小鼠缺血持续时间与脑梗死体积对海马热休克蛋白-70表达的半定量分析Semi-Quantitative Analyses of Hippocampal Heat Shock Protein-70 Expression Based on the Duration of Ischemia and the Volume of Cerebral Infarction in Mice

小鼠缺血持续时间与脑梗死体积对海马热休克蛋白-70表达的半定量分析

Jong-Il Choi, M.D., Sang-Dae Kim, M.D., Ph.D., Se-Hoon Kim, M.D., Ph.D., Dong-Jun Lim, M.D., Ph.D., Sung-Kon Ha, M.D., Ph.D.

韩国高丽大学医学院高丽大学医疗中心安山医院神经外科

摘要

目的

本研究探究了不同持续时间的实验性缺血性脑卒中后小鼠海马热休克蛋白70（HSP-70）表达与梗死体积的关系。

方法

通过改良的管腔内细丝技术阻塞小鼠大脑中动脉，诱导局灶性脑缺血。缺血诱导24小时后，提取双侧海马进行HSP-70蛋白分析。对每侧半球的切片用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2%）染色，计算梗死体积。使用Western blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估HSP-70水平。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测量海马中HSP-70亚型（hsp70.1, hspa1a, hspa1b）的mRNA水平。

结果

在经历短暂缺血的10只小鼠中（30分钟和60分钟阻塞组各5只），发现脑梗死位于阻塞同侧，而假手术组小鼠中未发现局灶性梗死。两个缺血组的平均梗死体积分别为22.28±7.31 mm³ [30分钟组±标准差（SD）]和38.06±9.53 mm³（60分钟组±SD）。Western blot分析和ELISA显示，梗死组海马组织中的HSP-70水平高于假手术组。然而，两个梗死组之间的HSP-70水平差异在统计学上不显著。此外，RT-PCR结果表明HSP-70亚型的mRNA表达与阻塞时间或梗死体积无关。

结论

我们的结果表明，尽管梗死体积存在统计学差异，但在30分钟和60分钟阻塞组之间HSP-70表达没有显著差异。此外，HSP-70亚型的mRNA表达与阻塞持续时间和脑梗死体积均无关。

关键词：脑梗死体积 · 热休克蛋白 · 阻塞时间

引言

局灶性脑缺血是一种随时间和空间演变的活性生化过程。根据缺血损伤的持续时间和严重程度，可能发生决定细胞存活的复杂基因组反应[6]。热休克蛋白70（HSP-70）是一种分子伴侣，可由多种病理损伤诱导，如高温、凋亡刺激、氧化应激和缺血条件[9,25,26]，并因其在急性缺血后的神经保护特性而广为人知[4,5,20]。HSP-70在脑中被诱导，根据缺血的位置和严重程度，它可以在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞或内皮细胞中被诱导[15]。HSP-70的过表达通过防止蛋白质变性以及稳定和恢复部分变性蛋白质的功能来保护细胞免受缺血条件的影响[15]。HSP-70伴侣蛋白家族调节凋亡和坏死细胞死亡[5,13,23]，并阻断途径中的多个凋亡步骤。

为了研究脑梗死体积与HSP-70蛋白表达之间的关系，以及缺血持续时间与HSP-70蛋白表达之间的关系，我们使用了通过短暂大脑中动脉阻塞（MCAO）创建局灶性脑缺血的小鼠。通过管腔内缝合阻塞大脑中动脉来在小鼠中诱导局灶性缺血的实验方法最初由Koizumi等人开发，并由Longa等人[8]和Nagasawa与Kogure[12]进一步改进。这种非侵入性和简单的模型已广泛用于脑缺血病理生理学研究和治疗干预。尽管已进行了大量关于脑梗死与HSP-70表达之间关系的研究，但在使用多种方法[Western blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）]检查HSP-70表达以及梗死模型急性阶段再灌注后HSP-70亚型（hsp70.1, hspa1a和hspa1b）的mRNA表达方面，研究努力不足。

通过使用MCAO方法创建局灶性缺血，并直接从小鼠海马组织中测量HSP-70水平，我们旨在进一步分析HSP-70表达与缺血性梗死在缺血持续时间和梗死体积方面的关系。我们试图确定HSP-70在临床应用中的意义，作为可能有助于脑缺血诊断和预后以及评估这些疾病治疗效果的工具。

材料与方法

动物

本研究使用了15只成年雄性C57BL/6小鼠，体重23-25克（7-8周）。将小鼠随机分为3组：5只分入30分钟MCAO组，5只分入60分钟MCAO组，另外5只分入假手术组。韩国大学的机构动物护理和使用委员会审查并批准了本工作中使用的动物方案。

局灶性脑缺血和脑切片制备

通过使用改良的管腔内细丝技术阻塞大脑中动脉（MCA），在小鼠中诱导局灶性脑缺血[1]。在颈部正中切口后，分离并结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，并在颈内动脉上暂时放置微血管夹。将涂有硅树脂的8-0尼龙单丝通过颈总动脉切口引入，并推进至颈动脉分叉远端9毫米处以阻塞MCA。在30分钟MCAO组中，尼龙单丝在30分钟后取出；在60分钟MCAO组中，尼龙单丝在60分钟后取出。假手术组小鼠接受了颈部正中切口以及左侧颈总动脉和颈外动脉的分离和结扎，但无进一步操作。线的尺寸与体重相匹配，以确保可重复的血管阻塞。

手术后24小时处死小鼠，并以两种方式处理其大脑：将双侧半球切成3片，每片厚1.5毫米，以测量梗死体积；迅速提取双侧海马的脑组织进行HSP-70蛋白分析。

脑梗死体积测量

所有15只小鼠均用于梗死体积测量。取出大脑并切成厚1.5毫米的轴向切片。将切片放入2%的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物溶液中，并在室温下加热20分钟。然后用4%多聚甲醛处理切片，并在4℃下冷藏48小时后再进行扫描。使用美国国立卫生研究院（NIH）ImageJ软件9.0版（马里兰州贝塞斯达）测量每个切片的梗死区域，并计算总梗死体积。还确定了同侧和对侧半球体积，以校正可能人为影响梗死体积的水肿[19]。使用以下公式计算校正后的梗死体积：校正后梗死体积=对侧非梗死体积-同侧非梗死体积。

Western blot分析

对于Western blot分析，获取了来自每个实验组所有小鼠的双侧海马。根据制造商的说明进行蛋白提取、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot[10,21]。使用8% SDS-PAGE分离等量的蛋白，并转移到PVDF膜上，然后用一抗进行免疫印迹。使用的一抗如下：抗β-actin [F-1804（Sigma, USA, 1:4000）]和HSP-70 [sc-32239（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1:500）]。使用NIH ImageJ软件9.0版对至少5次独立实验的HSP-70和β-actin蛋白条带强度进行量化，并归一化为β-actin。

HSP-70 ELISA分析

对于HSP-70 ELISA，将海马在液氮中快速冷冻并称重。使用组织匀浆器（Omni International, TH2000）匀浆15秒，然后加入50 µL冷（4℃）1×提取缓冲液（来自HSP-70 ELISA试剂盒，Abcam, ab133060; Abcam, Cambridge, MA, USA）。在冰上孵育30分钟后，以7级超声处理12次脉冲（Sonic Dismembrator 60; Fisher Scientific, Chicago, IL, USA），并在4℃冷藏微型离心机中以21000×g离心10分钟。将上清液在样品稀释液2（HSP-70 ELISA试剂盒的组分）中稀释1:5；在ELISA中使用100 µL重复样品，并将剩余上清液用于蛋白测定。过量上清液储存在-70℃。按照HSP-70 ELISA试剂盒提供的方案进行HSP-70蛋白水平的量化，不做任何修改。使用µQuant（Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, UT, USA）测量450 nm处的吸光度，并使用Ascent for µQuant分析数据。

逆转录聚合酶链反应

对于RT-PCR，使用上述相同方法提取所有受试者的双侧海马。使用Trizol试剂提取总RNA，并根据制造商的说明使用互补DNA（cDNA）合成试剂盒（Invitrogen, USA）进行逆转录。使用BLAST（NIH, Bethesda, MD, USA）测试正义和反义寡核苷酸的保真度和特异性。使用DNA热循环仪（Perkin Elmer）合成cDNA，参数如下：45℃ 60分钟，然后95℃ 5分钟。用Taq聚合酶（Promega, USA）和各10 pmol的正义和反义引物扩增cDNA（2 µL），如下：GAPDH: 5'-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3', 5'-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3'; HSP 70.1: 5'-TGC TTG GGC ACC GAT TAC TGT CAA GG-3', 5'-GCA GCT AGA CTA TAT GTC TTC CCA GGC TAC TG-3'; HSPa1a: 5'-TCA ACG GGC GCG ACC TGA AC-3', 5'-GCC ACA TAT CTG TCT CCT AGC CAG C-3'; 和 HSPa1b: 5'-TCA ACG GGC GCG ACC TGA AC-3', 5'-TCG GTG CCC AAG CAG CTA TCA-3'。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为参考对cDNA水平进行归一化。将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，并使用GelStar凝胶染色（FMC BioProducts, Rockland, ME, USA）显示条带。使用不变的GAPDH mRNA作为内部对照。

统计分析

使用Windows版社会科学统计软件包18.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行统计分析。根据平均值[±标准差（SD）]和频率（n和百分比）分别呈现连续变量和分类变量。根据正态性检验，使用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验比较各组间连续变量的分布。使用双尾假设检验，所有分析中p<0.05被认为具有统计学意义。

结果

脑梗死体积测量

在经历短暂缺血的动物中（30分钟缺血组5只小鼠和60分钟缺血组5只小鼠），发现脑梗死位于阻塞同侧（左侧）半球，而假手术组小鼠（n=5）中未发现局灶性梗死（图1A）。

根据来自2个有梗死组的小鼠数据，脑梗死体积随MCA阻塞时间增加而增大。30分钟阻塞组（n=5）的平均梗死体积为22.28±7.31 mm³，60分钟组（n=5）为38.06±9.53 mm³，表明经历更长时间缺血的组梗死体积更大。梗死体积比较显示30分钟和60分钟MCAO组之间存在统计学差异（p=0.032）（图1B）。

Western blot分析

我们处理了15只小鼠的双侧脑样本进行蛋白测量（同侧n=15，对侧n=15）。然而，30分钟缺血组中1个缺血侧（左侧）样本由于HSP-70蛋白条带存在缺陷而不适合分析。因此，分析了29个蛋白条带：14个同侧蛋白条带和15个对侧蛋白条带。

Western blot分析证实，与假手术组相比，两个梗死组（30分钟和60分钟阻塞组）同侧（左侧）海马组织中HSP-70与β-actin的比率显著增加（假手术组，n=5；30分钟组，n=4；60分钟组，n=5）（p=0.034）。

然而，两个梗死组之间的HSP-70水平无统计学显著差异（p=0.730）。使用对侧（右侧）海马组织时，比率相对于不同阻塞时间无显著变化（p=0.792）。最后，在每个受试者中观察时，同侧（左侧）组织的HSP-70表达高于对侧（右侧）（图2）。

HSP-70 ELISA分析

与Western blot结果类似，ELISA显示，当在阻塞同侧（左侧）海马组织上进行时，两个梗死组的HSP-70表达水平高于假手术组（假手术组：n=5；30分钟组：n=5；60分钟组：n=5）（p=0.011）。然而，尽管阻塞时间越长梗死体积越大，但30分钟和60分钟阻塞组之间的HSP-70表达水平无显著差异（p=0.971）。当处理对侧（右侧）海马组织时，即使经历最长阻塞时间的组，组间HSP-70表达也无统计学差异（p=0.058）。最后，当观察来自30分钟和60分钟阻塞组的每只动物时，受影响（左侧）侧组织的HSP-70表达高于对侧（右侧）（图3）。

RT-PCR分析

我们测量了从双侧半球获得的海马组织中GAPDH、hsp70.1、hspa1a和hspa1的相对mRNA表达（假手术组：n=5；30分钟组：n=5；60分钟组：n=5）。定量分析显示，经历不同血管阻塞时间（假手术、30分钟和60分钟）的组之间HSP-70亚型（hsp70.1、hspa1a、hspa1b）的mRNA表达无显著差异。

通过RT-PCR比较从梗死半球（血管阻塞同侧）获得的数据时，我们未观察到hsp70.1（p=0.379）、hspa1a（p=0.264）和hspa1b（p=0.33）mRNA表达与不同阻塞时间相关的显著差异。对对侧（右侧）脑样本也获得相同的阴性结果（hsp70.1，p=0.512；hspa1a，p=0.852；和hspa1b，p=0.932）（图4）。

讨论

HSP-70表达在缺血条件下增加的概念已得到充分证实[15]。已知热休克基因的作用是由热休克或各种压力（包括缺血）触发的[3,11,22]。在压力条件下产生的变性蛋白触发HSP转录，由此产生的HSP-70与变性蛋白结合以防止进一步变性[14,27]。Yenari[24]提出，HSP-70表达增加是细胞应激的指标。HSP-70表达主要在缺血半暗带区域升高[17,18]，而HSP-70基因的缺失会加重小鼠局灶性脑缺血后的凋亡[7]。最近已证明HSP-70通过抗炎机制保护大脑免受缺血影响[4]。

我们假设在严重脑缺血中HSP-70表达会更高。通过测量其在海马组织中的水平直接评估了HSP-70的浓度，脑缺血的严重程度由缺血持续时间和梗死体积表示。首先，我们的数据显示脑梗死体积取决于缺血持续时间：缺血持续时间越长，梗死尺寸越大。其次，显然HSP-70表达仅在脑缺血区域的组织中增加。

然而，尽管经历不同持续时间血管阻塞（30分钟和60分钟）的2个组之间的梗死体积存在显著差异，但未观察到HSP-70表达的统计学差异。在所有分析（Western blot、ELISA和RT-PCR检测）中，2个组之间的HSP-70表达无显著差异的结果是一致的。这些结果与我们的预测或预期不符，特别是因为我们观察到梗死严重程度的增加与阻塞时间的增加成正比。我们推测，这是海马对缺血的特殊易损性[2]的结果，当缺血时间超过30分钟时，HSP-70 mRNA随时间降解，导致30分钟和60分钟组之间无区别。

与我们的结果不同，Roberts等人[16]显示，在24小时再灌注时，未分级海马中HSP-70的水平与缺血持续时间成正比，更长的缺血时间增加了HSP-70的产生。然而，在他们的研究中，血管阻塞持续时间更短（10、15和20分钟）。

mRNA表达是蛋白质产生的有力证据[26]。为了检查HSP-70诱导的有意义变化，我们分析了3种不同HSP-70亚型hsp70.1、hspa1a和hspa1b的mRNA表达。然而，我们的数据显示，hsp70.1、hspa1a和hspa1b的mRNA表达不受血管阻塞持续时间和脑梗死体积的影响。

这些结果可能由以下原因引起：1）血管阻塞后再灌注持续时间不当；2）未对海马不同细胞进行单独分析。Yenari[24]使用小鼠脑缺血的全局模型进行了研究，并注意到海马CA1-CA3区域中HSP-70 mRNA表达的变化。这些作者报告称，HSP-70 mRNA表达随阻塞后不同再灌注持续时间而变化，在再灌注后18小时达到峰值表达，在30小时减少[16]。这表明我们的局灶性梗死模型可能未能显示mRNA表达的增加，正如在HSP-70蛋白水平测量中所见。此外，未对海马CA1和CA3区域的细胞进行单独分析可能影响了我们的结果。CA1和CA3的单独显微解剖随后进行显微分析可能会带来有希望的结果。我们研究的另一个局限性是样本量不足。我们可能需要收集额外数据以增强统计价值。

除了解决上述局限性外，还需要进一步研究有意义的HSP-70亚型，以发现用于缺血性损伤诊断和治疗的有用血清标志物。

结论

我们的结果与几项近期研究的数据一致，这些研究表明HSP-70过表达取决于脑梗死体积。如果能够检测到特定HSP-70亚型的血清水平变化并与缺血相关联，这可能有助于缺血性损伤的诊断。此外，如果血清学或基因转移方法被证明能有效诱导HSP-70水平升高，这些方法可能对中风患者的局灶性缺血性损伤治疗有用。HSP-70水平可用于在再灌注方面对急性局灶性脑梗死进行更精确的诊断。然而，需要进一步的体外方法来证明HSP-70是脑梗死严重程度、治疗效果和预后的重要标志物。

致谢

本研究由高丽大学资助，项目编号K1300161。

图1

A：梗死区域在2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色后显示为浅色（未染色）区域。B：大脑中动脉阻塞后30分钟或60分钟的梗死体积定量分析。60分钟的梗死体积显著大于30分钟的体积（Mann-Whitney U检验，p=0.032）。Lt：左侧。

图2

Western blot（A）和定量分析（B）显示，小鼠同侧（左侧，Lt）海马中，缺血组（30分钟和60分钟）与假手术组之间的HSP-70表达存在统计学差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.034），而30分钟和60分钟组之间不存在差异（p=0.730）。对侧（右侧，Rt）无统计学差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.792）。数据以均值±SD表示。*表示p≤0.05的显著性。HSP-70：热休克蛋白70，SD：标准差。

图3

ELISA定量分析。小鼠同侧（左侧，Lt）海马中，缺血组（30分钟和60分钟）与假手术组之间的HSP-70表达存在统计学差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.011），而30分钟和60分钟组之间不存在差异（p=0.971）。对侧（右侧，Rt）无统计学差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.058）。数据以均值±SD表示。ELISA：酶联免疫吸附试验，HSP-70：热休克蛋白70，SD：标准差。

图4

HSP mRNA表达（hsp70.1、hspa1a和hspa1b）不依赖于MCA阻塞时间（Kruskal-Wallis检验，p>0.05）。数据以均值±SD表示。小鼠双侧（Rt：对侧，Lt：同侧）海马中HSP mRNA表达（hsp70.1、hspa1a、hspa1b）无显著差异（Kruskal-Wallis检验，p>0.05）。数据以均值±SD表示。HSP：热休克蛋白，mRNA：信使RNA，MCA：大脑中动脉，SD：标准差。

【全文结束】