孕期纵向表观遗传年龄变化及其与不良妊娠结局的关联
摘要
目的： 了解妊娠与通过DNA甲基化"时钟"估计的表观遗传年龄之间的关系，这提供了生物年龄的分子测量指标。
方法： 这是一项针对初产妇女（年龄18-50岁）的前瞻性队列研究，这些妇女于2020-2021年寻求产科（妊娠10-14周）或妇科（非妊娠）护理。在入组时（时间1）和产后第1天（妊娠组，时间2）或7个月后（非妊娠组，时间2）采集血液。表观遗传年龄使用Illumina EPIC 2芯片的11个已建立时钟进行测量。通过调整混杂因素和间隔持续时间（天）的混合效应线性回归模型比较个体内表观遗传年龄变化。结果按每200天间隔进行缩放。P值经多重检验校正。多变量逻辑回归探索了孕早期表观遗传年龄与潜在免疫介导并发症复合指标（高血压疾病、妊娠期糖尿病、37周前早产和小于胎龄出生体重）之间的关联，同时调整了时间1时的年龄和BMI高于30的因素。
结果： 共75名女性入组；45名（60.0%）怀孕，61名（81.3%）完成了研究。与非妊娠女性相比，妊娠女性在六个时钟（Hannum、PhenoAge、GrimAge、GrimAge2、干细胞分裂时钟、DunedinPACE）中表现出显著的个体内表观遗传年龄加速。妊娠组每200天的额外表观遗传年龄加速范围从1.58年（Hannum，95% CI，0.45-2.72，P=0.01）到5.28年（PhenoAge，95% CI，2.97-7.61，P<0.01）。孕早期GrimAge2每增加一年，妊娠并发症复合指标的发生几率增加36%（校正比值比[aOR] 1.36，95% CI，1.01-1.84），而时间1的实足年龄（连续年份）则无关联（aOR 1.00，95% CI，0.83-1.21）。
结论： 妊娠使个体内表观遗传年龄加速高达5.3年。孕早期GrimAge2年龄较大，但实足年龄并非如此，与妊娠并发症复合指标相关。这些发现表明，妊娠可能影响生物年龄，并支持进一步研究表观遗传年龄作为妊娠健康的潜在标志物。
表观遗传年龄在妊娠期间加速，孕早期较高的表观遗传年龄与妊娠并发症相关。
美国正面临孕产妇健康危机，孕产妇死亡率远高于其他高收入国家。这因40岁或以上妇女妊娠的急剧增加而加剧，自1989年以来，这一人群的出生率增加了194%。虽然高龄是妊娠并发症的明确风险因素，但仅凭实足年龄并不能可靠预测不良结局；一些年长妇女可能有无并发症的妊娠，而年轻妇女可能会出现意外并发症。这提出了一个问题：生物年龄是否比实足年龄更能预测妊娠风险？
生物年龄由增加疾病易感性的累积分子变化驱动，与非妊娠成年人的发病率密切相关。生物年龄的一个关键标志是表观遗传年龄，它测量与衰老过程相关的位点的DNA甲基化模式变化。这些表观遗传修饰已被用于计算表观遗传时钟。已经开发出三代时钟，具有不同的CpG位点和回归模型来计算表观遗传年龄：第一代时钟从表观遗传修饰预测实足年龄（例如，Horvath，Hannum），以年为单位；第二代时钟使用表观遗传变异预测死亡率（例如，GrimAge）或发病率（例如，PhenoAge），通常也以年为单位，但可能因测量内容而异；第三代时钟预测衰老速率（例如，DunedinPACE），以相对于1的值表示结果（即，衰老速率更快或更慢）。尽管文献中正在开发许多时钟，但本文重点关注13个常用时钟，这些时钟已在其他大型流行病学队列中得到验证，与死亡率、发病率和生活方式因素相关。
最近研究表明，妊娠会加速表观遗传年龄，产后几个月可能会减速。然而，这些表观遗传年龄变化尚未与同期非妊娠、初产、育龄妇女进行直接比较。由于表观遗传时钟是在年长的非妊娠人群中开发的，了解其在妊娠中的相关性与类似年龄的参照组相比至关重要。此外，尽管有限的数据表明加速的表观遗传年龄与早产等妊娠并发症之间存在联系，但我们需要更全面地了解所有可用表观遗传时钟在妊娠中的衰老过程。因此，我们旨在量化初产妊娠和非妊娠妇女在相似时间框架内的母体表观遗传衰老，并探索其与妊娠并发症的关联。我们假设与非妊娠状态相比，妊娠会加速表观遗传年龄。
方法
我们在2020年1月至2021年4月期间，对在单一四级医疗机构寻求门诊产科或妇科保健的18-50岁初产妊娠和非妊娠妇女进行了前瞻性队列研究。我们使用便利抽样筛查诊所中所有潜在合格患者；患者从妇产科专科和母胎医学亚专科诊所招募。妊娠妇女在妊娠10-14周时招募；选择此时间段是为了最大限度地减少早期流产导致的失访，并确保所有参与者在第一次血液采样时处于孕早期。如果妇女既往无持续超过13周的妊娠且能流利使用英语，则符合入选条件。排除标准（基于已知或理论与白细胞组成或衰老生物标志物的关联）包括：当前使用烟草或大麻；实体器官或血液恶性肿瘤病史；当前使用肝素或其衍生物抗凝；感染、疾病或损伤的体征或治疗（例如，活动性呼吸道疾病、使用抗生素或骨折）；前4周内进行手术；多胎妊娠；使用卵子捐赠；入组时已知胎儿致死性异常；以及计划终止妊娠。对于非妊娠妇女，额外排除标准是如果她们计划在下一年内怀孕。本研究获得斯坦福大学IRB批准，所有参与者均提供书面知情同意。遵循STROBE（加强流行病学中观察性研究报告）指南。
主要结局是研究期间表观遗传年龄的个体内变化，通过母体全血DNA测量。所有参与者在入组时（时间1）采集血液，妊娠组在产后第1天再次采血，非妊娠组在大约7-8个月后再次采血，以便妊娠组和非妊娠组的研究期间持续时间相似（时间2）。全血采集在EDTA管中，然后分装到Sardstedt SRS-72-694-006管中（每位参与者每个时间点七管），并在4小时内冷冻在-80°C。样本一起解冻，DNA使用Qiagen QIAamp 96 DNA血液试剂盒按照制造商说明提取，随后样本以随机顺序在Illumina EPIC 2芯片阵列上测量，确保一个人的两个时间点样本在同一板上。通过对照运行和板间随机重复样本来确保质量控制。
DNA甲基化预处理、标准化和分析使用R 4.4.1进行（在线附录1提供了详细信息）。分析中最初包括所有可用的表观遗传时钟。Horvath、Hannum、SkinBlood、PhenoAge、Yang（pcgtAge）、GrimAge和GrimAge2时钟使用在线时钟计算器计算。Lin、Weidner、Vidal-Bralo和Zhang时钟通过获取其各自出版物中的预测CpG和系数，使用当前数据集中的CpG，并计算甲基化值乘以相应时钟系数并求和以获得其分数来计算。DunedinPACE使用DunedinPACE 0.99.0计算。
这些时钟以各种方式提供结果：1) Hannum、Horvath、Weidner、Vidal-Bralo、Lin、SkinBlood、Zhang、PhenoAge、GrimAge和GrimAge2以年为单位；2) DunedinPACE（表观遗传计算的衰老速率）以速率表示，值为1表示生物衰老等于实足年龄，小于1的值表示较慢，大于1的值表示较快；或3) 与癌症风险相关的干细胞分裂预测，值为0表示模型中包含的与干细胞分裂相关的CpG位点的平均甲基化状态（Yang干细胞分裂率）。例如，实足年龄为35岁，表观遗传年龄为40岁，DunedinPACE为0.5表明表观遗传年龄大于实足年龄，但衰老速率正在减慢。
样本量由另一种衰老生物标志物——白细胞端粒长度的数据决定，作为代理，因为年度变化数据在文献中更容易获得，它是预期的表观遗传时钟测量之一。我们估计了80%检验效能和双侧α为0.05所需的最小样本量，并估计了白细胞端粒长度缩短50%的研究结果的效应大小。使用这些研究参数并允许非妊娠组25%的失访率和妊娠组10%的失访率，我们计算出研究需要招募53名非妊娠和46名妊娠参与者。
其次，我们探索了孕早期（时间1）表观遗传年龄与妊娠组后续并发症之间的关联，这些并发症已知与高龄产妇实足年龄相关或可能由潜在免疫介导过程引起。由于问题的探索性质和小样本量，妊娠并发症被建模为时间1后发生的事件的复合指标：产前或产时子痫前期或妊娠高血压、妊娠期糖尿病（GDM）、小于胎龄出生体重（SGA，出生体重低于胎龄第10百分位）、以及37周前早产。GDM诊断记录为在时间1和时间2之间任何时间发展的A1或A2 GDM，并非在入组时已存在。在我们机构，我们进行常规24-28周1小时葡萄糖耐量试验，如果1小时葡萄糖耐量试验结果升高，则进行3小时葡萄糖耐量试验以确诊。此外，对于因临床因素而GDM风险较高的患者，建议进行早期葡萄糖耐量试验。
暴露是妊娠状态，通过医疗记录摘要和参与者报告确认。社会人口学和临床变量，包括实足年龄、入组时（时间1）的身体质量指数（BMI，计算为千克体重除以米身高的平方）、教育水平、作为社会构建的种族和民族、以及医疗合并症（神经、精神、甲状腺或自身免疫疾病；1型或2型糖尿病；慢性高血压）从医疗记录摘要和参与者自我报告中收集。由于样本量小，在主要分析和妊娠组的二次亚分析的两个模型中，实足年龄被认为是最重要需要调整的混杂因素。对于二次亚分析，入组时的BMI被包括为第二个潜在混杂因素，考虑到其与妊娠并发症和表观遗传年龄的已知关联，以及它可能是潜在慢性疾病状态的替代指标。
使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量，使用Fisher精确检验比较分类变量，比较妊娠和非妊娠组之间的参与者特征。对表观遗传时钟进行质量控制评估，仅分析数据集中至少80%必要探针存在的时钟。计算所有时钟对实足年龄的表观遗传年龄预测的准确性，并以相关系数、均方根偏差和组内相关系数报告。
对于主要结局，使用混合效应线性回归模型比较妊娠和非妊娠组之间随时间的个体内表观遗传年龄变化，调整实足年龄作为混杂因素以及妊娠状态和测量之间天数之间的统计交互作用（模型1），使用R中的lmer函数。为了提高交互项β系数的可解释性，它们乘以妊娠组时间1和时间2之间的平均持续时间（天）（200天）。作为敏感性分析，将免疫细胞类型分布作为协变量添加到单独的模型中。由于时钟考虑了组织类型，调整细胞比例的敏感性分析不是主要模型，因为它可能过度调整。最后，使用lm 4.4.1函数的协方差分析在每个单独时间点比较妊娠和非妊娠组之间的表观遗传年龄。目标1的P值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。
对于二次子研究，使用逻辑回归比较时间1的所有孕早期表观遗传年龄与妊娠或分娩并发症的复合指标（高血压疾病、GDM、37周前早产和SGA出生体重），调整时间1时的年龄和BMI高于30作为潜在混杂因素。主要分析使用R 4.4.1在RStudio 2023.06.0+421中进行，二次分析使用SAS Studio 2024进行。
结果
总共筛查了305名女性；250名符合条件，75名（30.0%）入组并分析。其中，45名为妊娠，30名为非妊娠。由于2020-2021年新冠疫情期间前所未有的研究变化以及一名参与者在入组后退出，当妊娠组达到45名参与者时，入组结束。入组时的特征在各组之间相似；值得注意的是，实足年龄相似，妊娠组所有参与者均在孕早期入组，使得到产后测量的时间相似。共有14名参与者失访：45名妊娠参与者中，43名（95.6%）返回时间2，而非妊娠参与者中18名（60.0%）返回（P=0.02）。返回时间2的参与者与未返回的参与者在社会人口学变量方面相似。非妊娠组在时间1和时间2之间的随访间隔较长（非妊娠中位数232天[四分位数1和3，205，260天]，妊娠198天[四分位数1和3，187，206天]，P<0.01）。
对于主要分析，DNA甲基化分析检测到的CpG位点平均百分比为99.9%。所有表观遗传时钟预测实足年龄的准确性在在线附录3中提供。在最初计算的13个表观遗传时钟中，11个具有足够的CpG覆盖率并进行了分析。在入组的75名参与者中，61名有来自两个时间点的样本，用于分析个体内变化。在Hannum、干细胞分裂、PhenoAge、GrimAge、GrimAge 2和DunedinPACE时钟方面，妊娠组比非妊娠组在随时间的个体内表观遗传年龄加速方面显著更大。个体内表观遗传年龄加速最大的是PhenoAge和GrimAge2，与非妊娠组相比，妊娠组在200天间隔内分别额外获得5.28（P<0.01）和4.56（P<0.01）表观遗传年。这在图2中以图形方式展示，该图展示了时间1和时间2时妊娠与非妊娠队列之间每个表观遗传时钟的箱线图。在调整细胞比例的敏感性分析中，结果相似，对GrimAge、GrimAge2和DunedinPACE最稳健。
我们还分别在两个时间点横向比较了妊娠组和非妊娠组之间的表观遗传年龄。在时间1，妊娠组的平均表观遗传年龄比非妊娠组老（GrimAge β=1.65，P<0.01；GrimAge2 β=2.74，P<0.01；DunedinPACE β=0.09，P<0.01）。在时间2，妊娠组对于相同的三个时钟的平均表观遗传年龄比非妊娠组老，此外干细胞分裂较低（β=-0.01，P<0.01）。
对于二次分析，44名妊娠参与者有时间1的血液抽样和结果数据可用。评估了所有11个表观遗传时钟与妊娠并发症复合指标的关联。17名参与者（38%）经历了至少一个复合事件；9名（20%）发展为妊娠高血压疾病，6名（13%）发展为GDM，3名（7%）在37周前早产，1名（2%）有SGA出生体重的新生儿。在我们研究中发展GDM的6名参与者中，其诊断的孕龄范围为13 5/7周至26 5/7周，其中6名GDM诊断中有2名根据早期筛查在24周前发生。时间1时GrimAge2时钟中表观遗传年龄每增加一年，妊娠并发症复合指标的发生几率增加36%（校正比值比1.36，95% CI，1.01-1.84）。相比之下，实足年龄与妊娠并发症复合指标无关（校正比值比1.00，95% CI，0.83-1.21）。
讨论
在7个月期间，我们发现与初产非妊娠女性相比，初产妊娠女性在六个反映发病率和死亡率风险的表观遗传时钟上表现出更大的个体内表观遗传年龄加速。孕早期GrimAge2表观遗传年龄与妊娠并发症的复合指标有轻微关联。这些发现为越来越多的证据做出贡献，表明妊娠可能影响生物年龄，并强调孕早期表观遗传年龄作为妊娠并发症预测因子的潜在价值。
表观遗传年龄加速已与整个生命周期的不良健康结局相关，包括心血管疾病和死亡率。在我们的妊娠队列中，最强烈反映年龄加速的时钟——PhenoAge、GrimAge2和DunedinPACE——是为预测发病率和死亡率而开发的。结果在多个时钟之间保持一致，并在调整细胞类型组成后仍然一致，这表明表观遗传变化可能反映了超过妊娠预期免疫变化的内容。这些数据支持并扩展了先前的研究，例如Poganik等人的报告，该报告也描述了妊娠中可逆的表观遗传年龄加速。一个普遍的假设是，母体分子资源被重新导向胎儿发育，以牺牲体细胞维持为代价，可能导致短暂的母体表观遗传年龄加速。分娩后，这些母体体细胞效应可能会或可能不会恢复到基线。
我们研究的一个关键优势是包括初产、年龄相似的非妊娠对照组。这有助于区分妊娠相关变化与育龄女性中的背景衰老，解决了先前研究中的一个空白。虽然过去的横断面研究已将多产与较老的表观遗传年龄联系起来，但很少有研究在初产队列中前瞻性地评估这些模式。此外，这一观点可能与产后表观遗传年龄减速的概念形成对比，一些研究已注意到这一点；这可能涉及影响随时间表观遗传年龄的产后生活方式习惯、母乳喂养、睡眠和恢复的变化。我们的时间2结果是在产后立即获取的，理论上会最小化这些产后效应对衰老的可变性，这是一个重要但不同的问题。
值得注意的是，我们观察到，较老的孕早期GrimAge2比实足年龄与潜在免疫介导的妊娠并发症复合指标有更强的关联。我们应该承认，尽管这些并发症的一些潜在途径可能是免疫介导的，但其他途径可能不是（例如，早产的宫颈功能不全或SGA出生体重的胎儿构成生长潜力）。这些结果增加了该领域的其他文献，例如Gascoigne等人的工作，该工作将加速母体表观遗传年龄的一些测量与早产风险增加联系起来。在我们的队列中，表观遗传年龄加速在妊娠早期就已经开始。可能是免疫耐受的早期干扰在并发症本身显现之前就反映在表观遗传年龄变化中。
我们的发现表明孕早期表观遗传年龄作为妊娠并发症预测因子的潜力，鉴于人们对个性化医疗方法的日益关注，这可能特别有趣。如果得到验证，这可能会为有针对性的早期干预打开大门。因为表观遗传年龄是可改变的，可能有可能在这些并发症发生之前减轻风险。需要进一步研究以确定在妊娠前或妊娠早期逆转表观遗传年龄是否可行或有益。此外，我们的结果强化了妊娠作为生理"压力测试"的概念，可能揭示长期慢性疾病的脆弱性。
需要进一步量化产后时期和后续妊娠对个人生命周期中表观遗传衰老的影响。GrimAge2与妊娠并发症之间的观察到的关联需要在更大的队列中进一步调查，以阐明潜在机制。一些时钟（例如，Horvath）在我们样本中与实足年龄的相关性较低，可能是因为它们的测试和验证队列是包括男女的较老人群，或者是因为EPIC 2芯片（可能显示与早期时钟的年龄偏差）。我们的样本在同一阵列上运行，所有比较都在我们的队列内进行，这应能最大限度地减少偏差。朝着开发妊娠特异性时钟的方向探究差异甲基化区域是这项工作的自然进展。
我们应该注意几个局限性。由于新冠疫情，非妊娠组中更多的参与者失访且研究访问之间的间隔更长，这可能引入选择偏差；值得注意的是，返回和未返回时间2的参与者的特征相似。如果有的话，更长的时间间隔应该导致非妊娠组显得老化更多，并使结果偏向零假设。我们对妊娠并发症的二次分析使用了结果的复合指标，这是由于我们可用的小样本量，增加了残余混杂的可能性。我们使用产后第1天的母体血液估计表观遗传衰老轨迹，而不是第三孕期。尽管我们这样做是为了最大限度地提高检测表观遗传生物标志物随时间的可测量变化的能力，并最大限度地减少参与者负担，但未来研究应评估第三孕期表观遗传年龄与产后第1天相比如何，以及这是否受分娩方式影响。需要在妊娠期间和妊娠后进行额外的随访，以确定这些模式是否会随时间持续。我们没有达到预期的样本量，这可能导致II型错误。
我们研究的优势包括使用年龄相似、非妊娠、初产对照组以及我们严格的数据质量和纵向设计。我们还提出了关于母体表观遗传衰老与妊娠并发症关系的创新性发现，值得进一步评估。
总之，在7个月内，初产妊娠女性与年龄相似的非妊娠对照组相比，表现出高达5年的额外表观遗传年龄加速。孕早期GrimAge2表观遗传年龄与妊娠并发症相关。随着实足年龄较大的妊娠变得越来越普遍，这些发现表明表观遗传时钟可能在进一步理解妊娠生理学和风险方面发挥作用。需要进一步研究以确定表观遗传年龄是可修改的目标还是对妊娠不良结局潜在易感性的标志物。
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