摘要
食物，特别是植物性饮食，具有复杂的化学多样性。然而，肠道细菌对植物营养素的大规模代谢活性在很大程度上仍不为人知。在此，我们整合并系统分析了包含酶反应和食物健康益处信息的多个数据库，以及3,068个全球公共人类微生物组。775种可食用植物中的植物营养素的转化与由多种肠道微生物编码的酶相关。体外实验验证了肠道菌种的生物转化活性，例如解纤维素真杆菌（Eubacterium ramulus）。植物营养素的生物转化表现出高度的人际差异和地理变异性。基于2,486个公共病例-对照微生物组的机器学习模型，使用与健康相关食物中植物营养素修饰相关的酶的丰度，能够区分多种疾病背景下个体的健康状况，表明疾病中生物转化潜力发生改变。我们通过结合无特定病原体和无菌小鼠的宏基因组和宏转录组分析，验证了微生物组编码的酶与常见可食用植物的抗炎活性之间的关联。这些发现对设计精准、个性化的饮食以引导个体达到健康状态具有重要意义。
主文
营养饮食的定义随着我们对食物、必需营养素和其他膳食成分如何影响健康和疾病的理解而不断演变。采用强调植物性食物（包括水果、蔬菜、全谷物、豆类、种子和坚果）而非传统西方饮食的膳食模式，可以增强健康和环境可持续性。然而，普遍适用的饮食策略以预防或治疗疾病的诱人概念，被对相同食物的异质反应所削弱。变异性的主要来源之一是肠道微生物组，因为其组成影响对食物的反应（例如血糖指数），而其代谢输出受饮食影响，进而影响生理稳态和代谢疾病进展，这强调了在个性化饮食建议中考虑微生物组的必要性。
先前的饮食研究主要基于150种宏量营养素，如脂肪、蛋白质和碳水化合物，以及将整体膳食模式（包括红肉、鱼类和蔬菜消费）与健康结果相关联，而非从生物化学角度进行研究。然而，人类食物具有巨大的化学多样性，包含超过26,000种主要源自植物的小分子，其中许多具有生物活性，并且此外还受到肠道微生物群庞大酶库的生物转化。
与肠道微生物代谢药物的研究相比，关于肠道微生物群对植物源性食物化合物（以下简称植物营养素）的生物转化及其与人类健康关系的研究才刚刚起步。已确定与某些细菌类群相关的植物营养素，但大多数研究集中在特定化合物或微生物集合上，而非大规模研究。了解巨大的"黑箱"生物转化反应并建立科学基础，以开发新一代针对个体的食物和前、益生菌及后生元来阻止疾病，仍是未来的目标。
我们系统地研究了这一黑箱，将775种植物营养素与来自3,068个人类肠道微生物组全球数据集的多种微生物的微生物酶联系起来。我们的研究结果表明，约70%的肠道微生物酶可能参与植物营养素的生物转化。我们在小鼠中证明，健康饮食的益处在很大程度上取决于特定微生物酶的存在和转录活性。此外，肠道细菌将健康饮食生物转化的能力在健康和疾病之间存在差异，这表明一旦建立失调的微生物组，广泛的"一刀切"饮食建议可能价值有限。
结果
肠道微生物酶在基因组水平上与数百种植物营养素相关联
为评估微生物酶对植物源性植物营养素的代谢潜力，我们系统地将膳食化合物与肠道微生物组进行了映射。我们从NutriChem 2.0中检索了7,825种与可食用植物相关的低分子量植物营养素，并尝试将它们与酶反应联系起来，成功将超过1,500种化合物与具有独特酶委员会（EC）编号的酶联系起来。过滤掉错误指定为天然植物化合物的物质后，留下1,388种与4,678种酶相关的植物营养素。
接下来，我们使用包含3,068个非疾病人类肠道微生物组的鸟枪法宏基因组队列，确定了与肠道微生物酶相关的植物营养素，这些微生物组来自欧洲（N=1,379）、亚洲（N=476）、非洲（N=326）、大洋洲（N=103）和美洲（N=784）。分类和功能分析使用MetaPhlAn3和HUMAnN3的分层输出，导致注释了959个物种和2,855种酶。累积曲线表明，每个地理区域在物种和酶方面都达到了平台期。在将注释的肠道微生物组酶与1,388种植物营养素联系起来后，约67%的注释酶（N=1,908）似乎参与了775种植物营养素和1,118种可食用植物的潜在生物转化；根据KEGG酶数据库，约64%（N=1,226）仅在肠道微生物物种中发现，而不在人类基因组中。
与肠道微生物相关的植物营养素中，萜类、黄酮类和生物碱占主导地位，而酶主要是氧化还原酶、转移酶和水解酶。酶的分类注释表明，所有门类都能够进行植物营养素生物转化，其中变形菌门（72.5%）和拟杆菌门（71.2%）最常被识别，其次是厚壁菌门（58.4%）和放线菌门（48.3%）。肠道细菌物种的丰度和流行率与其基因组进行植物营养素生物转化的能力呈正相关。
在1,118种可食用植物中，我们重点关注了19种被认为是健康饮食选择的常见食物，发现它们超过一半的已识别植物营养素与肠道微生物酶相关联。我们确定的一些与微生物组相关的生物转化之前已与健康相关联，包括根皮素的糖基化和根皮素转化为3-(4-羟基苯基)丙酸。
总体而言，我们的分析展示了肠道微生物群中广泛的植物营养素-生物转化潜力。
稀疏肠道细菌与高生物转化潜力相关联
我们接下来询问这些生物转化反应是否也由特征明确的商业可得益生菌执行，以及它们是否在体外发生。在注释59种益生菌的基因组后，我们发现这些菌株中的酶可能能够生物转化775种与肠道微生物酶相关的植物营养素中的525种。此外，在次级代谢相关途径中的186种植物营养素中，116种被益生菌和肠道微生物酶修饰，而70种仅与肠道微生物酶相关联。
考虑到对发酵食品和后生元健康益处日益增长的兴趣，我们尝试选择具有最大潜力酶修饰这些186种植物营养素的最少肠道细菌物种。首先看被肠道细菌和益生菌物种修饰的植物营养素，选择8种肠道细菌物种或4种益生菌菌株足以处理大多数（>95%）植物营养素。对于仅由肠道细菌酶修饰的70种植物营养素，我们确定了一组11种细菌（即最小物种），可能修饰43种植物营养素。
我们进一步调查了肠道物种在体外代谢植物营养素的能力，测试了六种肠道物种的代表性菌株（与益生菌相比具有较高的次级代谢相关植物营养素的生物转化潜力）。我们将这些物种与36种植物营养素（次级代谢相关：30种）一起孵育，这些植物营养素据预测会被它们代谢，涵盖主要与微生物组相关的所有酶类（EC1-EC5）。E. ramulus、O. splanchnicus和B. uniformis的孵育降低了植物营养素水平，表明细菌可能进行生物转化。值得注意的是，E. ramulus显示出最强的生物转化活性，显著代谢了12种底物中的11种。
对两种黄酮类化合物——丁苯酮和异甘草素的更详细研究揭示了E. ramulus基因组中编码的一种假定酶EC 5.5.1.6，可以催化它们的生物转化。当存在活的E. ramulus时，与非酶条件相比，生物转化以剂量依赖性方式加速。与先前研究一致，这些反应的下游产物仅在活的E. ramulus存在时被检测到。
总体而言，我们的分析揭示了肠道细菌和益生菌之间的共享能力，并突显了具有独特生物转化潜力的特定肠道细菌。
植物营养素生物转化显示个体间差异和地理特异性
我们接下来专注于整个微生物组及其与植物营养素空间的相互作用。平均而言，个体微生物组中注释的70%的酶和次级代谢相关途径中的90%与植物营养素生物转化相关。
微生物组α多样性与与植物营养素相关的酶的比例呈负相关，表明植物营养素生物转化是肠道微生物群的共同特性。然而，对于参与次级代谢的酶，这种相关性为正，表明肠道微生物对次级代谢相关植物营养素的生物转化能力各不相同。
我们观察到植物营养素生物转化的显著个体间差异：五个地理区域中，生物转化的植物营养素数量从264到620不等（IQR 32-52）。与微生物组独特性类似，植物营养素相关微生物组的独特性在不同个体的样本之间显著高于同一人的样本。
有趣的是，当我们按大陆聚合个体时，他们与植物营养素和食物生物转化空间相关的总酶机制在各区域之间非常相似。总计，630种植物营养素通常与来自所有五个区域的肠道微生物酶相关联，只有少数（例如，亚洲10种，大洋洲2种）显示出高度地理特异性。例如，黄酮类化合物杨梅素——存在于荔枝（中国南方常见）和东亚传统药材中的食物中——以及相关酶EC 1.1.1.219仅在亚洲个体中注释。
植物营养素相关酶的概况（使用存在/缺失模式或相对丰度）在各大洲之间显著不同（PERMANOVA，P<0.05），无论是否调整年龄、性别和身体质量指数（BMI），这反映了地区间显著的饮食差异。具体而言，非洲和亚洲与其他地区显著不同（Wilcoxon秩和检验，P<0.05）。酶变异与特定化学类别显著相关，包括黄酮类和脂肪酸相关化合物。
基于距离的冗余分析还显示年龄、性别和BMI与植物营养素相关酶概况相关。植物营养素相关微生物组独特性和与植物营养素相关的酶的比例分别与年龄呈正相关和负相关，与衰老过程中组成独特性增加一致。此外，511种酶与BMI显著相关（Spearman相关性，FDR<0.05），特别是裂解酶、氧化还原酶和连接酶。
为探索饮食如何塑造这些模式，我们使用了具有连续饮食信息的研究数据和配对的鸟枪法宏基因组数据。可食用植物饮食记录与这些可食用植物的1,665种植物营养素相关酶丰度之间的Procrustes分析显示出显著一致性（蒙特卡罗置换检验，P=0.001），表明可食用植物摄入与微生物组的植物营养素生物转化潜力相关。我们然后对美国出生的个体和泰国个体进行了相似性分析，后者最近移居美国或在美国生活了≥20年。尽管饮食习惯适应相对适中，但泰国参与者的可食用植物相关酶组成随时间推移与美国出生参与者的相似性显著增加。因此，尽管植物营养素代谢的某些核心酶在地理上保守，但肠道细菌酶对植物营养素的生物转化存在个体间和区域变异性，部分与饮食习惯相关。
代谢健康食物的潜力在疾病中改变
因为健康状况是肠道微生物组平衡的关键决定因素，我们假设健康和患病个体可能对包括已证明健康益处的可食用植物在内的植物营养素空间具有不同的生物转化能力。为测试这一点，我们分析了来自炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的病例-对照队列的公开肠道宏基因组数据集。我们将肠道细菌酶与其各自的有益植物营养素空间联系起来，分别为IBD、CRC和NAFLD确定了608、1,038和517种植物营养素相关酶。
在这些酶中，59.7%（n=363）、49.9%（n=518）和22.2%（n=115）在IBD、CRC和NAFLD中与相应对照相比显示出显著不同的丰度（metagenomeSeq零膨胀高斯模型，FDR<0.05）。然后，我们进一步研究了每种有益食物的肠道微生物群生物转化潜力的改变。平均而言，IBD、CRC和NAFLD中分别有63.0%、33.6%和25.3%的植物营养素相关ECs丰度显著改变。
我们随后试图确定一组关键的植物营养素相关酶（物种分层），可用于使用机器学习（ML）区分健康和患病个体。我们的随机森林模型包括IBD中的18种植物营养素相关酶（受试者工作特征曲线下面积（auROC）=0.892）、CRC中的28种（auROC=0.763）和NAFLD中的22种（auROC=0.95）。我们在外部队列中验证了这些模型，在所有三种疾病中实现了高准确性（auROC=0.72-0.79）。相比之下，当我们使用非饮食ECs（即与植物营养素无关）的物种分层输出时，模型验证的auROC降低。
为从ML模型中提取生物学见解，我们使用SHapley可加解释（SHAP）方法计算每个特征的重要性和预测方向。在IBD模型中，例如，我们确定了Alistipes finegoldii的EC 4.1.99.1，它催化色氨酸转化为吲哚，并预测健康状态（在对照中更丰富）。色氨酸在可食用植物如大蒜中丰富，据报道只有在被肠道微生物群生物转化后才对IBD患者有益。值得注意的是，在用于ML的IBD队列的配对代谢组学-宏基因组学数据集中，我们观察到EC 4.1.99.1和色氨酸的丰度之间存在显著负相关（P<0.05，r=-0.23，Spearman相关性），进一步支持我们的假设，即肠道微生物组在修饰植物营养素以使其对宿主产生有益特性方面起着关键作用。
抗炎饮食的效果与特定细菌酶相关
为在体内测试参与植物营养素生物转化的肠道微生物酶是否对触发健康饮食的保护作用至关重要，我们在特定病原体-free（SPF）和无菌（GF）条件下，在结肠炎小鼠模型中研究了抗炎食物草莓的效果。事实上，正常饮食中补充17天草莓改善了葡聚糖硫酸钠（DSS）SPF小鼠的整体健康状况，体重减轻显著减少（第14天，双尾t检验，P=0.019）和疾病活动指数（DAI）评分（线性混合模型，P=0.0042），并减轻了组织学损伤（双尾t检验，P=0.037）。
接下来，为评估这种保护作用是否依赖于肠道微生物组，我们研究了GF小鼠中补充草莓饮食的效果。尽管该饮食不影响体重，但它延迟了直肠出血的发生并略微改善了粪便稠度，反映在DAI评分降低（线性混合模型，P=1.5×10^-4）。有趣的是，详细的组织病理学分析发现，正常和补充草莓饮食的DSS GF小鼠之间没有差异，这意味着草莓补充仅部分改善了病理损伤。总体而言，我们的发现表明草莓在结肠炎进展中的保护作用部分由肠道微生物组介导。
为调查抗炎饮食和肠道微生物组之间的复杂相互作用，我们在不同SPF小鼠组中，在补充草莓6天后（但在DSS给药前）和DSS治疗的最后一天进行了粪便鸟枪法宏基因组和宏转录组分析。第6天的稳健Aitchison距离分析显示，草莓补充改变了DSS+vehicle和DSS+strawberry组之间的草莓相关酶概况，在DNA（PERMANOVA，P=0.001）和RNA（PERMANOVA，P=0.021）水平上。比较DSS+strawberry组第6天和第18天的β多样性分析表明，结肠炎显著改变了草莓相关微生物酶的概况。
我们随后调查了可能参与缓解SPF组结肠炎的特定肠道微生物组相关酶活性：在DNA和RNA水平上分别鉴定的27和44种草莓相关微生物酶在DSS+strawberry组中显示出显著更高的中位丰度，并且还与结肠炎的两个指标评分（DAI和组织学评分）中的至少一个相关。在DNA水平上，例如，酶4.1.1.11与两个评分均呈负相关。EC 4.1.1.11参与天冬氨酸转化为β-丙氨酸的生物转化，据报道可减少炎症反应，以及色氨酸转化为色胺，可减轻小鼠结肠炎严重程度。
总体而言，我们的发现表明，草莓的全部抗炎益处取决于特定肠道微生物酶的丰度和表达。
讨论
先前的研究已经调查了植物化学物质的微生物代谢如何塑造肠道微生物组组成，或特定转化如何在宿主健康中发挥有益或病理作用。扩展这些见解，我们整合了多个生物信息学数据库，系统分析了植物饮食与肠道细菌之间的广泛相互作用，重点关注微生物酶和主要分类驱动因素，揭示了人类营养在小分子水平与微生物组之间的机制联系。整合了3,000多个全球微生物组和1,300多种植物营养素，我们得出以下观察结果：(1) 775种植物营养素，包括几种已知生物活性的物质，据预测可被肠道微生物代谢，基于基因组内容；(2) 注释的肠道微生物酶中约67%可能与植物营养素生物转化相关；(3) 肠道细菌对植物营养素的生物转化在不同门类中广泛存在且各不相同。我们还获得了有关这些生物转化如何因个体、健康状况和地理区域而异的信息，以及它们如何塑造特定食物的健康益处。
我们的研究可以为开发下一代益生菌提供信息。益生菌已在各种疾病环境中显示出疗效，但要将其更广泛地应用于人类健康，必须超越乳酸菌和双歧杆菌。比较肠道细菌和59种非处方益生菌的植物营养素生物转化，揭示了一个只能由肠道细菌修饰的广阔膳食化学空间。因此，基于后生元能力识别和分离具有特定有益特性的肠道细菌，可能会提供更有效的益生菌疗法，这些疗法更适应人类胃肠道环境，用于疾病预防和治疗。
我们的发现还为开发功能性食品提供了策略。微生物食品（包括发酵食品）通过微生物代谢物调节人类健康的潜力目前正引起关注。然而，研究仅限于分析少数食品（包括发酵乳制品和泡菜）的发酵食品代谢组景观。在这里，我们展示了获得具有最大能力转化目标植物营养素集合的小型肠道细菌组装体的可能性：例如，一组11种肠道细菌物种可以主要驱动43种次级代谢相关代谢物的生物转化，这些代谢物来自常见的可食用植物（已知益生菌缺乏执行此操作的遗传潜力）。这为通过选定细菌物种的发酵开发功能性食品指明了新方向，这些细菌物种是通过植物营养素和肠道细菌之间的机制联系确定的。
食物选择可以改变肠道微生物组组成以改善宿主稳态；相反，微生物组可能影响饮食对宿主稳态的影响。我们在此表明，已知对健康有益的可食用植物中的植物营养素，在健康和患病个体中被肠道细菌酶以不同的方式生物转化，这突显了在更大、更多样化的队列中进行进一步研究以支持或扩展这些观察结果的必要性。此外，我们观察到抗炎植物食品（草莓）的全谱效应仅在具有健康微生物组的小鼠中发生，并确定了可能生物转化特定健康促进植物营养素的关键肠道细菌酶。我们的结果强调了重新审视"健康饮食"概念的重要性，因为饮食的有效性可能会因健康微生物组的存在而显著提高。对于微生物组失衡、无法生物转化与健康相关的植物营养素的人来说，食用已证明对健康有益的可食用植物可能是不够的。因此，个性化营养可能需要特定食物和有益微生物的组合，或食物的体外发酵，以实现植物饮食的全部营养价值。在经过严格安全测试后，食用由肠道细菌发酵的食物可能对那些肠道可能无法进行必要修饰以充分利用食物营养价值的人群（包括老年人和微生物组多样性降低的人群）极其有价值。有趣的是，我们的分析还显示参与者年龄与植物营养素相关酶的比例呈负相关。
这项研究有一些局限性。首先，作为概念验证研究，它专注于单一酶反应，而不是反应链，这使我们无法表征植物营养素的代谢命运，尚不清楚代谢产物是否被人类吸收或被其他肠道微生物进一步代谢。其次，由于植物营养素生物转化反应的广泛性，我们只验证了其中一小部分，需要未来的高通量测定。最后，我们的基于酶注释的框架仅限于已知的基因功能，忽略了未知的生物转化。通过额外的计算和实验方法更好地理解这种功能"暗物质"将有助于在微观层面设计基于微生物组的个性化营养。
我们对膳食植物营养素和肠道微生物组的大规模系统映射表明，微生物酶可能转化数百种植物营养素。值得注意的是，这种代谢潜力在健康和疾病状态之间有所不同，突显了肠道微生物组在介导饮食健康效应中的核心作用。这应该为通过靶向微生物工程优化植物性饮食的营养价值以及指导下一代益生菌、功能性食品和个性化营养的开发开辟途径。
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