女性胸腺T细胞受体库选择偏向自身免疫现象Thymic selection of the T cell receptor repertoire is biased toward autoimmunity in females

女性胸腺T细胞受体库选择偏向自身免疫现象

女性约占自身免疫疾病患者的80%。这一现象可能部分源于胸腺细胞发育过程中T细胞受体(TCR)选择的性别差异，可能受激素影响以及女性自身免疫调节因子(AIRE)转录因子表达较低所致。为探究这一问题，我们分析了TCR生成和选择的性别特异性差异。我们检查了来自男性和女性器官捐献者的双阳性胸腺细胞和单阳性胸腺细胞（包括CD8⁺和CD4⁺效应T细胞以及调节性T细胞）中的TCR库。在V和J基因使用方面观察到的性别差异极小，TCR库多样性、互补决定区3(CDR3)长度、氨基酸组成或网络结构方面没有明显差异。没有TCR序列仅限于某一性别。然而，与男性相比，女性效应T细胞中针对与自身免疫相关的自身抗原的TCR显著更为普遍，而女性调节性T细胞中此类TCR的频率则较低。对于针对与自身免疫无关的自身抗原或与癌症或病毒相关的抗原的TCR，未观察到这些差异。我们的研究结果突显了TCR选择中与自身免疫相关特异性的性别特异性不平衡，为女性对自身免疫疾病易感性增加提供了机制性见解。

引言

多项研究表明免疫系统相关疾病存在性别不平衡现象。对于自身免疫疾病(AIDs)尤其如此，其中80%的患者为女性，且不同病理的疾病严重程度在两性之间有所不同。此外，男性受如COVID-19和结核病等传染病的影响更为严重。对预防性免疫疗法（如疫苗接种）以及治愈性治疗（如免疫检查点抑制剂或抗TNF-α）的反应也具有性别依赖性。所有这些观察结果表明男性和女性之间的免疫反应存在内在生物学差异。

已确定多种可能有助于解释这些观察到的性别差异的因素。其中，性激素已被证明通过作用于表达这些激素特异性受体的免疫细胞来影响免疫反应。性激素可能通过作用于胸腺上皮细胞中自身免疫调节因子(AIRE)的表达，直接影响胸腺细胞分化和选择过程中的适应性免疫反应。AIRE驱动胸腺中原本组织特异性抗原的表达，有助于效应细胞的阴性选择和识别此类抗原的调节性T细胞(Tregs)的阳性选择。睾酮增加髓质胸腺上皮细胞中AIRE的表达，而雌二醇则降低其表达。此外，最近一项研究表明，胸腺中这些特化的抗原呈递细胞的转录组谱在男性和女性之间存在差异。这明确表明TCR库在男性和女性之间的选择可能存在差异。

尽管有这些发现，关于两性之间TCR库的潜在差异知之甚少。TCR的生成是T细胞发育中的关键过程，发生在胸腺中。TCR由两条链组成，α(TRA)和β(TRB)，每条链都源于涉及V(可变)、D(多样性，仅适用于TRB)和J(连接)基因的随机基因重排。这些基因片段的组合伴随着插入和删除，创建了一个高度多样化的区域，即互补决定区3(CDR3)。TCR的这一区域主要与肽相互作用，这种相互作用对抗原识别和随后的T细胞激活至关重要。通过CDR3特异性识别各种抗原的能力是适应性免疫反应效率和特异性的核心。

由于TCR是随机生成的，许多可能无用，而一些可能通过识别自身抗原引起自身免疫而有害。目前的范式是，在胸腺细胞发育过程中，胸腺细胞基于其TCR与皮质和髓质胸腺上皮细胞呈递的抗原的亲和力进行选择。表达TCR亲和力过低或过高的胸腺细胞被消除(阴性选择)，而具有中等亲和力的胸腺细胞被阳性选择并成熟为单阳性细胞，即CD4+或CD8+。具有最高这些中等亲和力的胸腺细胞在调节性T细胞中发育。由于AIRE在这些过程中发挥重要作用，AIRE表达的性别差异可能对胸腺选择产生重大影响。

女性和男性外周T细胞的TCR库研究表明，它们的多样性，特别是TRB库的多样性，不仅受个体年龄影响，还受性别影响。然而，另一项研究显示个体性别与TCR库多样性之间没有关联。然而，外周血TCR的研究反映了已经历过多次免疫反应的免疫系统。例如，观察到的男性和女性对与自身免疫相关的自身抗原反应的差异可能反映病因(TCR驱动疾病)或后果(TCR因疾病而扩增)。

为评估男性和女性之间TCR库生成和胸腺选择是否存在显著差异，我们专注于分析胸腺细胞的TCR库。这些细胞是T细胞发育的最新产物，尚未参与免疫反应。因此，它们的库代表了用于分析CD4/CD8双阳性(DP)细胞的TCR生成机制，以及CD4和CD8单阳性(SP)T细胞的TCR选择机制。我们生成了一个独特数据集，包括来自器官捐献者(婴儿和成人)的DP细胞、CD8和CD4 SP效应细胞以及CD4 SP调节性T细胞的TRA和TRB链序列。使用最先进的策略对TRA和TRB库进行分析，揭示了DP细胞库中无性别差异，但在女性中CD8 SP T细胞的选择偏向自身免疫。

结果

胸腺细胞亚群中TCR V和J基因使用的性别差异极小

TCR生成多样性的第一层次是V和J基因的使用。我们分析了每个胸腺细胞群中TRA和TRB V和J基因及其组合的使用情况。

男性和女性在V基因使用方面相对相似，这通过主成分分析(PCA)中缺乏明显的分离得到证实，无论是TRA还是TRB，以及所有研究的细胞亚型。然而，我们观察到男性和女性之间在V和J基因使用方面的一些个体差异，其中一些特定于某些细胞亚型，而另一些则在多个细胞亚型中观察到。例如，TRBV6-5在女性DP细胞和CD8 SP细胞中表达高于男性。

接下来，我们使用Jensen-Shannon散度(JSD)分数比较了所有个体之间TRA-TRAJ和TRBV-TRBJ基因组合的使用情况。层次聚类显示，对于任何链或细胞亚型，男性和女性个体之间都没有明显的分离，表明男性和女性之间基因组合使用没有显著差异。在直接分析这些V-J基因组合的频率时也得出了类似的观察结果。

男性和女性之间TCR库多样性相当

TCR库的高度多样性对于生成针对各种抗原的广泛潜在反应性至关重要。因此，我们比较了男性和女性之间的TCR库多样性。为此，我们分析了Réyni多样性曲线（从零到无限α参数），这些曲线测量TCR库多样性的各个方面。在不同的α值下，Réyni指数对最频繁克隆型的贡献赋予更多或更少的权重。较高的α值强调最丰富的克隆型，从而揭示扩增克隆对整体多样性的影响。

Réyni曲线显示DP和CD4 Teff细胞中两性之间的多样性相当，无论是TRA还是TRB，而在CD8和CD4调节性T细胞中存在差异。在CD8细胞中，曲线在低α值时开始分叉，男性出现更早的拐点，表明TCR克隆的分布不平衡。这表明在男性中，与女性相比，在较低的多样性阈值下，较少的克隆主导库。在调节性T细胞中，虽然拐点相似，但差异似乎表现为女性比男性具有更高的多样性和丰富度。然而，对于Shannon多样性指数(α=1)、Simpson指数(α=2)和Berger-Parker指数(α=无穷大)，无论链还是所有细胞亚型，均未观察到显著差异。这些结果表明胸腺TCR库多样性在男性和女性之间是相似的。

男性和女性TCR库中CDR3aa长度分布相当

库多样性的大部分是通过VDJ连接处内随机添加核苷酸生成的，产生与肽-MHC复合物相互作用的高度可变CDR3区域，主要驱动TCR特异性。CDR3长度直接影响TCR与肽相互作用的能力。因此，我们研究了男性和女性之间CDR3 aa(CDR3aa)序列长度的分布，以识别潜在的TCR生成和/或选择偏差。

我们的结果显示男性和女性对TRA和TRB都具有相当的CDR3aa长度分布。TRA中的CDR3aa序列比TRB中的短，正如在外周血T细胞中先前描述的那样。尽管男性和女性之间在某些CDR3aa长度上存在细微差异，但这些变化最小，涉及代表TCR库总数不到2%的序列。总的来说，男性和女性之间的CDR3aa长度整体分布相似。

胸腺TCR库中男性和女性之间CDR3aa使用的最小差异

我们分析了与肽-MHC复合物接触的CDR3的FG环中的氨基酸(aa)使用情况。我们根据氨基酸的亲水性特性对氨基酸进行分类：亲水性、疏水性或中性。我们观察到男性和女性之间在TRA和TRB的某些aa使用方面存在显著差异。在DP细胞中，差异主要涉及疏水性aa：与男性相比，女性在TRA中表现出更高的丙氨酸(A)使用率，在TRB中则较低。此外，女性在TRB中显示出苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)的使用率增加。此外，在CD4 Teff和调节性T细胞群体中，具有不同亲水性特性的其他aa在男性和女性之间差异使用。

然后，我们更详细地分析了p109和p110位置的aa使用情况，因为TRB中这两个位置存在疏水性aa与自身抗原更强识别相关。我们没有观察到男性和女性之间在这两个位置疏水性aa使用的任何显著差异，无论是在TRB中的所有细胞亚型中。

胸腺TCR生成概率分布的轻微性别差异

评估TCR库生成和选择偏差的另一种方法是比较CDR3核苷酸序列的生成概率(Pgen)。Pgen表示根据V(D)J重组模型产生序列的可能性。仅针对DP和CD8细胞，以及每条TCR链，使用100,000个非功能性核苷酸序列创建了序列生成模型。基于此模型，计算了构成每个库的所有功能性TCR序列的Pgen。

当比较男性和女性之间Pgen的分布时，我们观察到分布差异非常小，其Kolmogorov-Smirnov分数几乎为零(DK-S<0.05)。这种差异在TRB中比在TRA链中更为明显。由于这种微小差异可能反映与个体间变异相关的差异，而与性别无关，我们在数据集中生成了20,000个置换混合性别组。我们发现混合组群体之间Pgen序列的分布差异与男性和女性之间观察到的分布差异相似。然而，观察到的男性和女性之间Pgen分布的差异高于DP TRB混合组之间的差异。

男性和女性胸腺TCR库的网络结构相似

接下来，我们评估了男性和女性的胸腺选择是否针对相似或不同的序列。对于每个TCR库，如果CDR3aa序列相差一个aa（即Levenshtein距离=1），则将它们连接起来。这种连接的序列很可能共享相同的特异性。对样本大小相似的样本进行随机下采样，以100次迭代进行比较。

为更精确地分析这些聚类，我们使用了各种指标。当比较男性和女性每个个体网络中聚类序列的数量时，对于任一链中的任何细胞类型均未观察到显著差异。同样，序列相似性的程度，通过个体TCR库内序列之间边缘密度反映，在男性和女性之间是相当的。这些发现表明，CDR3aa序列的相似性没有显著的性别特异性差异，表明男性和女性在其TCR库中产生具有相同变异程度的CDR3aa序列。

男性和女性胸腺TCR库中不存在性别特异性CDR3aa序列基序

我们随后寻求是否可以检测到在一个组中比另一组更存在的CDR3aa序列基序，以评估CDR3aa的选择是否在男性和女性之间偏向于不同的特定序列。为识别可能表明同组个体之间可能共同特异性的共享特征序列，分析仅集中在TRB上，因为该区域对TCR特异性的影响更大。

我们发现了男性和女性每个细胞亚群之间差异表达的数百个基序。与男性相比，女性特异性基序数量更多，从DP的426个基序到CD4调节性T细胞的278个基序不等，而男性则从CD4 Teffs的328个基序到CD4调节性T细胞的34个基序不等。鉴定的基序主要是局部基序，并且大多仅限于其各自的性别组，这意味着在女性中识别的基序几乎仅在女性中发现，反之亦然。

我们观察到不同细胞亚型之间基序重叠极小。只有两个女性相关基序重叠：一个在CD4 Teffs和CD4调节性T细胞之间，另一个在CD4 Teffs和CD8细胞之间。相比之下，男性相关基序之间没有发现重叠。此外，我们注意到一个与女性CD8细胞相关的基序与一个与男性CD4 Teff细胞相关的基序重叠。

我们随后评估了外部数据集中差异表达基序的使用情况。没有公开的胸腺TCR数据集按细胞亚群报告库。因此，我们在儿科整体胸腺细胞的TCR上测试了这些基序，其中包括2至8个月大儿童的TCR数据，男女比例为5:3。我们计算了该数据集中每个样本中这些差异表达基序的使用情况。我们无法使用这些基序使用情况按性别分离个体。

我们还使用来自健康个体的外周血TCR数据集进一步评估了这些基序，其中CD8、CD4 Teff和CD4调节性T细胞已被分选。在所有细胞亚群中，这些基序的使用情况无法区分男性和女性。

TCR在自身免疫疾病和细菌抗原中的性别偏向富集

我们寻找在IEDB、Mc-PAS和VDJdb公共数据库中表示的已知特异性的TCR使用情况。我们整合了这三个数据库中的TCR，仅保留具有高序列可靠性分数的TCR。我们仅关注TRB序列，因为它们在数据库中的代表性更高。我们确定了55,368个具有高可靠性和特异性分配分数的唯一TRB CDR3aa序列。

我们根据它们识别的抗原对TCR特异性进行分类：病毒或细菌肽，或在癌症、自身免疫疾病(AIDs)中过表达的人类肽，或与这些疾病无关的肽。我们在胸腺细胞数据集中寻找这些TRB CDR3aa序列。根据个体和细胞亚型，它们代表了约0.82%至3.58%的TRB库。

然后，我们比较了每个细胞亚型中男性和女性之间这些CDR3aa的分布。我们观察到在胸腺TCR数据集中，女性和男性都显著富集了与病理无关的自身抗原和与癌症相关的特异性TRB CDR3aa序列。这种富集在所有细胞亚型中都观察到，并且比特异性数据库中特异性的基线分布高约1.25至1.5倍。值得注意的是，在仅具有一种特异性的TCR库中，我们在CD8 SP细胞中观察到女性与男性相比，与AIDs相关的唯一TRB CDR3aa序列的比例显著更高。此外，在仅特定的TCR库中，女性CD8 SP细胞与男性相比，针对细菌化合物的胸腺序列比例有上升趋势，而在CD4调节性T细胞SP中观察到相反的趋势。在CD8 SP细胞中观察到的这些差异在检查这些序列的使用情况（即累积使用频率）时仍然存在，女性与男性相比，对细菌化合物和与AIDs相关的序列的使用频率显著更高。

供体年龄对CD8 SP和CD4调节性T细胞SP中自身和细菌特异性TRB CDR3序列的性别偏向富集没有显著影响(p≥0.52)，表明观察到的差异与年龄无关。我们还调查了多特异性TCR的存在，这些TCR能够识别来自不同生物体的多种抗原。与参考数据库中的表示相比，这些序列在所有细胞亚型中均富集。然而，在男性和女性之间，这些多特异性序列的比例或使用情况没有观察到显著差异。有趣的是，在CD8和CD4调节性T细胞SP之间观察到相反的使用趋势：与男性相比，女性在CD8 SP库中对这些序列的使用更高，但在CD4调节性T细胞SP库中使用较低。

总之，我们的TCR特异性分析揭示了女性与男性相比，针对自身免疫和细菌抗原的CD8效应T细胞的胸腺选择中存在显著的性别特异性差异。

讨论

鉴于女性自身免疫疾病患病率明显更高但原因不明，关于两性之间TCR库可能差异的研究如此之少令人惊讶。探索TCR库的生成和/或选择可能在两性之间不同的假设，需要研究TCR形成和选择的地方——胸腺。因此，我们生成了一个独特而有价值的数据集，包括从各种年龄的已故器官捐献者和接受心脏手术的幼儿收集的胸腺样本。最重要的是，我们分离了各种胸腺细胞群，以便能够在DP细胞水平研究TCR库生成，在CD8、CD4 Teff和调节性T细胞SP细胞水平研究库选择。我们对这些细胞进行了TCR的批量测序，这是目前唯一能生成足够序列进行敏感比较的方法。事实上，分析仅几千个细胞的单细胞测序将不允许进行可使用数十万个细胞执行的分析。

TCR生成

我们的分析首先揭示了TCR生成中的相似性而非差异性。在比较男性和女性DP细胞库时，我们分析的大多数变量没有显著的性别差异，除了两条TCR链的少数V和J基因使用方面的差异。然而，考虑到我们进行了数百次比较，这些少数差异可能是随机变异的结果。这得到了男性和女性之间TRBV-TRBJ和TRAV-TRAJ基因关联使用没有显著差异这一事实的支持。我们还观察到DP细胞库中多样性指数在男性和女性之间没有差异。总之，TCR库的整体组合多样性在两性之间是相当的。

对DP细胞中CDR3aa区域的详细分析显示，两条TCR链的FG环区域中某些疏水性aa的使用存在差异。然而，在TRB中影响自身抗原识别的关键p109和p110位置，男性和女性之间在疏水性、亲水性或中性aa的使用方面没有发现显著的基于性别的差异，这是由于疏水性aa对TCR自身反应性的影响。这些发现表明FG环中aa使用的细微性别差异很小，并且不会以性别依赖的方式显著影响CDR3区域的整体特性。DP细胞的Pgen分析显示男性和女性之间Pgen分布的差异极小，这与对照组中观察到的差异相似。这表明控制TCR生成的机制在两性之间基本保守，仅有轻微的可能随机的偏差。

此外，尽管我们在数据集中DP细胞阶段识别了男性和女性之间差异表达的TRB CDR3aa序列基序，但这些基序在外部队列中无法可靠地按性别区分个体。这表明它们更特定于数据集而非性别特异。这也可能由我们数据与其他数据集的不同特征解释。例如，在Arstila数据集中，分析是在年轻受试者的未分选细胞上进行的。较年轻的个体通常具有更多样化和更丰富的TCR库，外周库共享性更高，这可能掩盖性别特异性模式。这表明这些基序可能是环境特异性的，或受其他因素如年龄、遗传背景或环境暴露的影响。此外，我们未在DP细胞库中观察到TCR特异性使用的任何性别特异性差异。总之，我们对DP细胞的分析无法识别TCR生成中的任何相关性别差异。

TCR选择

我们确定了男性和女性之间使用差异的三个基因。虽然其中一些差异可能是随机的，源于多次比较，但TRBV6-5在女性中的优先使用先前已在周围TCR库中观察到。值得注意的是，与对照组相比，该基因在女性狼疮患者中过度表达。需要进一步研究来验证这一观察结果，然后阐明其意义。

我们最引人注目的观察涉及CD8 T细胞特异性的显著性别特异性差异，胸腺中选择过程偏向于在女性中有利于与自身免疫疾病和细菌抗原相关的序列。这种偏置不影响DP细胞的事实表明它与TCR选择有关，而不是生成。它的相关性得到了以下事实的强烈支持：(i)对于与自身免疫无关的其他自身抗原没有这种偏置，(ii)该偏置影响自身免疫的效应物和调节物，方向性与女性自身免疫疾病患病率增加一致。针对与自身免疫相关自身抗原的TCR在CD8效应T细胞中增加，而在CD4调节性T细胞中减少。值得注意的是，一些细菌抗原（而非病毒抗原）也受此偏置影响。这可能通过以下事实解释：细菌抗原表达大量自身抗原的模拟表位，并且已知有助于塑造TCR库。女性CD8 T细胞中对细菌抗原的偏置也可能为自身抗原的模拟物提供更多的效应细胞，通过分子模拟促进自身免疫疾病发展。在此方面，与乳糜泻(CeD)和1型糖尿病(T1D)相关的抗原在数据库中高度代表，这两种AIDs与可能模拟自身抗原的细菌成分有关。同样，众所周知，肠道微生物群影响T细胞的胸腺发育。性激素可能通过影响肠道微生物群组成和/或影响针对这些抗原的TCR选择来影响这种偏置选择。

最后，我们最近描述了可以对多种不相关病毒抗原作出反应的多特异性TCR，并假设它们可能参与自身免疫。我们观察到女性CD8 SP库中多特异性序列的使用趋势更高，尽管统计上不显著。这可能表明女性中CD8 T细胞的优先交叉激活，可能增强对病原体的保护，同时也增加炎症反应加剧和自身免疫的风险。

相反，女性CD4调节性T细胞SP细胞中多特异性TCR序列的使用频率较低。这可能会限制CD4调节性T细胞的抗原覆盖范围，并不利于防止自身免疫。然而，关于多特异性TCR知之甚少，这些观察结果值得进一步研究。

为进一步评估我们发现的稳健性，我们进行了额外分析，以评估供体年龄是否可能混淆观察到的性别特异性差异。我们研究的一个潜在限制是供体的相对广泛年龄范围。然而，库特征中缺乏年龄相关聚类（数据未显示），以及年龄对CD8和CD4调节性T细胞细菌特异性TRB使用和CD8和CD4调节性T细胞自身与自身免疫疾病特异性TRB使用模式无影响，反对年龄作为混杂因素。这些结果支持胸腺TCR选择中存在内在性别偏置，而非年龄相关效应。

虽然我们的发现为胸腺TCR库选择中的性别特异性差异提供了有价值的见解，但我们的TCR特异性分析有限。事实上，我们仅研究了TCR的TRB CDR3aa区域，这是定义TCR特异性的最关键部分，而TRA和TRB链都对TCR特异性有贡献。这一限制源于数据库中指定特异性的TRA数量有限，以及鉴于我们研究的性质，需要研究大型库，这目前通过单细胞TCR测序不可行。然而，随着推断特异性的方法不断发展，它们可能会在未来允许对我们数据集进行更精细的分析。此外，TCR数据库的持续发展应丰富这些分析。

总之，我们的TCR特异性分析揭示了女性中偏向于与自身免疫疾病相关序列的选择，可能潜在导致女性自身免疫疾病患病率更高。未来的研究应集中在更大数据集上验证这些观察结果。

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