基于微量热泳动技术的片段药物发现靶向肺炎克雷伯菌和大肠杆菌IspE酶研究

背景： 抗菌药物研发迫切需要创新策略以应对多重耐药病原体日益增长的威胁。2-C-甲基赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径在许多致病菌中必不可少而在人类体内缺失，代表了一个极具吸引力的选择性抗菌靶点来源。在此途径中，IspE酶是抑制剂开发的有希望候选靶点。

方法： 我们筛选了一个富含卤素的片段库，以鉴定肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，简称Kp）和大肠杆菌（Escherichia coli，简称Ec）IspE的抑制剂。通过生化测定验证命中化合物，随后进行构效关系（SAR）研究以优化片段的抑制活性。进行作用机制实验以确定酶抑制的机制。

结果： 筛选鉴定出一个类片段化合物1及其他几个在微摩尔浓度下抑制Kp IspE和Ec IspE的命中化合物。构效关系分析生成了活性增强的优化片段。作用机制测定显示，这些片段相对于天然底物4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖醇（CDP-ME）表现为竞争性抑制剂。

结论： 这一新鉴定的片段类别为开发IspE抑制剂提供了良好基础。研究结果突显了片段筛选方法在发现靶向MEP途径的新型抗菌剂方面的实用性。

关键词： IspE，片段药物发现，肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，MEP途径

引言

2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）（图1）途径是一种代谢途径，将甘油醛3-磷酸（G3P）和丙酮酸转化为通用异戊二烯前体异戊烯二磷酸（IDP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMADP）。这些前体作为异戊二烯生物合成的构建模块，异戊二烯是一大类具有重要功能的天然产物家族，包括维生素、醌类、类固醇以及具有关键细胞功能的次级代谢物。该途径通过七个酶促步骤进行，由DXPS、DXR、IspD、IspE、IspF、IspG和IspH酶催化。这些酶中的每一个都代表潜在的抗菌药物靶点，因为该途径在许多致病菌如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中不可或缺，但在人类体内缺失。肺炎克雷伯菌对抗生素耐药性的快速发展近年来引发了重大健康问题，导致迫切需要具有新颖作用机制的新型抗菌化合物。

尽管MEP途径下游产物发挥着重要功能，但迄今为止报道的抑制剂却很少。本文聚焦于该途径中的第四个酶，即4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶（IspE）。

先前研究已探索了几类化合物作为潜在IspE抑制剂，但许多未能成功转化为全细胞功效。少数报道的IspE抑制剂结合到IspE的CDP-Me结合口袋，通常位于胞苷结合位点（图2）。化合物A和B显示出有希望的抑制活性，但由于全细胞测定中缺乏生长抑制，仍需进一步优化。针对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌IspE，化合物A的IC50值分别为4.73±1.19μM和7.7±1.45μM。化合物B也针对大肠杆菌和鼠疫耶尔森菌进行了研究，记录的IC50值分别为5.5μM和6μM。例如，通过整合计算机虚拟筛选和体外高通量筛选发现的片段和非底物样抑制剂已显示出有希望的配体效率和有利的理化特性，但在有效抑制细菌生长之前仍需大量优化。最近针对同源物（包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌）的基于结构的研究揭示了底物结合口袋中的细微结构差异，特别是鲍曼不动杆菌IspE中更紧凑的疏水亚口袋，表明抑制剂设计必须考虑物种特异性差异。此外，针对恶性疟原虫IspE的研究已从初始命中进展到具有可测量生化效力（IC50~53μM）和令人鼓舞的全细胞活性（IC50~0.82μg/mL）的苯并咪唑衍生物（化合物19），代表了连接生化抑制和细胞功效的重大进展。最后，针对大肠杆菌IspE的片段虚拟筛选产生了一类对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌有效的新型抑制剂，为平衡酶选择性和抗菌活性提供了重要见解，尽管细胞毒性仍是一个问题。来自其他系统的证据也为我们提供了方法指导，突显了物种特异性结构差异、将酶基础效力转化为全细胞功效的需求以及管理脱靶毒性如何塑造未来抑制剂设计和优化。

本研究旨在鉴定结合到肺炎克雷伯菌IspE（KpIspE）而不模拟胞苷部分的片段，以扩展可用抑制剂的谱系。片段药物发现（FBDD）是一种广泛使用的技术，利用生物物理测定检测"片段分子"与特定靶标的弱结合。检测到的片段命中为生成小分子抑制剂提供了有效起点。片段的初始鉴定可通过多种生物物理方法实现，如热迁移、微量热泳动（MST）、表面等离子共振和核磁共振波谱。

材料与方法

通过MST进行片段筛选

微量热泳动（MST）（序列号201709-BR-N024，Monolith NT.115微量热泳动仪，NanoTemper Technologies GmbH）按照NanoTemper Technologies GmbH制造商的标准协议进行，使用Monolith His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation试剂盒。所有化合物使用的缓冲液为HEPES（50 mM）、MgCl₂（5 mM）和Tween（0.05%），pH值7.6。蛋白浓度为50 nM，配体在2 mM浓度下测试。对每种化合物仅测试一个浓度，并与已知以Kd值3.70μM结合到KpIspE的标准品进行比较。我们选择了十个最接近标准品范围的化合物，并测定其Kd值以确认结合。

用于Kd测定的微量热泳动

微量热泳动（MST）（序列号201709-BR-N024，Monolith NT.115微量热泳动仪，NanoTemper Technologies GmbH）按照NanoTemper Technologies GmbH制造商的标准协议进行，使用Monolith His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation试剂盒。所有其他化合物使用的缓冲液为HEPES（50 mM）、MgCl₂（5 mM）和Tween（0.05%），pH值7.6。蛋白浓度为50 nM，配体在最高可溶浓度下测试，该浓度在测定条件下对大多数化合物为2 mM。使用配体储备液（水中）在HEPES缓冲液中稀释进行1:1的16个样品配体稀释。使用非疏水毛细管。在每个样品前进行预测试以检查标记和化合物荧光，随后进行Kd测定。每个样品在室温下孵育15分钟后测量，并在MO Control version 1.6中分析。

KpIspE IC50测定

测定在384孔板（Corning）中进行，带有透明平底。测定缓冲液A（总体积30μL）包含200 mM Tris盐酸盐，pH 7.6（含20 mM KCl、10 mM MgCl₂、10 mM DTT）、2 mM NADH、2 mM磷酸烯醇丙酮酸、0.2 U丙酮酸激酶（PK）、0.2 U乳酸脱氢酶（LDH）和0.3μM肺炎克雷伯菌IspE。测定缓冲液B包含200 mM Tris盐酸盐，pH 7.6、2 mM ATP和0.6 mM CDP-ME。化合物储备液在DMSO中配制（20mM），并在96孔板中进一步稀释至Tris HCl缓冲液中浓度为1.3 mM，使测定起始浓度为120μM。稀释系列以1:2的稀释步长进行，覆盖测定中约120μM至0.23μM的浓度范围。如下测试测试化合物对光度活性抑制测定中辅助酶的影响：第1孔作为空白，第3孔作为阳性对照。将测定缓冲液A（30μL）转移至第1、3、5、7等孔。将化合物（6μL）添加至第5、7、9、11等孔。将Tris HCl（30μL）转移至第1孔，将缓冲液B（30μL）转移至第3、5、7、9等孔以启动反应。将384孔板离心1分钟。在酶标仪（SpectraMax5，Molecular Dynamics）中于340 nm处室温光度监测反应。使用Dynafit程序通过非线性回归方法评估初始速率值。CDP-ME用作起始底物，按照先前描述合成和纯化。KpIspE按照先前报道获得和纯化。

竞争性结合测定

测定在384孔板（Corning）中进行，带有透明平底。测定缓冲液A按上述测定配制，缓冲液B按上述配制，含不同量的ATP（1400–43.75 mM）或CDP-ME（700–21.875 mM）。化合物储备液在DMSO中配制（20 mM），并在96孔板中进一步稀释至Tris HCl缓冲液中浓度为1.3 mM，使测定起始浓度为120μM。抑制剂在DMSO中的稀释系列（1:2）覆盖约700–21μM的浓度范围。保持抑制剂浓度恒定，同时改变CDP-ME或ATP的浓度。将不含CDP-ME的测定缓冲液B（30μL）转移至A行和C行的第3、5、7、9、11孔，而第1列中加入57.6μL。向第1列A行和C行中加入2.4μL 100 mM CDP-ME。对第3、5、7、9和11列进行连续稀释。将不含ATP的测定缓冲液B（30μL）转移至E行和G行的第3、5、7、9、11孔，而第1列中加入56.6μL。向第1列E行和G行中加入3.4μL 100 mM ATP。对第3、5、7、9和11列进行连续稀释。化合物储备液按上述程序配制，使起始浓度为120μM–1.875μM。向每个孔中加入6μL化合物储备液。向反应孔中加入缓冲液A（30μL），并使用与上述相同IC50测定的Pherastar进行读数。

化学合成

用于化学合成和生物评价的所有试剂均购自商业供应商，未经进一步纯化即使用。合成中使用的起始化合物纯度足够，因此无需进一步纯化。市售可得的筛选化学品购自Sigma Aldrich，并在使用前通过LCMS评估纯度达到95%或更高。所有化学产率指纯化后的化合物，且未经优化。使用TLC硅胶60 F254铝板监测反应进程，并通过254 nm紫外线可视化。使用自动化闪式色谱系统CombiFlash® Rf（Teledyne Isco）配备RediSepRf硅胶柱进行柱色谱。使用UltiMate 3000半制备系统（Thermo Fisher Scientific）配备nucleodur® C18 Gravity（250 mm × 10 mm, 5 μm）柱进行制备型RP-HPLC。¹H和¹³C NMR谱在Bruker Avance Neo 500 MHz（¹H, 500 MHz; ¹³C, 126 MHz）上记录，配备prodigy低温探头系统。化学位移以ppm单位记录，以残余溶剂峰为参考（DMSO-d6, δ = 2.50, 39.52）。分裂模式描述表观摩尔性，指定为s（单峰）、br s（宽单峰）、d（双峰）、dd（双峰双峰）、t（三重峰）、q（四重峰）、m（多重峰）。耦合常数（J）以赫兹（Hz）给出。使用Ultimate 3000-MSQ LCMS系统（Thermo Fisher Scientific）进行最终化合物的低分辨率质谱分析和纯度控制，该系统由泵、自动进样器、MWD检测器和ESI四极杆质谱仪组成。用于生物测定的所有化合物纯度≥95%。最终产物在高真空下干燥。更多信息可在支持信息中找到。

酰胺形成的通用程序

向含有DMF和Cs₂CO₃的微波管中加入适当的烟酸或吡啶甲酸及相应氨基化合物。将所得溶液在50°C下搅拌过夜。随后加入水和乙酸乙酯，提取所得溶液（3次）。有机层用弱酸性水（pH 4–5）洗涤（3次），然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。随后，合并的有机层在减压下干燥，残渣用甲醇和乙醚洗涤（3次）。最终产物通过柱色谱纯化。

结果

本研究中，我们报告了鉴定出对KpIspE具有相对良好结合亲和力的片段命中化合物1，并进行了构效关系（SAR）研究以进行优化。我们使用微量热泳动（MST）检测片段与KpIspE蛋白的结合。MST筛选程序详见支持信息。片段药物发现通常从筛选低分子量（<300 Da）库开始。为此，我们使用了包含198种化合物的富含卤素的片段库。MST筛选得到片段命中化合物1，其Kd值为213μM，IC50值为124.0±1.13μM。化合物1因其结构修饰潜力而成为一个有吸引力的起点。为确定KpIspE抑制的关键结构特征并优化活性，我们进行了SAR研究。

我们首先通过筛选一系列市售类似物对KpIspE的抑制活性来启动SAR研究。第一组化合物（2–14）保留了五元杂环，同时引入了可变取代基（表1），以确定溴的重要性以及吡咯环本身的重要性。第二组化合物具有六元环（表2），以确定在保持单个氮原子的同时增大环尺寸是否能增强活性。

首先，我们改变了吡咯环上的官能团（2–7）。在化合物2–4中，将溴替换为氯（2）、硝基（3）和甲基（4）取代基。尽管溴（1）活性最高，但硝基类似物2仅显示活性轻微下降。化合物5、6和7在不同位置具有甲基。在这些甲基取代衍生物中，仅具有二甲基的7显示出比1更强的活性。接下来，我们改变了五元环以确定吡咯骨架中氮原子的重要性。化合物8和9用氧和硫原子替换了氮，仅8对KpIspE显示出活性。化合物9和10也在氮位置用硫原子，尽管10被氨基和氯取代并为甲基酯。化合物10也对KpIspE显示出抑制活性，尽管低于化合物1。化合物11–14探索了噻唑作为核心结构。选择噻唑是因为其具有广泛研究的多样化生物活性。有趣的是，溴代衍生物（11）是唯一无活性的噻唑，而12、13和14显示出中等活性。

接下来，我们聚焦于吡啶基环（15–26）。化合物19、20、22–26市售不可得，按如下方式合成（方案1）。将适当的吡啶甲酸或烟酸在50°C下与相应伯胺或仲胺反应12小时。我们为该系列选择化合物15–26，因为它们保持了氮原子，同时将1的五元环扩展为六元环。吡啶甲酸（15–20）和烟酰酸衍生物（21–26）先前也已证明具有抗菌活性。吡啶甲酸衍生物均显示出良好的抑制活性，除19和20外，其IC50值>500μM（表2）。化合物16–18比化合物1更活跃，其中17是最活跃的吡啶甲酸衍生物，IC50值为84.6±4.9μM。

烟酰酸21和烟酰胺衍生物22–26在5-位具有溴，在2-位具有氨基。令人惊讶的是，这些衍生物中仅化合物21和25具有活性，25的IC50值为82.70±1.6μM（表2）。

几种类似物显示出良好的KpIspE抑制活性，IC50值在82.7±1.6至306.4±1.2μM之间。化合物7是唯一比1更活跃的五元环衍生物，IC50为107.4±11.6μM，尽管其他几种六元环衍生物更活跃。与1相比活性增强的化合物还针对大肠杆菌IspE（EcIspE）进行了活性评估。EcIspE的结合口袋在结构上与KpIspE相似，尽管EcIspE已被更广泛研究。母体化合物1（112.7±1.91μM）和化合物17（83.1±1.1μM）显示出抑制活性，但令人惊讶的是其他化合物均无活性，17比1更活跃（表S1）。

IspE催化CDP-ME向CDP-MEP的ATP依赖性磷酸化，利用两种底物ATP和CDP-ME。为了解化合物1对ATP和CDP-ME底物酶动力学的影响，我们进行了作用机制研究。结果以Lineweaver-Burk图绘制（图3），表明化合物1与CDP-ME竞争，与ATP非竞争。

这一发现表明化合物1与KpIspE活性位点的CDP-ME竞争。由于对靶标的亲和力不是我们在片段药物发现过程中考虑的唯一方面，我们还关注了活性化合物的理化特性（表3）。cLogP、cLogS和cLogD分数使用StarDrop版本7.0.1.29911计算，疏水性配体效率（LLE）值使用预测的cLogP和IC50值计算（LLE = pIC50 – cLogP）。

在本研究中，我们使用片段药物设计方法鉴定有希望的IspE抑制剂。通过MST筛选小型富含卤素的片段库，鉴定出化合物1。通过添加两个甲基（7）以及将五元环扩展为六元环（16、17和25），成功优化了该片段。这四种化合物的预测LLE均在理想范围内（~5−7）。考虑到这些因素以及17相对于1改善的KpIspE IC50，我们认为这是总体上最佳的片段。此外，17对Kp和EcIspE均显示出增强的活性，可在片段生长过程中进一步优化。还表明1与CDP-ME竞争但与ATP非竞争，该片段也被考虑用于进一步优化。这些结果为进一步开发更活跃的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌IspE抑制剂奠定了基础。作为片段药物设计的下一步，这些初始命中可通过片段生长和延伸策略推进，以提高结合亲和力、选择性和理化特性。此类优化工作对于将这些早期片段转化为在全细胞测定中具有抗菌活性的有效类药物抑制剂至关重要。

致谢

我们感谢图宾根大学的Frank Boeckler教授提供富含卤素的片段库。作者感谢HIPS的技术人员提供技术支持，特别是Simone Amann、Jeannine Jung和Jannine Seelbach。作者还要感谢汉堡食品科学学院食品化学研究所的Boris Illarionov博士和Markus Fischer教授为生物测定提供了必要的试剂。D.J.W.获得玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动博士后奖学金资助，协议号101103471。D.W.获得欧盟"地平线2020"研究和创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动资助，协议号860816。MepAnti项目支持。