摘要
背景：过去十年间，大量研究强调了肠道微生物群（GM）在维持机体稳态中的关键作用。GM失衡与多种功能障碍相关，包括代谢和神经发育障碍。GM受多种因素影响，其中包括某些药物（如第二代抗精神病药物[SGAs]）的使用，并反过来作用于内分泌、免疫和神经系统。尽管对微生物群-肠-脑轴的兴趣日益增长，但我们对SGAs如何影响GM及其宿主代谢特征的理解仍存在显著空白。
目标：本研究旨在拓展当前对SGAs对接受SGA治疗的儿童青少年临床参数、微生物和代谢谱以及行为影响的认识。
方法：这是一项前瞻性纵向研究，将在SGAs引入前和引入后3至6个月评估其影响。将采用综合方法，包括临床数据（如体重、血脂谱和葡萄糖水平）；微生物组和代谢组分析；情绪、行为和睡眠模式（通过精神科量表评估）；以及饮食习惯。
结果：该项目于2023年11月获得资助，并将于2026年1月开始数据收集。预计将于2027年完成。
结论：本研究有望提供关于SGAs对儿童青少年多维影响的见解，包括临床数据、GM微生物谱、代谢和行为。研究结果可能有助于更好地理解治疗影响，并为更个性化的治疗策略提供信息。
国际注册报告标识符（IRRID）：PRR1-10.2196/77374
关键词
精神障碍；肠道微生物群-脑轴；微生物组；代谢组；第二代抗精神病药物
引言
与宿主密切相关的微生物群落（统称为微生物群）已进化并与人体多个区域共生，其中胃肠道浓度最高。越来越多的证据支持GM对宿主健康的相关性。它参与广泛的生理过程，如营养代谢、胃肠道运动、免疫调节，甚至神经功能。另一方面，GM组成受多种宿主相关因素影响，包括年龄、生活方式和药物干预，如抗精神病药物，这是本研究的重点。
在生命早期，GM特别容易受到环境因素的影响，对免疫、代谢和神经内分泌通路产生长期影响。在关键发育阶段的扰动可能通过免疫失调和改变的神经发育信号使儿童易患不同疾病。这些联系尚待理解，它们突显了专注于儿科人群研究的重要性。
抗精神病药物的使用，尤其是第二代抗精神病药物（SGAs），已远远超出其主要适应症，并在3岁左右的儿童中使用增加。SGAs被用于标签外条件，包括焦虑、自闭症和注意缺陷/多动障碍。尽管具有治疗潜力，但在年轻人中使用SGAs与重要副作用相关，包括体重增加、代谢紊乱、心脏病和镇静等。
儿童和青少年似乎特别容易受到抗精神病药物影响。这些副作用可能迅速出现且广泛，研究表明在治疗的前15周内体重显著增加，几乎所有研究的抗精神病药物都与临床相关体重增加（≥7%）相关。值得注意的是，在成人中被认为是中性的药物在年轻人群中可能导致体重增加。
鉴于SGAs影响的复杂性，全面监测SGAs与临床、微生物、代谢和行为数据之间的相互作用对于开发更安全和更个性化的治疗策略非常重要。据此，本研究的主要目的是评估SGA治疗前后（3至6个月）儿童青少年关键临床参数、GM组成和代谢特征的变化。次要目标是评估行为、情绪调节、睡眠和饮食参数，并探索它们与微生物、代谢和临床变化的潜在关联。为此，定义了以下具体目标：
- 评估两个时间点的体重、BMI、腹围、葡萄糖水平和血脂谱变化
- 比较SGA治疗前后的GM和代谢谱
- 使用经过验证的心理测量工具（情绪调节检查表、青少年行为量表和匹兹堡睡眠质量指数）评估行为、情绪调节和睡眠质量，这些工具已针对研究人群进行了调整
- 调查治疗前后饮食模式的变化及其与评估参数的关联
- 通过统计建模技术，探索所研究因素与SGA引入及其他可能影响结果的变量（如药物和年龄）之间的潜在联系
通过这种方式，本研究旨在解决文献中的当前空白，因为据我们所知，之前没有研究将临床参数与SGA治疗背景下的代谢组和微生物组数据整合。结果可能有助于识别关联，这些关联可能在未来有助于阐明GM如何与这些药物的副作用相关联的机制。
方法
研究设计
这项前瞻性观察性研究将在两个时间点评估SGAs对儿童青少年的影响：治疗开始前（基线）和治疗开始后3至6个月。不会应用任何干预，所有数据将作为参与者常规临床护理的一部分收集，从而允许监测与SGA使用相关的代谢、微生物、行为和临床参数的时间变化。本研究遵循STROBE（加强流行病学中观察性研究报告）指南，为观察性研究的透明和全面报告提供结构化框架。
研究人群
参与者将从米纳斯吉拉斯联邦大学医院诊所的普通儿童精神病学、自闭症谱系障碍和注意缺陷/多动障碍门诊招募。符合条件的参与者将包括6至17岁的儿童和青少年，他们有抗精神病治疗的临床指征但尚未开始治疗。
样本量
在这项观察性研究中，参与者招募将逐步进行，取决于临床环境中开始SGA治疗的合格个体的可用性。这种设计符合常规临床实践；然而，它可能影响随时间招募的参与者数量。样本量估计使用单样本t检验计算，以治疗前后体重差异为主要结果，因为其对SGAs的反应稳健且早期。
统计功效和显著性水平分别设定为0.80和0.05，这是通常接受的值。效应量估计为0.58，基于我们研究小组先前进行的一项研究的未发表数据。鉴于先前数据集的样本量有限，且此估计接近中等效应量的常规阈值，为计算采用了更保守的Cohen dz值0.5。基于此假设，至少需要34名参与者。
先前数据还表明约23%的辍学率（30名招募参与者中有7名未提供任何样本、未在规定时间返回进行第二次采样或中断SGA治疗）。因此，考虑此信息，研究所需的最终参与者人数为45名。随着GM和代谢组数据的可用，此估计可能会得到完善。
数据收集
招募将在患者的常规医疗访问期间进行。如果指示SGA治疗，将向父母和患者解释研究，获得父母同意和儿童同意后，在治疗开始前和开始后约3至6个月收集血液和粪便样本。在初次访问时，招募后，将测量患者的身高、体重、腹围和臀围。由南美青年/儿童心血管和环境研究小组提供的饮食模式问卷将由父母或儿童填写并返回给研究人员。
为最大限度地减少不适，血液样本将与常规实验室测试（空腹葡萄糖、糖化血红蛋白、总胆固醇及其分数以及甘油三酯）一起收集，这些测试安排在随访预约时进行，无需额外的静脉穿刺。对于代谢组学分析，血浆将从4-乙二胺四乙酸管中的血液样本中通过在4°C下以3000 g离心15分钟提取，并分成尽可能多的300 µL等分试样。代谢组学将通过学术合作使用液相色谱与质谱联用进行。
关于粪便样本，在请求实验室测试的同一次访问中将提供收集套件（Coloff），并附有详细的使用和存储说明。粪便收集可在家中进行，最好在血液测试的同一天或前一天。参与者将被指示将材料保持在冷藏（2°C至8°C）状态，直到交付给研究工作人员，然后将其分成0.25 µg并保持在-80°C，直到进一步处理。对于微生物组分析，将使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒（Qiagen）从粪便样本中提取总DNA，按照制造商的说明进行。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）评估提取DNA的浓度和质量。鸟枪法宏基因组学将在Illumina平台上由待确定的测序服务提供商进行（配对端150 bp），每个样本至少6 GB的数据。
鉴于有限的证据支持仅归因于抗精神病药的行为改善以及显著的不良反应风险，还将调查行为变化。该方法将使用经过验证和标准化的工具进行，这些工具评估每位参与者的由护理人员和患者报告的情绪和行为状态以及睡眠模式。关键评估工具包括：
- 儿童和青少年行为量表：一种广泛谱的工具，用于评估6至18岁儿童和青少年的行为和情绪症状，在巴西人群中已得到验证。它涵盖多个领域，包括焦虑、抑郁、注意力问题和行为障碍。
- 情绪调节检查表：该工具评估情绪功能，侧重于调节和波动性或消极性；它也已在3至12岁巴西儿童的背景下得到验证。
- 匹兹堡睡眠质量指数：该问卷评估一个月期间睡眠质量的各个方面。已在巴西儿童和青少年中验证，特别适用于识别睡眠障碍。
数据分析
微生物组和代谢组宏基因组数据分析涉及使用不同生物信息学工具的几个步骤。最初，将进行质量控制以去除低质量序列和适配器污染。FastQC将用于质量评估，Trimmomatic用于修剪。使用Bowtie2通过与宿主基因组比对去除宿主DNA。过滤后的读数将使用metaSPAdes组装成重叠群，然后使用Prodigal进行基因预测。使用Kraken2进行分类分析。使用DIAMOND结合UniProtKB进行功能分析，然后映射到KEGG（京都基因与基因组百科全书）直系同源系统。
将使用R包（包括Phyloseq、Vegan和DESeq2）进行统计分析和数据可视化，以探索样本间的群落结构、多样性和差异特征。将使用定量PCR量化抗精神病治疗开始前后识别的差异丰富和临床相关的微生物，以确定其绝对浓度并提高实验可重复性。将从文献中选择特定引物，并为每个目标构建标准曲线。
代谢组数据将使用R包XCMS进行处理，用于峰检测、对齐和归一化。随后将在MetaboAnalyst中进行单变量和多变量统计分析，显著代谢物将针对Curated数据库进行注释，包括KEGG、Lipid Maps和人类代谢组数据库。该方法将实现时间点之间的比较，并识别与治疗相关的代谢模式。
精神科量表和营养数据精神科量表的选择基于其特定指征，使用每个量表的评分系统来评估症状的存在和严重程度。结果将与其他变量（如临床、微生物学和代谢数据）一起分析，以提供对SGAs对患者行为、睡眠模式和情绪状况影响的全面理解。
将使用饮食决定因素问卷（DDQ）和食物频率问卷（FFQ）调查饮食习惯，如果参与者在研究评估的任何其他变量（临床、微生物学、代谢或精神病学）中呈现改变，则将结果信息包括在分析中。DDQ将通过主题部分进行定性分析。将识别与研究目标直接相关的项目并进行二分编码，例如，"消耗给定食物"与"不消耗"，以及"认为超重"与"认为体重不足"，以表征父母做法、儿童/青少年饮食自主性和整体饮食行为。
FFQ将根据每个食物项目的消费频率（例如，从不或每周一次，2至4次每周，或每天一次）进行定性和分类分析。这种分类将允许识别与参与者营养状况相关的饮食模式，重点是相关食物组（包括超加工食品和含糖饮料等）。此外，将通过将FFQ和DDQ数据与研究期间观察到的临床结果相结合，进行综合个体水平分析。
统计临床结果（体重、BMI、腰围和臀围、葡萄糖和血脂谱）将使用适合数据分布的基于回归的方法进行分析，体重变化作为主要结果。模型将根据年龄、诊断、采样间隔、SGA类型和剂量（氯丙嗪当量）进行调整。
为了整合数据集，将使用相关分析来评估GM变化（多样性测量和临床相关细菌分类群的差异丰度）、代谢谱和临床结果之间的关联。当样本量允许时，分析将按SGA和年龄组分层。将使用0.05的显著性水平，并提供感兴趣结果的置信区间。
伦理考虑
研究方案已提交并获得巴西国家研究伦理委员会批准（CAAE 79026224.4.0000.5149）。本研究的伦理方面已仔细考虑，以确保所有参与者的保护和福祉。潜在益处包括改进对SGAs使用代谢和行为影响的理解，这可能有助于更个性化的治疗策略。血液采集相关联的最小物理风险，粪便采样可能引起潜在的心理或社会不适。没有计划的补偿，因为这是一项没有干预的观察性研究；但是，将有一个专门的团队随时提供必要的帮助。
所有参与者及其法定监护人将获得关于研究的全面信息，包括其目标、程序、潜在风险、补偿和益处。在参与与项目相关的任何活动之前，将获得父母或法定监护人的知情同意以及儿童的同意。知情同意书明确指出参与的自愿性质，有权随时无处罚退出研究，以及确保保密性的措施。个人和临床数据将被匿名化并安全存储，仅限授权研究人员访问，符合数据保护法规。
结果
该项目于2023年11月获得资助，并将根据批准的方案进行。数据收集预计将于2026年1月开始，持续到2027年6月。结果预计将于2027年可用于发表。
我们研究小组先前进行的一项研究的初步未发表数据使我们能够评估参与者依从性并确定关键的后勤和程序挑战。在该队列中，招募了30名参与者；11名提供了粪便样本；7名中断了他们的参与。在最初同意的合格个体中观察到约23%的辍学率，主要与粪便样本要求相关。
在先前的研究中，参与者在年龄（平均8.7，SD 4.1）和性别（全部为男性）方面同质。临床概况包括20名自闭症谱系障碍儿童，8名对立违抗性障碍，以及2名合并注意缺陷/多动障碍和对立违抗性障碍。预计在当前项目中诊断类别和性别分布的比例相似。
讨论
SGAs是儿童和青少年精神病学中的重要治疗选择，有助于稳定精神分裂症、双相情感障碍和精神病性抑郁症等疾病。它们还用于管理其他疾病，包括自闭症、抽动和儿童攻击行为。然而，抗精神病药物引起的体重增加和相关代谢紊乱是频繁且临床相关的不良反应，由多种相互作用的机制导致，并导致预期寿命减少。
如前所述，SGAs可干扰食欲和代谢调节，导致能量失衡。这些影响通过不同机制发生，如激素水平（例如瘦素、胃饥饿素、脂联素和胰岛素）和神经递质通路的变化，包括多巴胺D2受体拮抗，这是抗精神病药的共同特征，与饮食行为相关。GM的改变也与SGAs不良反应相关，因为这些药物可以改变肠道微生物组成，并促进例如炎症细胞因子释放，这可能通过双向肠-脑相互作用导致代谢失调。本研究涉及的宏基因组学和代谢组学可能提供关于GM和血浆代谢物变化之间潜在关联的宝贵见解，有助于理解与SGA相关代谢影响相关的生物途径。
可以使用不同的策略来减轻抗精神病药的不良影响，包括使用辅助药物如二甲双胍，这可能有助于预防或减少代谢并发症，包括体重增加。尽管二甲双胍使用广泛，但也存在挑战。胃肠道副作用如恶心、腹泻和腹部不适很常见，特别是在治疗开始时。因此，依从性可能会受到影响，特别是在儿科或精神病人群体中。在这种情况下，关于SGAs、GM和饮食模式之间相互作用的研究对于指导循证营养方法和减少过度药物干预非常重要。
这些考虑导致了对了解抗精神病药物如何影响GM的兴趣日益增长。例如，一项类似于本研究的研究确定了接受SGAs治疗的超重儿童的GM分类和功能改变。然而，由于饮食模式和微生物群谱在不同人群中差异很大，要实现对SGAs在GM影响的临床有意义理解并成功进行基于微生物群的干预，需要在不同治疗环境中进行纵向调查。
本研究展示了相关优势，特别是其全面的方法，解决了可能受SGA治疗影响的参与者功能的多个领域。使用经过验证的心理测量工具和标准化的样本收集协议增加了方法学的严谨性。此外，参与者内部比较减少了与个体间变异相关的偏差风险。然而，该研究也存在相当大的局限性，特别是与合格患者的可用性相关的样本量受限，采样间隔的变化，以及预期的辍学率，这突显了增加参与度策略的必要性。
另一个重要局限是男性参与者占主导地位，反映了研究环境中最常被推荐进行抗精神病治疗的临床人群。这种性别不平衡限制了研究结果的普遍性，尽管将尽一切努力尽可能包括女性参与者。仅在两个时间点进行评估也可被视为局限性，因为它限制了对微生物组、代谢组和临床结果长期轨迹的评估。尽管第三次随访访问将加强研究，但可行性限制阻止了将其纳入本方案。此外，观察性设计不允许因果推断，潜在混杂因素如合并症、并发药物和环境因素可能影响结果，尽管尝试标准化。
因此，尽管本研究可能通过整合SGA药物可能对儿科人群产生的不同方面带来相关信息，但必须承认存在相当大的可行性挑战。随访间隔的变化以及与参与者依从性和样本收集相关的困难可能影响数据完整性并引入异质性。预计的样本量也限制了统计功效，限制了多层次分析的范围。然而，随着参与者的数量增加，这种局限性有望减轻，从而允许更精确的效应量估计。最后，研究结果应被视为探索性和假设生成的，主要旨在识别趋势并为具有更大队列的未来研究做出贡献。
致谢
作者感谢Carvalho等人善意提供本研究中使用的食物频率问卷和饮食决定因素问卷。作者承认，手稿的组织受益于人工智能工具（ChatGPT）的协助，以增强可读性和语法准确性。作者对内容、数据解释和工作的科学严谨性负全部责任。
资助
作者感谢政府资助机构CAPES（高等教育人员完善协调基金会）、CNPq（国家科学技术发展委员会）、FAPEMIG（米纳斯吉拉斯州研究支持基金会）和国家科学与技术神经技术研究所（INCT NeurotechR）（分别授予2023年CNPq通用拨款、2024年CNPq和2023年INCT NeurotechR拨款）
数据可用性
数据共享不适用于本文，因为本研究未生成或分析任何数据集。
利益冲突
无声明。
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