年CDI患者和8名无症状定植者的肠道微生物群。尽管数量比我们的研究少，但他们确认了类似发现，CDI患者的肠道微生物群由更高比例的变形菌门和更低比例的拟杆菌门和厚壁菌门组成。他们还证明，与无症状携带者相比，CDI患者中埃希氏菌/志贺氏菌的比例显著更高(23.9% vs 8.7%，P<0.05)，这在我们的儿科队列中也得到了证实。Zhoe等人对成年ICU患者进行了艰难梭菌定植的纵向研究，并注意到当患者从艰难梭菌阴性转变为艰难梭菌阳性时，SCFA和乳酸产生细菌的相对丰度增加。作者假设肠道微生物组可能通过引发潜在保护性反应(如SCFA产生细菌丰度增加)来应对艰难梭菌定植。
重要的是，我们的肠道微生物组数据集中的趋势在分析特定患者队列(如IBD或癌症)时仍然保持。事实上，症状状态是肠道微生物组最显著的驱动因素，即使考虑包括药物、合并症、年龄和性别在内的各种患者因素。微生物与症状状态的关联在分析中调整哪些患者因素也不敏感。这些共同表明，肠道微生物组与艰难梭菌症状状态强烈且一致相关，即使在具有不同合并症的患者中也是如此。
与Crobach等人的研究一样，传统上与丁酸盐产生相关的门、科和属在我们研究中无症状定植儿童中具有更高相对丰度。一致地，无症状定植儿童的粪便样本中丁酸盐高于症状性疾病儿童。短链脂肪酸，包括丁酸盐，是纤维代谢的主要代谢产物，在肠道炎症中发挥重要作用。丁酸盐可通过增加粘蛋白产生和抗菌肽水平来降低肠道通透性并增强结肠防御屏障，从而预防感染发展。因此，丁酸盐产生细菌的减少可能导致上皮功能障碍和肠道腔内渗透负荷增加，导致CDI中看到的腹泻。丁酸盐的作用已在各种动物和体外模型系统中进行了研究。Fachi等人证明，丁酸盐补充可以在小鼠中预防CDI，这是对肠上皮细胞的直接影响。具体而言，丁酸盐通过增加和稳定缺氧诱导因子1α(HIF-1α)来增加肠细胞对艰难梭菌毒素的抵抗力。HIF-1α减少肠上皮损伤并改善免疫反应；两者都是减轻CDI特征性肠道炎症的相关因素。值得注意的是，尽管丁酸盐已被证明在体外抑制各种艰难梭菌菌株的生长，但它也可能诱导孢子形成和毒素释放，表明需要更好地理解丁酸盐在CDI中的高度复杂作用，特别是如果考虑作为潜在治疗手段。
值得注意的是，其他研究已经证明了可能与艰难梭菌定植和CDI相关的替代代谢途径。Fishbein等人证明，无症状定植患者的微生物组富含梭菌物种，并具有改变的碳水化合物代谢。然而，本研究中无症状队列的定义与我们的研究不同，并包括通过EIA检测毒素阴性的腹泻成年患者。如前所述，毒素的存在或不存在不足以在我们的儿科队列中区分定植和疾病。Fishbein等人的研究可能评估了略微不同的临床场景，即比较有症状但毒素阴性与有症状和毒素阳性的患者，这可以解释我们研究结果之间的差异。最佳诊断无症状定植仍然存在挑战。然而，我们的定义——在无腹泻的情况下检测到艰难梭菌——在该领域中常用。
我们的研究有一些局限性。来自单一儿科中心的患者样本可能不代表更大人群。此外，尽管我们使用严格的临床标准定义CDI，但具有额外合并症的患者腹泻的潜在病因范围很广，因此我们的队列存在误分类偏差的风险，将艰难梭菌定植患者定义为CDI，反之亦然。由于无症状和症状性患者招募的合并症不同(以及由此产生的合并症相关因素，如药物)，也可能存在残余混杂风险。我们认为这些担忧可能是次要的，因为(1)单中心患者招募有利于同质人群，(2)我们的分层分析在不同合并症之间显示出相似、稳健的发现，(3)尽管难以完全考虑，但通过暴露史调整和相关敏感性分析发现减轻了不同干预的混杂，(4)观察到的从无症状到症状性的差异进一步与从正常到艰难梭菌定植、失调的肠道微生物状态的转变一致，因此不太可能纯粹由技术混杂驱动。最后，通过16S rRNA测序进行肠道微生物群存在和功能的分析以及单一粪便代谢物丁酸盐的测量，但肠道微生物组的功能可以通过宏基因组学和代谢组学更全面地捕获，这应在未来研究中解决。
总之，通过比较无症状定植与CDI儿童的肠道微生物组和丁酸盐，我们发现微生物组而非毒素更能区分这两种情况。这些数据还表明，丁酸盐的存在可能在症状性CDI发展中起到保护作用，尽管由于本研究无法推断因果关系，需要进一步评估。
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