测量果蝇的抗衰老效果(PDF) Measuring Anti-aging Effects in Drosophila</em

摘要

导致衰老和年龄相关疾病的主要因素之一是成体干细胞功能的已知衰退。量化成体干细胞的衰老程度对于推进抗衰老机制和开发抗衰老剂至关重要。然而，目前尚无系统的方法来实现这一目标。在本研究中，我们开发了一种使用果蝇中肠模型和两种衰老标志物来定量评估成体肠干细胞衰老程度的方法。首先，在具有所需基因型的果蝇中诱导衰老，并在解剖前7天给予抗衰老剂。然后，使用免疫组织化学测量果蝇中发现的两种肠干细胞衰老标志物（PH3和γ-微管蛋白）的水平。最后，采用荧光显微镜计数衰老标志物的数量并拍摄图像，这些图像使用图像分析软件进行分析。通过这种方法，我们定量分析了抗衰老剂对成体肠干细胞衰老的影响。该方法预计将大大加快抗衰老剂的开发并显著降低与衰老相关研究相关的研究成本。

关键特点

• PH3和γ-微管蛋白可作为定量评估果蝇肠干细胞衰老的可靠标志物。

• 这种发现抗衰老剂的方法涉及衰老诱导、抗衰老剂处理、解剖、固定、抗体染色和结果分析等过程。

• 维生素D与二甲双胍和β-羟基丁酸类似，是一种抗衰老剂。

• 成体干细胞衰老的定量分析将实现抗衰老剂的快速准确识别和功效验证。

关键词

果蝇、抗衰老、维生素D、维生素D受体、衰老标志物、DNA损伤、异常中心体扩增、肠干细胞

背景

成体干细胞由于具有自我更新和生成分化细胞的能力，在组织稳态和再生中起着关键作用。这些干细胞的年龄相关变化与衰老和年龄相关组织疾病密切相关[1,2]。许多研究旨在识别与衰老相关的成体干细胞变化，并开发抗衰老剂以减缓衰老过程[3-8]。尽管研究表明各种因素导致衰老，但在量化这些因素方面存在局限性。目前，尚无统计方法用于量化成体干细胞衰老。

首先，需要一个合适的模型系统来定量研究成体干细胞衰老。果蝇由于其短寿命和可遗传修饰的中肠功能，是广泛用于衰老研究的模式生物，涵盖成体干细胞及其微环境以及与衰老相关的变化研究[2,8,9]。在成体果蝇中肠中，由delta (Dl)标记的肠干细胞(ISCs)是唯一能产生两种不同分化后代的增殖细胞：由强Notch (N)信号诱导的肠细胞(ECs)和由弱N信号激活的肠内分泌(EE)细胞[10]。这四种细胞类型可以使用特定标记物进行识别，例如Dl (ISCs)、磷酸组蛋白H3 (PH3, 分裂中的ISCs)、esg-GFP (ISCs和EBs)、Su-GFP (EBs)、Pdm和Myo-GFP (ECs)，以及Prospero (Pros)和Pros-GFP (EE细胞)[7-8,10]。

其次，使用适当的标志物对于定量评估ISC衰老至关重要。Choi等人使用抗PH3抗体揭示了果蝇ISC分裂随年龄增长而增加的现象，随后的研究也证实了这一点[3,11,12-16]。抗PH3抗体特异性结合丝氨酸10位的磷酸组蛋白H3，这种修饰在有丝分裂期间发生；因此，它被广泛用作识别有丝分裂细胞的标志物[14]。Park等人使用抗γH2AX抗体观察到ISC中DNA损伤积累随年龄增长而增加[17]。抗γH2AX抗体特异性识别并结合丝氨酸137位的磷酸组蛋白H2AvD，这种修饰类似于哺乳动物中的γH2AX磷酸化[17]。Park等人使用抗γ-微管蛋白抗体揭示了ISC和肾干细胞(RSCs)中随年龄增长发生的异常中心体扩增[14,15,18]。抗γ-微管蛋白抗体特异性识别并结合γ-微管蛋白，这是真核细胞分裂中微管成核和组织的关键蛋白[14,15]。

第三，需要足够的衰老和年龄相关条件来定量研究成体干细胞衰老。已知在25°C下饲养60天的果蝇和在29°C下饲养45天的果蝇与年轻果蝇相比，可作为有效的衰老模型[14-17]。此外，内源性氧化应激催化酶杂合突变果蝇模型是广泛使用的年龄相关模型[14,18]。

第四，适当的抗衰老剂对于定量评估其对成体ISCs的影响至关重要。先前研究表明，二甲双胍(一种常用于管理2型糖尿病的药物)和β-羟基丁酸(一种在禁食、长时间运动或低碳水化合物饮食期间产生的酮体)表现出抗衰老特性[15,19]。最近的研究表明，维生素D (VitD)合成和维生素D受体(VDR)表达随年龄下降与年龄相关疾病有关[16]。然而，很少有研究探索VitD/VDR在成体干细胞中的作用，这突显了进一步相关研究的必要性。在本研究中，通过利用果蝇ISCs的年龄标志物和年龄相关条件，我们旨在提供一种详细而精确的方法来定量测量成体干细胞衰老。该方法可用于抗衰老剂开发和功效研究的定量分析，这将有助于降低研究成本并缩短未来抗衰老领域的研究周期。

材料和试剂

生物材料

1. Oregon-R (Bloomington果蝇资源中心, BDSC, Bloomington, IN, USA, #5)
2. 催化酶杂合突变果蝇 (Catn1突变体) (BDSC, 目录号: 4014) [20]
3. UAS-hr96-RNAi系 (Vienna果蝇RNAi中心, VDRC, Vienna, Austria, 目录号: 330288, 目录号: 10958)
4. Myo1A-Gal80ts果蝇，由B.A. Edgar提供
5. 大鼠抗GFP抗体 (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan, 目录号: 04404-84)
6. 兔抗磷酸组蛋白H3 (PH3) (Millipore, Billerica, MA, USA, 目录号: 06-570)
7. 小鼠抗γ-微管蛋白 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 目录号: T6557-.2ML)
8. 羊抗大鼠FITC抗体 (Jackson ImmunoResearch, 目录号: 415-095-166)
9. 羊抗兔Alexa Fluor® 647抗体 (Jackson ImmunoResearch, 目录号: 305-605-003)
10. 羊抗小鼠Cy3抗体 (Jackson ImmunoResearch, 目录号: 205-165-108)

试剂

1. 电子显微镜级16%甲醛水溶液 (Electron Microscopy Science, 目录号: 15710)
2. 10×磷酸盐缓冲液(PBS) (Ambion, 目录号: AM9624)
3. 甲醇 (Sigma-Aldrich, CAS号: 67-56-1)
4. 10% Triton X-100 (Millipore, CAS号: 9036-19-5)
5. 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Molecular Probes, 目录号: D1306)
6. Vectashield (Vector Laboratories, 目录号: H-1000-10)
7. 1α,25-二羟基维生素D3, D1530 (VitD) (Sigma-Aldrich, 目录号: D1530)
8. 超纯水 (Welgene Inc., 目录号: ML 019-02)
9. 丙酸 (Junsei Chemical Co., CAS号 79-09-4)
10. 丁基-4-羟基苯甲酸 (Junsei Chemical Co., Ltd., CAS号 94-26-8)

溶液

1. 标准食物(见配方)
2. 维生素D食物(VitD)(见配方)
3. Bokinin(见配方)

配方

1. 标准食物

• 蔗糖 10% (w/v) 100 g
• 玉米粉 7% (w/v) 70 g
• 酵母 2% (w/v) 20 g
• 琼脂 1% (w/v) 10 g
• 丙酸 0.5% (v/v) 5 mL
• Bokinin 0.3% (v/v) 3 mL
• 水 79.2% (v/v) 1 L

2. 维生素D食物(VitD)

• 10 mM维生素D 100 nM (v/v) 0.1 mL
• 标准食物 n/a 9.9 mL
• 总计 n/a 10 mL

3. Bokinin

• 丁基-4-羟基苯甲酸 10% (v/v) 10 g
• 乙醇 n/a 70 mL
• 水 n/a 30 mL

实验室用品

1. 微量离心管 (Axygen, 型号: MCT-175-X)
2. 显微镜载玻片 (Paul Marienfeld GmbH & CoKG, 型号: 31593)
3. 显微镜盖玻片 (24 × 32 mm, Deckglaser, 型号: HSU-0101172)
4. Tip 20 μL (Axygen, 型号: TF-20-RSm TF-200-R-S, TF-1000-R-S)
5. Vonetex乳胶手套 (Hartalega Sdn. Bhd.)

设备

1. 显微镜 (Carl Zeiss Inc., 型号: Axioskop 2 Plus)
2. 好氧培养箱 (Sanyo, 型号: MIR-254-PK)
3. Sigma Plot 14.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)
4. 配备Axiocam 208彩色相机的立体显微镜 (Zeiss, 型号: Stemi 508)
5. 配备AxioCam MRm的荧光显微镜 (Zeiss, 型号: Axioplan2)
6. 精密镊子 (Techni-Tool Tweezer Ni-Cr-Mo超合金, 5型, Techni-Tool, Worcester, PA; 目录号: 33-04594-01)
7. 单轨道摇床 (Daeil biotech., 型号: PM-6249)

软件和数据集

1. AxioVision Rel. 4.8软件 (Carl Zeiss Inc.)
2. SigmaPlot 14.5软件包 (Systat, Software Inc., San Jose, California, USA)

实验步骤

以下，我们描述了使用温度控制基因表达、免疫化学和喂养实验，通过果蝇中肠测量抗衰老剂对成体肠干细胞影响的逐步程序。除非另有说明，本方案中的所有洗涤步骤均使用800 μL进行。

A. 果蝇收集

1. 培养条件：所有果蝇品系在25°C下饲养，在12/12光暗(L:D)周期下提供标准玉米粉-糖蜜饮食。为避免所有瓶中的幼虫过度拥挤，在其生命周期内每2-3天将50-60只成体果蝇转移到新的食物瓶中。
2. 所用果蝇的基因型：

a. Myots >GFP果蝇是通过将Myo1A-GAL4/CyO;UAS-GFP,tub-Gal80ts /TM6B (Myots)雌性和Oregon-R雄性杂交获得的。

b. Myots >GFP+Catn1果蝇是通过将Myots雌性和Catn1突变雄性杂交获得的。

c. Myots >GFP+hr96Ri果蝇是通过将Myots雌性和UAS-hr96Ri(#330288或#10958)雄性杂交获得的。

Gal80ts技术用于在特定发育阶段和组织中敲低hr96(人类VDR的同源物)[21]。实验果蝇在成年期前在22°C下饲养。对于年轻成体的收集，我们使用1-3日龄果蝇，将其转移到29°C环境中45天以激活GAL4/Gal80系统，并使用UAS-RNAi进行基因敲低。有关GAL4/GAL80系统的更多细节，请参见[22,23]。本文所述结果使用雌性果蝇获得。

B. 衰老和年龄相关条件诱导

1. 衰老条件：将1日龄Myots >GFP果蝇转移到29°C环境中45天以诱导衰老。
2. 年龄相关条件：将1日龄Myots >GFP+Catn1和Myots >GFP+hr96Ri果蝇转移到29°C环境中10天以诱导年龄相关条件(催化酶突变)。

C. 维生素D喂养

为测量VitD的抗衰老效果，用100 nM VitD[16,24]处理3日龄Myots >GFP、Myots >GFP+Catn1和Myots >GFP+hr96Ri或38日龄Myots >GFP果蝇7天，条件为29°C避光(图1)。每两天将果蝇转移到新的食物瓶中。

(图1. 维生素D给药过程。3日龄Myots >GFP、Myots >GFP+Catn1和Myots >GFP+hr96Ri或38日龄Myots >GFP果蝇在标准食物中接受100 nM VitD处理7天，条件为29°C避光。)

D. 肠道解剖

为进行免疫染色而解剖完整的肠道，使用二氧化碳麻醉成体果蝇。小心地用解剖镊子移除果蝇头部，轻轻抓住胸部，小心地拉腹部后端，从嗉囊到直肠取出完整的中肠(图2)。

(图2. 免疫染色用完整肠道解剖。10日龄Myots >GFP、Myots >GFP+Catn1和Myots >GFP+hr96Ri或45日龄Myots >GFP果蝇在孔载玻片中用1× PBS解剖。将十个完整的肠道放入含1×PBS的微量离心管(1.5 mL)中，置于冰上，随后立即固定。)

E. 固定

1. 在冰上解剖完整的成体肠道。
2. 在单轨道摇床上用4%甲醛在1× PBS中固定整个肠道30分钟，避光。
3. 随后，在4%甲醛中用50%、75%、87.5%和100%甲醇脱水5分钟，并在1× PBST (1 × PBS + 0.1% Triton X-100)中用50%、25%和12.5%甲醇复水5分钟。
4. 然后，用1× PBST洗涤三次，每次20分钟。

F. 免疫化学

以下程序用于使用抗PH3 (1:1,000)、抗γ-微管蛋白(1:1,000)和抗GFP (1:1,000)抗体进行免疫染色，这些抗体显示分裂ISCs中中心体数量随年龄增加。通常，在10日龄Myots >GFP的有丝分裂ISCs中检测到两个中心体，但在45日龄Myots >GFP中也观察到具有两个以上中心体的有丝分裂ISCs(图3)。

(图3. 果蝇中肠肠干细胞(ISCs)中年龄相关的中心体扩增(CA)增加。10日龄(左图)和45日龄(右图)Myots >GFP的肠道用抗PH3(白色)、抗γ-微管蛋白(红色)和抗GFP(绿色)抗体以及DAPI(蓝色)染色。原始放大倍数为400×。)

1. 在4°C下用一抗在1× PBST中孵育样品过夜。
2. 用1× PBST洗涤三次，每次20分钟。
3. 在25°C下用二抗和DAPI(细胞核, 1:1000)在1× PBST中孵育样品1小时。
4. 再次用1× PBST洗涤肠道三次，每次20分钟。
5. 使用Vectashield封片。
6. 使用Axioskop 2 Plus显微镜分析样品。
7. 计数整个中肠中具有中心体(≤2或≥3)的PH3+细胞数量。

数据分析

为PH3+细胞的定量分析，对整个肠道中的细胞进行计数。为定量分析中心体扩增，确定整个中肠中每个PH3+细胞的γ-微管蛋白染色斑点数量(表1)。我们统计整个中肠中PH3+细胞的数量，并通过中心体扩增(CA, >2)量化这些有丝分裂ISCs的频率，如图4所示。量化数据表示为平均值±标准误差。使用学生t检验确定显著差异。使用Sigma Plot 14.5分析标准误差[14]。

(图4. 果蝇中肠肠干细胞(ISCs)中PH3+细胞数量和中心体扩增(CA)的年龄和年龄相关增加。10日龄Myots >GFP、45日龄Myots >GFP(年龄条件)、10日龄Myots >GFP+Catn1(年龄相关条件)和10日龄Myots >GFP+Hr96Ri(年龄相关条件)的肠道用抗PH3(白色)、抗γ-微管蛋白(红色)和抗GFP(绿色)抗体以及DAPI(蓝色)染色。对整个肠道进行计数，定量分析PH3+细胞数量和整个中肠中每个PH3+细胞的γ-微管蛋白染色斑点。)

方法验证

本方案用于测量果蝇成体肠干细胞中抗衰老效果，应用于以下研究文章：

• Park等人[16]。维生素D和维生素D受体在果蝇中肠中的抗衰老作用。Aging (Albany NY)。(图3A, B和6A-D)。

• Park等人[17]。年龄和氧化应激诱导的果蝇肠干细胞DNA损伤，以GammaH2AX为标志。Exp Gerontol。(图1A-C)。

• Na等人[13]。二甲双胍的机制：抑制果蝇中肠干细胞中的DNA损伤和增殖活性。Mech Ageing Dev。(图1-3)。

• Park等人[14]。果蝇中肠衰老干细胞中中心体扩增增加。Biochem. Biophys. Res Commun。(图1和2)。

• Na等人[15]。二甲双胍通过AKT/TOR通路抑制果蝇中肠干细胞的年龄相关中心体扩增。Mech Ageing Dev。(图1, 2B-D, 和3A, C)。

• Park等人[5]。肠细胞DNA损伤反应的缺陷加速果蝇肠干细胞衰老。Aging (Albany NY)。(图3B)。

• Park等人[19]。酮代谢物β-羟基丁酸在果蝇肠干细胞中的抗衰老作用。Int J Mol Sci。(图1和2)。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1. 实验中使用的果蝇肠道必须从嗉囊到直肠(包括马氏管)完整解剖。肠道解剖过程中的轻微伤口可能导致肠干细胞分裂，增加整个肠道中PH3+细胞的数量。
2. 果蝇肠道解剖必须尽可能快速进行；在本研究中，每次实验的解剖时间在30分钟内。
3. 在衰老研究中，维持恒定的成体果蝇生长条件很重要。特别是，维持温度、湿度和食物摄入量很重要。

故障排除

问题1：γ-微管蛋白信号弱。

可能原因：γ-微管蛋白信号非常小。

解决方案：首先在更高显微镜放大倍数下检查PH+细胞，然后计算细胞中γ-微管蛋白的丰度。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会(NRF)基础科学研究中心计划资助，该计划由教育部资助(RS-2023-00243729)。我们感谢Bio-Render提供图形概述。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

收稿日期：2025年02月03日；接受日期：2025年04月07日；在线发表日期：2025年04月24日；正式发表日期：2025年05月05日

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【全文结束】