摘要
背景/目的：我们先前描述了一种由长期经食管心房爆发式起搏诱导的心房颤动（AF）大鼠模型。在此，我们通过探索心律失常可诱导性、自发性AF发生及相关自主神经和分子变化，进一步表征该模型。
方法：将12只成年雄性Wistar大鼠随机分为两组：对照组（n=5）和AF组（n=7）。AF组大鼠接受了10天的经食管心房起搏。对照组大鼠模拟了相同方案。在刺激前、刺激期间和刺激后评估自发性AF发生和心率变异性（HRV）。评估了左心房Hcn1、Hcn2、Hcn4和Pitx2的RNA水平。
结果：AF组中，刺激前没有动物出现自发性AF。刺激开始后，所有AF大鼠均出现自发性AF（p=0.08）。在AF大鼠中，HRV分析显示心房刺激开始后RR间期标准差逐渐增加（p<0.01）。与对照组相比，AF大鼠的左心房Hcn4 RNA水平较高（p=0.03），Pitx2水平较低（p=0.02）。
结论：本研究验证了我们先前的数据，并证实了大鼠长期心房起搏后自发性AF的发生。相对增加的副交感神经调节以及编码If的Hcn4和Pitx2的心房表达变化可能在该模型中发挥关键的机制作用。
关键词：心房颤动；心房起搏；心率变异性；分子重构；大鼠模型
1. 引言
心房颤动（AF）是最常见的持续性心脏心律失常[1]。AF发生所涉及的机制尚未完全阐明，目前可用的治疗方案疗效有限且伴有不可忽视的副作用[1,2]。
动物研究在过去一个世纪的众多科学和医学进步中发挥了基础性作用，并继续为我们的病理生理现象理解及新治疗靶点的识别做出贡献[3,4]。由于AF在大多数物种中不会"自然"发生，因此已开发出基于电刺激或药物挑战的实验模型，为AF研究提供实用工具[3,4]。尽管大型动物研究对理解AF机制非常重要，但它们有几个缺点，特别是与动物饲养和护理相关的困难和成本，以及其寿命较长[3,4]。
长期以来，人们认为再入性心律失常（包括AF）在小心脏中不可能维持[5]。然而，多年来已开发出几种大鼠AF模型[3,4]。在大多数研究中，AF是通过电刺激在有利条件下（如胆碱能刺激或窒息）诱导的，这些设置可能引起不必要的相互作用并干扰结果解释[6,7]。此外，所有先前研究都集中在单次电刺激后AF的可诱导性上；长期心房刺激对电刺激后自发性AF发生的影响尚未在小型动物中进行评估。大鼠中长期心房起搏诱导的AF模型将允许评估AF相关的结构、电、自主神经和分子重构，并可用于测试抗心律失常策略对心房重构和AF的急性和慢性影响。在先前的研究中，我们展示了长期心房电刺激方案在诱导小型啮齿动物自发性AF方面的有效性，证明"AF诱发AF"的概念也适用于大鼠[8]。
在本研究中，我们旨在验证这种通过长期经食管心房起搏诱导的新型AF模型，并深入了解该模型的机制，重点关注与AF相关的自主神经调节和心房转录组变化。
2. 材料与方法
2.1 研究动物
本研究使用从当地实验动物中心获得的12只成年雄性Wistar大鼠（250-300克）。所有大鼠均接受了基线健康评估，实验开始前出现任何全身疾病、先天异常或自发性心律失常的动物未纳入研究。动物随机分为两组：对照组（n=5）和AF组（n=7）。
样本量根据动物实验的一般要求选择，以确保有足够的统计能力检测对照组和AF组之间的有意义差异。样本量基于从初步研究中获得的数据，该研究检查了经食管心房电刺激对心律失常可诱导性和自发性AF发生的影响。这些初步数据用于估计关键结果（如AF可诱导性和自发性AF发生）的方差和效应大小。每个组独立进行样本量计算，确保每组都有足够的能力检测组内和组间差异，统计功效为80%，α水平为0.05。由于方案的侵入性，选择了稍大的AF组。所有大鼠单独饲养在聚碳酸酯笼中，在温度控制的房间（21°C至23°C）中，具有12小时光照/12小时黑暗周期，并在整个研究期间自由获取食物和水。实验方案经当地伦理委员会和国家卫生兽医和食品安全管理局（118/2018年6月27日）批准，并符合国际实验动物科学理事会指南（指令2010/63/EU）。
2.2 经食管程序化心房电起搏和心房颤动可诱导性评估
AF组大鼠接受了长期（10天）经食管程序化心房电起搏方案。对照组大鼠接受了相同方案，但不应用电刺激。大鼠用氯胺酮/美托咪啶混合物（75.0/0.5 mg/kg）麻醉，并在整个方案期间记录体表心电图（图1A）。如先前所述[9]，使用连接到外部起搏器的经食管四极导管进行心房电刺激。导管正确位置通过每次刺激后出现窄QRS波群（以每分钟400次刺激速率生成）来确认（图1B）。在每只动物中，每天应用15个连续的20秒刺激周期，周期间有5分钟自由间隔，持续10天。为诱导AF，以每分钟4000次刺激的频率（刺激持续时间6毫秒）、高于舒张期阈值3伏的电压施加刺激。通过在刺激周期结束时出现AF（定义为快速、不规则的心律，至少有三个窄QRS波群，且P波消失）（图1C）或对应于窦房结恢复时间的自由间隔（图1D）来确认刺激的有效性。方案结束后，用阿替美唑（1毫克/千克）拮抗美托咪啶的作用。评估并比较两组之间的基线心率、AF可诱导性（表示为AF发作后刺激周期的百分比）和AF发作的平均持续时间。
2.3 ECG遥测设备植入和自发性心律失常负担评估
每只动物在研究开始时植入ECG遥测设备（TA11 CA-F40；Data Sciences International，美国明尼苏达州圣保罗），在异氟烷吸入麻醉下进行。射频发射器放置在腹部背侧皮下口袋中。为获得II导联配置，ECG电极在皮下隧道并固定在右锁骨下区域和心脏心尖处。
在刺激前、刺激期间（在第一周和第二周结束时）以及完成心房起搏方案后一周，每周进行72小时连续ECG监测（图2）。
ECG记录的分析使用在LabVIEW 2010（美国国家仪器公司，德克萨斯州奥斯汀）开发的软件进行。对于每个ECG，评估24小时平均心率和心房心律失常事件（类型、数量和持续时间）。监测的主要心律失常事件是AF（图1E）和房性早搏（APBs）。心房心律失常事件的数量和持续时间按24小时间隔报告，并在两组之间进行比较。根据先前研究[8,9]，AF定义为快速、不规则的心律，至少有三个连续的窄QRS波群，且P波消失。AF发作的持续时间从第一个心律失常搏动测量到第一个随后的窦性搏动。与窦性心律P波形态不同的提前心房去极化定义为APBs。
2.4 心率变异性分析
基于刺激前、刺激期间和刺激后获得的连续ECG记录，通过心率变异性（HRV）分析评估心脏交感神经和副交感神经调节及交感-迷走平衡。对于每只动物，使用我们实验室使用LabVIEW 2010软件（美国国家仪器公司，德克萨斯州奥斯汀）开发的程序，分析连续RR间期在频域和时域中的变化，如前所述[10]。为防止数据失真，两名独立心脏病专家目视评估所有ECG轨迹，识别并从HRV分析中排除心律失常事件和伪影。在时域中，分析正常RR间期的标准差（SDNN）、连续RR间期差异的均方根（RMSSD）以及相邻RR间期差异>5毫秒的比例（pNN5）。在频域中，分析HRV谱的低频（LF；0.3-0.6 Hz）和高频（HF；0.6-2.5 Hz）分量以及LF/HF比。
2.5 左心房心房颤动相关基因表达
在ECG监测期结束时，使用腹腔注射终末剂量戊巴比妥钠（>100 mg/kg）对动物实施安乐死。取出心脏，并将左心房收集在RNA稳定溶液（RNAlater；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中进行转录组分析。
使用iPrep PureLink总RNA试剂盒和iPrep纯化仪器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行RNA分离。使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行逆转录。如前所述[11]，使用包含针对测试基因的TaqMan基因表达分析的定制快速96孔板（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）分析目标基因的RNA表达水平。分析了超极化激活环核苷酸门控通道（Hcn）1、2和4、成对样同源盒转录因子2（Pitx2）以及一个对照基因（即甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]）的RNA表达水平。目标基因的表达水平用GAPDH看家基因水平标准化，并在AF组和对照组之间进行比较。
2.6 统计分析
使用GraphPad Prism 10版（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。所有数据均测试正态性，并根据适当情况表示为均值±标准误差或中位数和四分位范围。根据数据分布，使用Welch校正非配对t检验或Mann-Whitney U检验评估组间差异。使用重复测量ANOVA或Friedman检验分析同一组内的差异。p值<0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1 经食管心房起搏对心房颤动的可诱导性
在对照组大鼠中未诱导出心律失常发作。在刺激大鼠中，7只中有6只（85.7%）诱导出AF，AF可诱导性的平均总体为44.0%±6.3%。刺激诱导的AF发作的平均持续时间为123.2±36.4秒。
3.2 对照组和刺激组大鼠的自发性心律失常负担
在任何连续ECG监测时刻，AF组和对照组之间的24小时平均心率均无显著差异（所有p>0.05；表1）。
然而，在AF大鼠中，24小时平均心率逐渐下降（p<0.01），而在对照大鼠中，心率在研究期间保持恒定（p=0.52）（图3A）。
经食管电刺激前，两组之间的APBs/24小时数量无显著差异（p=0.19）。然而，与对照组相比，AF大鼠在刺激第一周（p=0.01）和第二周（p=0.02）后以及完成经食管电刺激方案后（p=0.01）的APBs数量显著更高。在刺激大鼠中，APBs数量在心房电刺激方案开始后逐渐增加（p<0.001；图3B）。
在对照组中，任何连续ECG监测期间均未记录到自发性AF发作。同样，AF动物在经食管电刺激前均未出现自发性AF发作。然而，在刺激第一周后，7只AF大鼠中有6只（85.7%）出现自发性AF，而在刺激第二周后以及刺激方案结束一周后，所有AF大鼠均出现自发性AF发作。在刺激大鼠中，AF发作的数量在心房电刺激方案开始后有逐渐增加的趋势（p=0.08；图3C）。同时，自发性AF发作的持续时间在电刺激方案开始后保持相对恒定（p=0.18；图3D）。
3.3 心率变异性的时域和频域分析
在所有四个ECG监测期间，AF组和对照组之间的SDNN、RMSSD和pNN5均相似（所有p>0.05）。频域参数（即LF、HF和LF/HF）在两组之间也相似（所有p>0.05；表2）。
然而，与AF组中观察到的24小时平均心率逐渐下降一致，SDNN在该组心房电刺激方案开始后逐渐增加（p<0.01）。该组中所有其他分析参数（即RMSSD、pNN5、LF、HF和LF/HF）在整个研究期间保持恒定（所有p>0.05；图4）。在对照组中，所有分析的HRV参数在整个研究期间也保持恒定（所有p>0.05；图4）。
3.4 电刺激和非刺激大鼠左心房Hcn1、Hcn2、Hcn4和Pitx2 RNA表达
两组之间左心房RNA表达的Hcn1和Hcn2相似（两者p>0.05；表3）。然而，与对照组相比，AF组中编码起搏电流If的Hcn4左心房RNA表达显著更高（p=0.03）。相反，与对照大鼠相比，AF组中Pitx2的左心房RNA表达显著降低（p=0.02；表3）。
4. 讨论
本研究的主要发现是：（1）经食管心房电刺激可在无任何辅助因素的情况下在大鼠中诱导AF；（2）长期心房电刺激导致自发性AF发作，其数量随着心房刺激持续时间延长而逐渐增加；（3）在刺激大鼠中，心率逐渐减慢且SDNN增加，表明心脏副交感神经调节相对增强；以及（4）所有这些变化均伴随左心房RNA表达Hcn4（编码If）的增加和左心房RNA表达Pitx2的减少。
4.1 长期心房爆发式起搏在大鼠中诱导自发性心房颤动
AF与发病率和死亡率增加相关，导致临床实践中的众多问题，特别是由于其患病率持续增加[1]。阐明AF发生和维持所涉及的机制以及识别新的治疗靶点在很大程度上取决于对临床上相关的实验动物AF模型的详细评估。
许多体内实验模型已在大型动物（如狗或羊）中成功诱导AF[3,4]。然而，大型实验动物模型的缺点是成本增加，与需要重要资源（如空间、专业医疗护理和设备）有关[3,4]。小型动物模型可为AF潜在的病理生理机制提供重要的额外见解。
一百多年前，Walter Garrey指出小心脏从纤维颤动状态恢复得非常快[12]。这一观察是"临界质量"假说的基础，该假说表明颤动心律不能在小尺寸心脏中维持[13]。然而，已在小型动物中开发并实施了AF模型[5,6,7,14]。然而，这些模型传统上使用辅助因素以确保AF发生，仅评估急性心房刺激对AF发生的影响，和/或需要长期随访[6,7]。
我们最近开发了一种由长期程序化经食管心房电刺激在大鼠中诱导的自发性AF新模型[8,9]。初步研究主要集中在建立通过长期经食管起搏在大鼠中诱导AF的可行性[8,9]。虽然这是至关重要的第一步，但对该模型需要更全面的调查。深入了解该模型中自发性AF发生[8,9]的潜在机制对于其在未来的实验研究中的使用至关重要。在本研究中，我们首先验证了我们实验室先前开发的AF模型，从而证实长期心房起搏导致大鼠中自发性AF的发生。
在我们的模型中，经食管心房起搏的长期（10天）应用创建了自发性（继发性）AF发生所需的左心房基质，从心房起搏的第一周开始，85.7%的刺激动物出现自发性AF。此外，在所有刺激大鼠中不仅在刺激期间，而且在刺激方案结束后都观察到自发性AF发作。虽然心房起搏开始后自发性AF的发生仅显示向统计显著性的强烈趋势，但自发性AF发生的生理学意义不仅取决于统计显著性。AF发作在多个ECG监测期间的渐进性增加支持了该AF模型的相关性。因此，本研究证实"AF诱发AF"的概念也适用于小型动物，尽管其心房质量减少。在发生AF的动物中，跟随起搏周期的AF发作百分比各不相同，AF发作的持续时间也是如此（范围从31到279秒）。这种个体间变异性表明心房电刺激诱导的心房重构可能存在差异。
快速局灶性放电的发生已被认为是"AF诱发AF"现象的主要促成因素[3,13,14]。在由慢性快速心房起搏诱导的犬AF模型中，在肺静脉中观察到间歇性局灶性放电[15]。与此概念一致，在本研究中，心房起搏导致心房刺激方案期间APBs数量逐渐增加。此外，先前AF发作的持续时间似乎决定了心房对随后由APBs引发的自发性AF发作的易感性[5,14]。在山羊研究中，在AF 6小时后，单个早搏刺激增加了心房发生阵发性AF的易感性[5]。在AF 24小时后，心房对颤动的易感性进一步增加。此外，在AF 24小时后，额外刺激的应用导致20秒的快速、不规则心房活动，而在AF 2周后，额外刺激的应用引发持续的快速、不规则心房活动发作，不会自发停止[5]。在本研究中，心房电刺激方案的增加持续时间（10天）以及AF可诱导性的增加导致APB负担增加、心房对AF发生的易感性增加，并促进自发性AF的发展。
与更好地重现人类心脏电生理学和自发性AF的大型动物模型（如狗和猪）相比，AF的小型动物模型为机制研究提供了一种实用方法[3]。包括我们的AF模型在内的啮齿动物模型由于其成本效益和快速可重复性，为评估心律失常机制提供了有价值的工具[3]。然而，小型动物实验模型具有重要局限性，包括解剖学差异、高基线心率以及需要人工诱导AF，这可能限制向人类AF的直接转化。临床上，AF受多种因素影响，包括衰老、高血压、肥胖、糖尿病和心力衰竭，所有这些都导致心房重构和对AF的易感性增加[16]。在AF的实验模型中复制所有这些因素很困难。因此，通过验证模仿人类AF中观察到的某些改变的AF大鼠模型，我们的研究为在受控实验环境中研究疾病机制和测试新型治疗策略提供了有用的平台。
4.2 长期心房爆发式起搏诱导心脏迷走神经调节的渐进性增加
快速心房起搏后自发性AF发生的基质已与由快速心率引起的心房重构过程相关联[5]。已证明在这种情况下发生结构性心房改变、心房离子通道表达改变以及心脏自主神经系统的改变[17,18]。先前的研究描述了快速心房起搏后心房交感神经支配和活动的增加[14]。在本研究中，作为交感活动标志物的LF不受长期心房起搏的影响。同样，自主神经标志物（即SDNN、RMSSD、pNN5、HF）均不受心房起搏的影响，并且与非刺激大鼠相比，电刺激大鼠中没有明显的交感-迷走失衡，如两组中相似的LF/HF比所反映的。然而，在心律失常大鼠中，SDNN在心房电刺激方案开始后逐渐增加，而在对照大鼠中未观察到这种变化。与此发现一致，AF组中24小时平均心率也在心房电刺激方案开始后逐渐下降。AF组中SDNN的这种渐进性增加，以及观察到的AF组中心率的渐进性下降，表明对心房电刺激方案的反应中交感-迷走平衡向增加的副交感神经调节发生变化。然而，其他与副交感神经调节相关的参数未观察到类似趋势，并且对照组和AF组在HRV参数方面无显著差异。因此，未来研究必须澄清长期心房起搏后发生的精确自主神经变化。
在具有自发性动脉高血压的衰老大鼠的自发性AF模型中，先前描述了类似的自主神经变化，即渐进性相对迷走神经过度活跃[10]。此外，在这些大鼠中，直接和间接副交感神经刺激表现出强烈的致心律失常作用[10]。鉴于迷走神经过度活跃对心房的强烈致心律失常作用[19,20,21]，这种自主神经变化可能至少部分负责我们模型中自发性AF的发生。通过增加IKAch，增加的副交感神经张力缩短不应期，增加心房内传导异质性，并减少再入波长，促进再入和AF（图5）[14,20]。
4.3 长期心房爆发式起搏诱导左心房心房颤动相关基因表达的致心律失常变化
心房颤动与导致离子通道、信号通路和结构蛋白改变的分子变化相关联。HCN通道在建立和维持正常心律中起关键作用，是起搏电流（If）的分子对应物[22,23]。临床研究表明，在接受矫正心脏手术的患者中，与窦性心律患者相比，AF患者的右心房f通道亚型（HCN1、HCN2和HCN4）表达和主要反映窦房结水平的Hcn4 mRNA水平显著降低[24]。然而，HCN亚型也在左心房心肌和左心房中表达，左心房HCN过表达与AF可能性增加相关[23,25,26]。通过增加If表达，心房Hcn4（窦房结中If的主要编码基因）过表达可促进心脏异位自动性，导致AF[22,23]。实验研究表明，与窦性心律对照组相比，AF动物中窦房结中的Hcn2和Hcn4表达较低，但在左心房和肺静脉中较高[23,25,26]。在衰老大鼠中也报告了左心房Hcn4表达增加[27]。与这些数据一致，在本研究中，长期心房起搏诱导的自发性AF大鼠在左心房中呈现Hcn4表达增加。鉴于它们在心房致心律失常性中的核心作用，这些变化可能有助于我们模型中自发性AF的发生（图5）。
同时发生的左心房Pitx2下调可能进一步促进了该模型中自发性AF倾向的增加。在AF患者和动物中经常报告类似的变化。对接受胸腔镜AF消融的AF患者左心房样本进行的研究显示Pitx2 mRNA水平降低[28,29]。在瓣膜性心脏病患者中，改变的左心房Pitx2依赖性miRNA与AF相关[30]，左心房心肌细胞Pitx2表达预测AF消融后AF复发[31]。在具有自发性AF的衰老自发性高血压大鼠中，也观察到左心房Pitx2下调[32]。在该模型中，Pitx2下调归因于基因高甲基化，去甲基化剂地西他滨的给药显著降低了AF负担[33]。此外，快速心房起搏已被证明在Pitx2(null+/−)成年小鼠中诱导心房心动过速[29]。在心房中，Pitx2起转录调节因子的作用，其减少已被证明可诱导致心律失常的细胞和分子变化[34,35,36]。在Pitx2c+/−小鼠中，动作电位持续时间缩短，影响波长和AF可诱导性[37]。在NppaCre + Pitx2−/−和Pitx2c+/−小鼠中，心房复极化和静息膜电位受几种钾通道表达改变的影响[35,37]。在Pitx2缺陷小鼠中，Chinchilla等人证明IK1通道表达降低[35]。还报告了与Pitx2表达相关的IKs、INa和ICa, L的改变[31,38]。此外，PITX2通过Wnt信号传导控制钙处理，以及Shox2、HCN4和Cx43功能，所有这些都参与AF相关的电重构[39,40,41,42]。除了对心房电生理学的影响外，PITX2的错误表达还促进致心律失常的心房结构性改变，进一步增加AF易感性。PITX2直接调节稳定出生后心房闰盘的基因[34]。在Pitx2c+/−小鼠中，Bmp10（一种PITX2抑制的房性蛋白）高度上调，表明PITX2也可能控制心房腔室的尺寸[31]。与这些数据一致，我们的在长期心房起搏后出现自发性AF的大鼠也呈现左心房RNA Pitx2表达降低，这可能有助于该模型中心房起搏诱导的致心律失常心房重构和自发性AF的发生（图5）。
4.4 转化视角
本研究证实了长期经食管心房起搏在大鼠中诱导自发性AF的能力，并验证了这种成功的动物AF模型可用于进一步阐明AF病理生理学并识别和测试新型治疗方法。此外，本研究提供了有关该模型中致心律失常的自主神经和分子变化的重要见解。相对增加的迷走神经调节、左心房Hcn4增加和左心房Pitx2表达降低的存在（先前在AF患者中报告过）进一步验证了该模型作为临床上相关的动物AF模型。
4.5 研究局限性
我们的研究有几个局限性。对照组的样本量相对较小，这可能降低了我们统计分析的效力。然而，样本量基于先前研究的观察和伦理考虑而选择。
在我们的模型中观察到的短、自限性、不规则的心房心动过速发作不符合临床上定义AF常用的30秒持续时间，也不会在我们研究的时间范围内进展为持续性或永久性形式。然而，对于大鼠等小型啮齿动物来说，这是正常特征[12,13]。长期、持续的AF发作（即再入）需要足够大的组织质量。鉴于大鼠心房非常小，长期维持再入电路本质上是不可能的。尽管存在这一局限性，我们的模型引入了一种在大鼠中研究AF的新方法，有助于更广泛地理解较小、非传统动物模型中的心律失常机制。
仅使用HRV分析评估了自主神经变化。毒蕈碱受体阻断或迷走神经活动记录可以提供有关副交感神经系统对模型中自发性AF发生影响的额外信息。Hcn4和Pitx2的变化仅通过RNA定量进行评估。虽然预期改变的基因表达会导致异常的蛋白质变化，但其他转录后或翻译后调控机制可能影响蛋白质水平和功能。未来研究应纳入蛋白质印迹分析以验证我们的发现，并提供对HCN通道和Pitx2在心房重构和AF发病机制中作用的更全面理解。为确认Hcn4上调的影响，评估左心房中HCN蛋白和If活性将很有意义。评估该模型中心房结构性重构的存在和严重程度也很有意义。
5. 结论
在本研究中，我们成功验证并表征了一种通过长期经食管程序化心房电刺激在大鼠中诱导的增加心房致心律失常性和AF的新模型。自主神经重构，特征是相对增加的副交感神经输入，以及左心房分子重构，特征是Hcn4表达增加和Pitx2表达降低，可能在该模型中AF发病机制中发挥核心作用。需要进一步研究以探索该模型中发生的致心律失常心房变化的全谱及其对开发新型抗心律失常策略的潜在影响。
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