摘要
抗菌素耐药性危机亟需新型治疗手段。硒纳米颗粒(SeNPs)展现出良好前景，但其精确的杀菌机制仍未完全阐明。本研究旨在阐明通过抗坏血酸和柠檬酸钠绿色方法合成的硒纳米颗粒的抗菌作用。所获得的硒纳米颗粒呈单分散状态(17.8±0.66 nm)，结晶度高且高度稳定(ζ电位：-69.9±4.3 mV)，对多重耐药大肠杆菌表现出强大的杀菌活性。为生成机制假说，我们将表型分析与初步单次重复蛋白质组学分析相结合。认识到这是探索性步骤，我们专注于分析变化最显著的蛋白质。结果显示，硒纳米颗粒对核心细胞过程实施了有针对性的双重攻击，形成连贯模式。数据表明，硒纳米颗粒同时诱导氧化应激，同时严重耗竭主要抗氧化谷胱甘肽系统的关键组分；关键解毒酶——谷胱甘肽S-转移酶和谷氧还蛋白2的表达量降低18-19倍，而应激蛋白HchA降低了63倍以上。同时，数据显示中心能量代谢受到严重破坏；三羧酸循环中的铁硫酶，包括乌头酸水合酶(降低8.1倍)和琥珀酸脱氢酶(降低13.9倍)受到严重抑制，氧化磷酸化过程受损(如NADH脱氢酶亚基B降低4.7倍)。我们提出，这种协同破坏形成了致命的反馈循环，导致代谢瘫痪。因此，本研究为硒纳米颗粒的作用提供了详细且可验证的机制假说，使其成为对抗耐药病原体的强效多靶点抗菌策略的候选方案。
关键词：硒纳米颗粒；多重耐药；抗菌活性；蛋白质组学分析；谷胱甘肽系统
1. 引言
抗菌素耐药性(AMR)是指感染性微生物（细菌、病毒、真菌和寄生虫）对抗菌剂的敏感性降低的状况。由此导致的药物耐药性使标准治疗方案失效，使感染越来越难以治疗。治疗失败增加了疾病广泛传播、严重疾病和患者死亡的可能性。
AMR的产生源于微生物的自然遗传适应。然而，其快速出现和传播的主要驱动因素是人类活动。在临床、兽医和农业环境中广泛且常常不适当使用抗菌剂所产生的选择压力是最重要的加速因素。在此背景下，无机纳米颗粒因其能够通过与传统抗生素不同的物理和生化机制靶向细菌，可能克服现有耐药途径，已成为有前途的替代品。其中，硒纳米颗粒(SeNPs)因其与无机硒和其他金属基纳米颗粒相比具有高生物相容性和低毒性，以及其已证明的广谱生物活性而受到广泛关注。
硒纳米颗粒(SeNPs)相比其他形式的硒具有显著优势，使其在生物医学应用中极具吸引力。与亚硒酸盐和硒酸盐等无机硒盐相比，SeNPs表现出明显更低的毒性特征，扩大了这种必需微量元素的安全治疗窗口。其纳米级尺寸有助于提高生物利用度和更高的生物活性，增强其吸收和功效。这些纳米颗粒以其生物相容性和多功能性著称，其表面可以轻松修饰或与各种生物分子（如蛋白质或多糖）结合，以提高稳定性、靶向性和特定治疗效果。硒纳米颗粒(SeNPs)表现出作为抗癌剂和抗氧化剂的显著双重功能，具体结果在很大程度上取决于生物环境和细胞氧化还原环境。这种双重行为是其治疗吸引力的核心。SeNPs一个特别有前景的应用是其对多种病原体（包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以及白色念珠菌等真菌）具有强效且多方面的抗菌活性。其功效高度依赖于理化特性，研究表明控制颗粒大小对于最大化抗菌效果至关重要；例如，直径约81 nm的SeNPs被发现对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制效果最佳。
然而，SeNPs的抗菌功效高度依赖于其理化特性，如尺寸、结晶度和表面化学性质，而这些特性又由合成方法决定。许多传统化学合成涉及苛刻的还原剂和稳定剂，引发了对残留毒性和环境影响的担忧。因此，开发使用无毒试剂生产定义明确的SeNPs的绿色或环境友好型合成方法是其安全生物医学应用的关键步骤。为此，本研究采用抗坏血酸（维生素C）作为还原剂和柠檬酸钠作为稳定剂的合成策略。抗坏血酸是一种生物相容性强且有效的还原剂，非常适合在不引入有毒副产物的情况下生成SeNPs。同样，柠檬酸及其盐作为有效的封端剂控制颗粒生长并防止聚集，确保胶体稳定性并增强生物相容性。
尽管关于SeNPs抗菌特性的文献越来越多，但要了解其对细菌细胞在分子水平上的精确作用机制，仍需更多知识。许多研究描述了表型结果，如生长抑制和膜损伤，但随后的细胞内事件和细菌细胞的全局代谢反应仍未得到充分表征。这种机制深度的缺乏阻碍了将SeNPs作为有效抗菌剂的合理设计和应用。
为解决这一差距，我们采用初步蛋白质组学分析来制定针对我们的抗坏血酸/柠檬酸合成的SeNPs对MDR细菌的细胞毒性效应的具体、可验证的机制假说。定量蛋白质组学提供了强大的、无偏见的工具，可绘制响应应激的整个蛋白质表达变化图谱，揭示被靶向的特定细胞通路和过程。本研究旨在使用涉及抗坏血酸和柠檬酸钠还原亚硒酸钠的简单绿色合成方法制备硒纳米颗粒(SeNPs)。主要目标是评估这些SeNPs对多重耐药细菌的抗菌功效，并采用初步探索性蛋白质组学方法识别连贯的分子模式。所得数据用于生成关于抗菌机制的可验证假说，为未来开发针对MDR病原体的SeNP-based疗法提供基础框架。
2. 材料与方法
2.1 微生物
测试病原体铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC12600)、大肠杆菌(ATCC13706)、肺炎克雷伯菌(ATCC43816)和大肠杆菌(ATCC25922)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国罗克维尔)。而多重耐药尿路感染病原体肠球菌N2023和大肠杆菌Mar002由埃及曼苏拉大学微生物学实验室提供。为准备每种微生物的过夜培养物，将一菌落悬浮于LB肉汤(Thermo Fisher，美国沃尔瑟姆)中，在37°C下以200 rpm振荡培养。
2.2 多重耐药尿路感染病原体的分子鉴定
使用通用细菌引物27F(AGRGTTYGATYMTGGCTCAG)和1492R(RGYTACCTTGTTACGACTT)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA，靶向16S rRNA基因。PCR使用TransStart Fastpfu DNA聚合酶系统(TransGen Biotech，北京)在50 μL反应体积中进行，包含10 μL 5× FastPfu缓冲液、2 μL 2.5 mM dNTPs、各1 μL正向和反向引物(5 μM)、0.5 μL FastPfu聚合酶，以及约10 ng模板DNA，剩余体积用ddH2O补足。扩增在ABI GeneAmp® 9700 PCR仪器上进行，细菌的热循环参数如下：95°C初始变性5分钟，随后27个循环(95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒)，最后72°C延伸10分钟，然后在10°C保持。所得PCR产物经纯化并使用3730XL DNA分析仪测序。将获得的序列与参考数据库使用NCBI BLAST算法进行比对，其中关键参数如最大得分、总得分、查询覆盖率和E值被解释以分配分类学身份，高分和覆盖率以及低E值表明可靠匹配。系统发育分析使用MEGA 12软件通过邻接法进行树构建。进化距离使用p距离法计算。应用完全删除选项以消除包含缺口和缺失数据的位置。系统发育树使用ITOL服务器进行可视化。
2.3 硒纳米颗粒(SeNPs)合成
使用抗坏血酸(AA)作为还原剂和1 mM柠檬酸钠(pH 7.5)作为稳定剂制备硒纳米颗粒(SeNPs)。将10 mL亚硒酸钠(Na2SeO3)(1 mM)加入反应混合物中，该混合物由100 mL pH调至7.5的1 mM柠檬酸钠组成。然后，将30 mL抗坏血酸(4 mM)逐滴加入反应混合物中，持续以70 rpm搅拌。颜色逐渐变为深红色。用铝箔覆盖烧瓶并搅拌3小时，然后在30°C和200 rpm下孵育24小时以完成Na2SeO3的还原。通过颜色变为红色视觉监测SeNP形成，并通过紫外-可见光谱确认。通过在12,000 rpm下离心20分钟收集纳米颗粒。沉淀用双蒸馏水洗涤两次以去除杂质。然后将纯化的硒纳米颗粒冻干并储存在密闭、避光的容器中，以防止氧化和降解，直到进一步表征。
2.4 纳硒颗粒的表征
- 透射电子显微镜
将SeNPs悬浮液一滴置于碳涂层铜网上(CCG)，并通过让水在室温下蒸发使其干燥。使用JEOL JEM-1010透射电子显微镜(日本东京)在80 kV下获取电子显微照片，该设备位于Al-Azhar大学区域真菌学和生物技术中心。
- ζ电位估计
制备1 mg/mL的SeNPs储备浓度。随后将该储备溶液稀释100倍以准备分析。为确保分散并破坏任何聚集体，将稀释样品超声处理5分钟。然后使用Zetasizer Nano ZN仪器(Malvern Panalytical Ltd.，英国马尔文)通过动态光散射(DLS)定量评估ζ电位。所有测量均在固定散射角173°和保持在25°C的温度下进行，每个样品分析三次以确保统计可靠性。
- X射线衍射(XRD)分析
使用Bruker D2 Phaser 2nd Gen衍射仪(美国马萨诸塞州比勒里卡)对硒纳米颗粒的晶体结构和相进行识别，该设备配备铜X射线管阳极(工作在30 kV和10 mA)和单色器。使用Cu Kα辐射(波长：α1 = 1.54060 Å，α2 = 1.54439 Å)。将粉末样品加载到标准样品架上并以15 rpm旋转。数据在Bragg-Brentano几何结构下收集，2θ范围为10°至70°，步长为0.04°，每步停留时间为132秒。发散缝和接收缝分别设置为1.00和2.5 mm。分析在23.5°C的环境温度下进行。
2.5 纳硒颗粒的抗菌活性
使用纸片扩散法根据CLSI指南评估合成的硒纳米颗粒(SeNPs)对一组人类病原体的抗菌功效。通过在Mueller-Hinton琼脂平板上涂抹测试生物体(5×10^5 cfu/mL)制备细菌草坪。将SeNPs悬浮液(15 μg)的等分试样(10 μL)应用于无菌5 mm滤纸片。干燥后，将纸片无菌转移到接种琼脂表面。对于阴性对照，纸片浸有10 μL pH 7.5的0.1 mM柠檬酸钠溶液。随后将所有平板在37°C下孵育24小时。孵育后，测量抑制区的直径。每种条件进行三次测定，数据表示为具有相应标准偏差的平均值。使用卡那霉素作为阳性对照。
2.6 SeNPs对不同病原微生物的MIC和MBC测定
使用Mueller-Hinton肉汤通过微量肉汤稀释法测定硒纳米颗粒悬浮液的最小抑菌浓度(MIC)。简而言之，将Mueller-Hinton琼脂上生长的过夜培养物调整至约5×10^5菌落形成单位(CFU)每毫升Mueller-Hinton肉汤。在96孔微量滴定板中，将50 μL该细菌溶液与50 μL双倍浓度的SeNPs胶体(600 μg/mL至0.586 μg/mL)混合。将平板在37°C下孵育20±2小时。将无浊度的最低SeNPs浓度视为MIC值。通过将0.01 mL等分试样从宏观上澄清的孔中亚培养到无菌营养琼脂中24小时，在37°C下测定MBC。MBC被定义为在MHA上未观察到细菌菌落的最低SeNPs浓度。计算MBC/MIC比值以确定SeNPs对细菌病原体的杀菌或抑菌特性。使用卡那霉素作为阳性对照。
2.7 使用透射电子显微镜制备和检查细菌
使用大肠杆菌Mar002菌株作为模型病原体来评估SeNPs的细胞毒性效应。用10 μg/mL SeNPs处理的细菌样品用于透射电子显微镜(TEM)成像，并将其形态变化与未处理的对照细胞进行比较。为准备样品，将24小时营养肉汤中培养的细菌细胞在4000 rpm下离心10分钟收集，随后用蒸馏水洗涤。然后将细胞在3%戊二醛中固定，在磷酸盐缓冲液中冲洗，并在室温下在高锰酸钾溶液中后固定5分钟。使用乙醇系列(10%至90%)在每个浓度下处理15分钟进行脱水，随后用无水乙醇处理30分钟。然后通过丙酮和树脂溶液的梯度系列渗透样品。将超薄切片收集到铜网上，并用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染色。在区域真菌学和生物技术中心(RCMB)，Al-Azhar大学的透射电子显微镜(JEOL JEM-1010，日本东京)在80 kV下检查切片。
2.8 蛋白质组学分析
使用大肠杆菌Mar002样品，对照或用10 μg/mL SeNPs处理，进行蛋白质组学分析以了解SeNPs对蛋白表达的细胞毒性。通过向细菌沉淀样品中加入200 μL 8 M尿素缓冲液(500 mM Tris，pH 8.5)进行蛋白质提取，随后使用超声匀浆器进行匀浆。然后将匀浆剧烈振荡并在4°C下以10,000 RPM离心30分钟。使用deNovix DS-11 FX系列仪器上的Bradford分析定量所得蛋白质上清液。
对于消化，将每个样品中的30 μg总蛋白质用2 μL 200 mM二硫苏糖醇(DTT)在室温下还原45分钟，随后用2 μL 1 M碘乙酰胺(IAA)在黑暗中烷基化45分钟。用102 μL 100 mM Tris(pH 8.5)调整体积，然后通过加入6 μL胰蛋白酶(1 μg猪酶)并以900 rpm在37°C下过夜孵育来启动胰蛋白酶消化。通过用6 μL 100%甲酸将样品酸化至pH 2-3来停止消化。
使用MonoSpin反相柱(Stage Tip)纯化和脱盐肽。用50 μL甲醇活化柱，用50 μL溶液B(0.2%甲酸，80%乙腈)初始化，并用50 μL溶液A(0.2%甲酸)重新平衡两次。将酸化消化物加载到柱上，用50 μL溶液A洗涤两次，并用三个50 μL溶液B等分试样洗脱肽。使用速干仪浓缩洗脱液，并在20 μL溶液A中重新悬浮。使用deNovix DS-11 FX仪器上的二喹啉甲酸(BCA)分析测定肽浓度。
对于液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析，将1 μg肽(在10 μL中)注入Eksigent nanoLC 400系统，该系统与Sciex TripleTOF™ 5600+质谱仪(美国马萨诸塞州弗雷明汉)联用。肽在CHROMXP C18-CL柱(5 μm，10×0.5 mm)上捕获，并在ChromXP C18-CL柱(3 μm，120 Å，150×0.3 mm)上分离，使用57分钟梯度从3%到80%流动相B(0.1%甲酸在乙腈中)，流速为5 μL/min。数据在正离子模式下采集，TOF质量范围为400-1250 m/z。依赖信息的采集(IDA)由高分辨率TOF-MS扫描后跟前40个离子(170-1500 m/z)的产物离子扫描组成，循环时间为1.5秒。
使用Protein Pilot软件(版本5.0.1.0)和Paragon算法处理原始数据文件。数据库搜索针对UniProt大肠杆菌数据库(4612个条目)进行，参数如下：碘乙酰胺烷基化半胱氨酸，胰蛋白酶消化，彻底搜索努力，生物修饰ID焦点，以及启用假发现率(FDR)分析并进行偏差校正。通过倍数变化计算，将每个样品的蛋白质组内容与其他样品进行比较，以确定差异蛋白表达。显著上调蛋白(处理样品中变化不少于2倍)以及处理特有蛋白用于使用clusterProfiler R包(v. 4.1.2)进行基因富集分析，以从KEGG数据库检测潜在上调通路和基因本体术语。类似地，显著下调蛋白(对照样品中变化不少于2倍)加上特有对照样品蛋白以相同方式富集，以定义潜在下调通路和基因本体术语。
3. 结果与讨论
3.1 多重耐药人类病原体的分子鉴定
进行了系统发育分析以确认两个多重耐药分离株的分类学身份。进化历史使用邻接法推断，并使用基于1000次重复的自举分析评估树拓扑的稳健性。
为第一个分离株(图1a)构建的树清楚地将其与大肠杆菌的参考序列聚类。分离株大肠杆菌Mar002与其它大肠杆菌菌株形成一个明确、支持良好的分支，明确确认其物种水平鉴定。分析基于44个核苷酸序列和517个位置的比对，在应用完全删除选项后。
同样，第二个分离株(图1b)的系统发育树将其置于肠球菌属内。分离株肠球菌N2023与粪肠球菌序列稳健地聚类，显示出与该物种的密切进化关系和高序列相似性。这项分析，涵盖33个核苷酸序列和1167个位置，为其分类为肠球菌属分离株提供了强有力的分子证据。
3.2 抗坏血酸和柠檬酸离子产生的硒纳米颗粒的表征
使用抗坏血酸(AA)和柠檬酸钠研究了硒纳米颗粒(SeNPs)的合成。通过明显的红色和AA作为还原剂介导的反应中~260 nm处的特征表面等离子体共振(SPR)峰，初步确认了亚硒酸盐(SeO32−)向元素硒(Se0)的成功还原(图2a)。
SeNP配方使用TEM、DLS和XRD进行了初步表征(图2b-e)。X射线衍射(XRD)分析确认合成了高结晶度的硒纳米颗粒(SeNPs)，不含任何可检测杂质(图2b)。衍射图案在2θ值为23.45°、29.65°、41.27°、43.58°和45.28°处显示出尖锐而强烈的峰，对应于纯三角(六方)硒的(100)、(101)、(110)、(102)和(111)晶面。使用Debye-Scherrer方程从峰宽计算的平均晶粒尺寸约为10.97 nm，表明颗粒的纳米晶性质。高结晶度和相纯度的这种模式与先前研究表明抗坏血酸是结晶SeNPs的有效还原剂，柠檬酸根离子可以作为有效的封端剂促进均匀分布并防止聚集一致。
SeNP配方的ζ电位值为-69.9±4.3 mV(图2c)，表明稳定的胶体系统，因为超过±30 mV的值通常表示静电稳定。透射电子显微镜(TEM)分析显示SeNP形成了最小的初级颗粒(17.8±0.66 nm)，在TEM网格上分散良好(图2d,e)。文献报告一致表明，硒纳米颗粒(SeNPs)的尺寸高度依赖于合成参数。
3.3 针对病原细菌的制备纳硒颗粒的抗菌活性、MIC、MBC和杀菌活性
研究了使用抗坏血酸和柠檬酸离子合成的硒纳米颗粒(SeNPs)对菌株特异性抗菌活性。结果(图3和表1)显示测试细菌病原体之间的易感性存在显著差异。
SeNPs对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌表现出最强的效力，分别产生22.33±0.58 mm和22.00±1.00 mm的最大抑制区。相比之下，标准菌株中最低的抗菌活性针对大肠杆菌(25922)和铜绿假单胞菌观察到，抑制区分别为18.33±1.53 mm和18.67±0.58 mm。多重耐药(MDR)细菌表现出明显突出的耐药性。肠球菌属显示出7.3±0.58 mm的明显小抑制区，而MDR大肠杆菌Mar表现出中等易感性，抑制区为17.7±1.15 mm。
通过最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定进一步量化了抗菌效力，证实了菌株依赖性活性(表1)。SeNPs对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(13706)和肺炎克雷伯菌最为有效，MIC均为4.686 μg/mL。这些菌株的MBC值分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(13706)的18.744 μg/mL和肺炎克雷伯菌的9.372 μg/mL，导致MBC/MIC比值为2至4，表明杀菌效果。相比之下，大肠杆菌(25922)和MDR大肠杆菌Mar需要更高的MIC 9.374 μg/mL，相应的MBC为37.496 μg/mL(MBC/MIC比值=4)。铜绿假单胞菌(27853)表现出更低的易感性，MIC为18.75 μg/mL，MBC为37.496 μg/mL。最重要的是，MDR肠球菌属高度耐药，需要显著更高的MIC 75 μg/mL和MBC 300 μg/mL才能分别实现抑制和杀灭。
就阳性对照卡那霉素而言，除大肠杆菌(13706)敏感外，所有病原体均表现出中等易感性，而尿路感染分离病原体大肠杆菌(25922)和铜绿假单胞菌耐药，符合CLSI指南。
本研究中证明的硒纳米颗粒(SeNPs)对多种细菌病原体的显著杀菌功效突显了其作为有前途的抗菌剂的潜力。这与越来越多的文献一致，表明SeNPs的抗菌特性高度取决于纳米颗粒浓度、特定微生物物种和合成方法。例如，Cremonini等人报道，由Stenotrophomonas maltophilia和Bacillus mycoides合成的SeNPs在8至512 mg/mL浓度范围内抑制铜绿假单胞菌。类似地，El-Deeb等人发现由Providencia vermicola合成的SeNPs对某些革兰氏阴性病原体无效，但对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌表现出强抗菌活性。此外，Greeshma和Mahesh以及Alam等人的研究证实，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等病原体的活性是浓度依赖性的，在宽范围(从1至10 μg/mL至400 μg/mL)内观察到功效。
然而，这种活性并非普遍；Cremonini等人和El-Deeb等人的研究报告了物种特异性效应，其中SeNPs抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，但对某些念珠菌物种和其他革兰氏阴性细菌无效。这种可变易感性的关键决定因素是纳米颗粒的表面化学性质。正如Escobar-Ramírez等人所指出的，SeNPs的尺寸、电荷和表面涂层至关重要。尽管我们的SeNPs由于柠檬酸壳而具有高负ζ电位，但其表现出的强效抗菌活性突显了表面电荷与生物活性之间复杂的相互作用。虽然Galić等人和Rangrazi等人的传统观点支持带正电的纳米颗粒与带负电的细菌膜的相互作用增强，但我们的实验数据揭示了我们特定SeNP配方的显著优势。与Galić等人和Rangrazi等人的观点相反，阴性表面电荷的纳米颗粒可以表现出强效抗菌活性且毒性降低，这对药物应用至关重要。在他们的研究中，Salvioni等人证明，带负电的SeNPs(BSA包被和未定义包被)可以严重损害革兰氏阴性(Stenotrophomonas bentonitica)和革兰氏阳性(Lysinibacillus sphaericus)模型中细菌细胞的生长和活力。值得注意的是，未定义包被的SeNPs显示出最高比例的死细胞(85-91%)并导致近80%的DNA降解，这些效应与活性氧(ROS)产生的显著增加有关。总体而言，这些证据将我们的柠檬酸包被SeNPs定位为一类有效抗菌剂，其强效、广谱作用由其阴离子表面化学性质独特实现，为潜在应用提供了重要的安全优势。
3.4 透射电子显微镜评估SeNPs的抗菌活性
透射电子显微分析揭示了硒纳米颗粒(SeNPs)对MDR大肠杆菌细胞的细胞毒性效应(图4)。未处理的对照细胞(图4a-c)显示出完整的杆状形态，具有明确定义的膜和未受干扰的内部结构。相比之下，SeNP暴露导致进行性和严重的细胞降解(图4d-h)。SeNPs在细菌细胞包膜上的积累(图4d-f)，尽管它们具有相互的负表面电荷，表明更强的短程力可能介导初始附着。这种观察到的粘附可以通过胶体相互作用理论(DLVO理论)的框架来解释，其中范德华相互作用和疏水效应等吸引力可能在近距离占主导地位，可能促进附着，尽管总体上存在静电排斥。这种表面关联通过改变通透性、破坏正常运输过程和损害膜结合酶活性来损害膜完整性。
此外，SeNPs的小尺寸使其能够穿过细菌细胞包膜。在具有薄肽聚糖层和外膜的大肠杆菌中，假设SeNPs通过脂质双层的被动扩散或通过孔穿透来渗透。一旦内化，SeNPs就会引发实质性的细胞内破坏，直接导致细胞活力丧失。
在图4g,h中可以看出损伤的高级阶段，显示出细胞壁和膜的破裂。这种细菌包膜的破裂促进了SeNPs大量渗入细胞质，其中它们形成密集的聚集体。这种物理破坏与文献发现一致，即纳米颗粒可诱导孔形成和膜裂解，导致细胞质内容物泄漏和基本细胞功能的灾难性故障。
造成这种观察到的损伤的主要机制可能是氧化应激。细胞内SeNPs可产生活性氧(ROS)，导致脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤，最终触发细胞死亡。这种氧化攻击是初始膜损伤和随后细胞质解体的合理解释。
另一个促成机制涉及有毒离子的释放。在水环境中，SeNPs可能溶解，释放水合硒离子。这些离子可以通过使关键细胞内酶失活、干扰细菌信号转导途径（特别是通过破坏磷酸化）以及通过与DNA磷残留物结合阻碍核酸代谢来发挥抗菌作用，从而阻碍复制和转录。
3.5 蛋白质组学分析
蛋白质组学分析数据提供了SeNPs如何重塑细胞蛋白表达的全面视图。处理诱导了显著变化，共有268种蛋白质发生显著变化。值得注意的是，下调蛋白质的数量(172)几乎是上调蛋白质数量(96)的两倍，暗示某些细胞过程或通路可能存在广泛抑制(图5)。蛋白质组学分析确定了仅存在于一种条件中而在另一种条件中完全缺失的蛋白质。具体而言，在对照细胞中唯一检测到247种蛋白质，而在SeNPs处理的细胞中唯一表达94种蛋白质。
这种条件特异性表达表明细胞蛋白质组发生了根本性重编程，其中SeNPs处理不仅调节现有蛋白质的水平，还导致一组通路的抑制和另一组通路的从头激活。
3.6 蛋白质组学分析的GO分析
分子功能的GO富集分析表明，硒纳米颗粒(SeNP)暴露导致大肠杆菌中基本分子功能的深刻和系统性失调，最终导致灾难性细胞功能障碍(图6)。观察到的概况描绘了毒性的一个明确机制途径，其特征是针对核心代谢和生物合成过程的广泛纳米硒诱导损伤的同时，出现无效的补偿性应激反应。
数据显示，编码核糖体结构组分以及参与rRNA、mRNA和tRNA结合和调节的因子的基因显著上调。这被解释为不是增殖健康的标志，而是作为对广泛纳米硒诱导损伤的综合细胞应激反应，可能由警报素(p)ppGpp介导。该模型得到了Pseudomonas aeruginosa研究的支持，其中在纳米颗粒应激下转录和翻译机制的类似上调代表了维持稳态的绝望尝试。同时上调的肽基-脯氨酰顺反异构酶活性可能表明蛋白质折叠危机。本质上，细胞通过超活化其蛋白质合成装置来做出英勇努力，以替换受损的蛋白质组。
然而，核心代谢途径的同时和灾难性下调使这种补偿努力变得徒劳。氧化还原酶活性（特别是那些作用于醛/氧代和CH-OH基团并具有NAD(P)+辅因子的酶，包括醛脱氢酶）的协调下调揭示了对细胞活力的多方面攻击。这种抑制使糖酵解等中心能量产生途径瘫痪，导致严重ATP耗竭。此外，它损害了活性醛的解毒，更重要的是，破坏了NADPH的再生。后一效应使细菌抗氧化系统陷入灾难，因为NADPH对于补充还原型谷胱甘肽至关重要，使细胞无法抵御SeNP诱导的氧化应激。
有毒损伤进一步延伸至削弱生物合成能力和离子稳态。钾离子结合蛋白的下调表明膜电位和细胞膨胀的破坏，这对细胞的生物能状态至关重要。同时，维生素B6和吡哆醛磷酸结合蛋白的抑制对氨基酸代谢和一碳单位造成了重大打击，阻止了重要生物分子的产生。最重要的是，氨酰-tRNA连接酶和氨肽酶活性的集体下调代表了对蛋白质生命周期的有针对性关闭。这种破坏阻止了tRNA的充电，阻止了翻译起始，同时也损害了蛋白质成熟和氨基酸的回收。
同样，细胞组分的基因本体(GO)富集分析揭示了大肠杆菌对硒纳米颗粒(SeNP)暴露的转录反应的鲜明对比(图7)。与蛋白质合成机制相关的术语（包括核糖体、核糖体亚基和核糖核蛋白复合物）观察到显著上调。这种翻译装置的工具化是细菌应激反应的公认标志，因为细胞重新分配资源以产生防御性伴侣蛋白、解毒酶和修复蛋白的武器库以减轻损伤。相反，细胞包膜组分（特别是周质空间和外膜限定的周质空间）检测到显著下调。这种转录特征与我们的透射电子显微镜(TEM)分析直接相关(图4)，该分析在视觉上确认了SeNPs在周质空间内的积累及其随后在细胞内的聚集，同时伴有严重的内部破坏和膜破裂。包膜生物发生基因的下调，因此，可能是失败的补偿反应的直接结果；SeNPs造成的物理损伤——通过膜破裂所见证——压倒了细胞维持和修复其外部结构的能力，导致这些组分的转录程序崩溃。
基因本体富集分析揭示了大肠杆菌在硒纳米颗粒(SeNPs)处理后连贯而明显的生物反应(表2，补充图S1)。转录谱以核心代谢途径的普遍下调为主导，表明细胞能量和生物合成能力的严重破坏。这包括能量代谢和细胞呼吸(184个基因)、羧酸和有机酸代谢(120个基因)、核苷酸和辅因子代谢过程(49个基因)以及氨基酸代谢过程(78个基因用于生物合成)的集体抑制，描绘了全球代谢关闭的清晰画面。这种模式与金属和类金属纳米颗粒（如银纳米颗粒(AgNPs)）的既定机制一致，已知它们会诱导氧化应激，破坏质子动力，崩溃ATP合成，导致能量依赖过程的下调。翻译和蛋白质合成机制(33个基因)以及细胞组装和生物发生(72个基因)的平行下调进一步证实了生长和增殖的停止，代表了在压力下保存资源的经典严谨反应。
相反，最突出的上调反应表明为应对诱导的损伤进行了协调一致的补偿努力。对蛋白质合成装置的巨大投资体现在翻译和蛋白质合成机制(70个基因)、核糖体生物发生(45个基因)以及细胞组装和生物发生(115个基因)的强烈上调上，可能用于替换被SeNP诱导氧化应激损坏的蛋白质。这伴随着向替代能源的代谢重布线，见于甘油和多元醇代谢(7个基因)和特定氨基酸分解代谢过程(12个基因)的上调，细菌使用此策略绕过受损的中心途径如TCA循环。细胞应激反应(27个基因，特别是对热/温度)和转录后调控(18个基因)的显著上调指向细胞包膜损伤和需要微调昂贵的翻译过程，与各种纳米颗粒引起的物理膜损伤一致。此外，核苷酸代谢(18个基因)的上调为支持观察到的核糖体生产激增所需的RNA构建块提供了保障。
3.7 蛋白质组学分析的KEGG分析
为进一步阐明硒纳米颗粒(SeNP)应激对大肠杆菌的代谢影响，我们对下调的蛋白质组进行了KEGG通路富集分析。表3中的结果提供了受严重影响的具体代谢通路的详细视图，有力支持了GO术语分析，并确认了代谢停滞状态。
最显著的发现是中心碳代谢的全面抑制。42种参与广义碳代谢的蛋白质显著下调(调整p值=2.50×10^-9)。这反映在所有主要糖酵解和能量产生途径的具体抑制上：糖酵解/糖异生(21种蛋白质)、柠檬酸循环(TCA循环)(16种蛋白质)和丙酮酸代谢(22种蛋白质)。磷酸戊糖途径和氧化磷酸化(13种蛋白质)的同时下调表明能量(ATP)和还原力(NADPH)产生的崩溃。这种协调关闭表明SeNPs直接或间接靶向细菌细胞的核心引擎，削弱其产生生长和增殖所需基本前体和能量的能力。
代谢瘫痪不仅限于能量产生，还延伸至依赖它的生物合成过程。氨基酸生物合成(26种蛋白质)和辅因子生物合成(23种蛋白质)通路在下调蛋白质中显著富集。这包括精氨酸和脯氨酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等特定通路，对维持细胞氧化还原平衡至关重要。尽管在调整后没有统计学意义，但氨酰-tRNA生物合成的下调与GO分析显示翻译机制抑制一致。这种生物合成通路的集体损伤表明，细胞不仅无法产生能量，还被阻止合成蛋白质、核酸和酶辅因子所需的基本构建块，导致全面停滞。
SeNP应激的影响不仅限于中心代谢，还渗透到更广泛的细胞功能。次级代谢物生物合成(82种蛋白质)和多样化环境中的微生物代谢(69种蛋白质)通路的显著下调突显了适应和维持复杂代谢网络能力的全球性失败。此外，谷胱甘肽代谢(10种蛋白质，表4)的下调尤其引人注目。谷胱甘肽是一种关键抗氧化剂，其代谢受损表明细胞对抗氧化应激的主要防御能力受损，可能加剧SeNP诱导的活性氧(ROS)造成的损伤。有趣的是，膜运输(ABC转运蛋白)和信号转导(双组分系统)通路未显著富集，表明主要毒性模式不是营养摄取的简单破坏，而是对细胞内代谢完整性的直接攻击。
最后，定量蛋白质组学分析提供了决定性证据，表明硒纳米颗粒(SeNP)暴露通过特异性靶向谷胱甘肽系统(表4)和关键代谢和氧化还原通路(表5)触发大肠杆菌中氧化应激反应的灾难性失败。硒纳米颗粒(SeNP)暴露通过同时瓦解细胞抗氧化防御系统和核心代谢途径，引发大肠杆菌中的协同和灾难性失败，形成致命的反馈循环。主要防御屏障，谷胱甘肽系统，成为特定靶点，其关键组分——谷胱甘肽S-转移酶(GstA/GstB)和谷氧还蛋白2(GrxB)——耗竭了18至19倍，应激相关蛋白HchA显著降低了63倍以上。这有效地解除了细胞中和过氧化物和修复氧化损伤的能力。同时，中心代谢途径遭受严重破坏；柠檬酸循环中铁硫簇依赖酶，如乌头酸水合酶(AcnB)和琥珀酸脱氢酶(SdhA)下调了8.1至13.9倍，而氧化磷酸化途径受损，NADH脱氢酶亚基B(NuoB)降低了4.7倍。电子传递链的故障可能加剧活性氧(ROS)的产生。因此，细胞陷入恶性循环：受损的代谢产生更多ROS，而受损的谷胱甘肽系统无法进行有效的防御。这种不断升级的氧化应激和不可逆代谢损伤的自我放大循环最终导致完全细胞崩溃和死亡。需要注意的是，从这种蛋白质组筛选得出的SeNPs对MDR大肠杆菌的假设抗菌机制需要通过重点后续实验（包括遗传和生化方法）进行直接验证。
4. 结论
本研究建立了一种用于高稳定性和结晶硒纳米颗粒(SeNPs)的稳健绿色合成方案，对多重耐药病原体具有强效、广谱抗菌活性。在此基础上，我们提出了一个详细且可验证的机制假说来解释其功效。我们认为SeNP活性不是单一事件，而是由非静电附着和膜损伤引发的级联反应，导致灾难性的细胞内循环。我们的综合分析，结合表型测定和初步蛋白质组学分析，表明这种循环由协同双重攻击驱动：SeNPs似乎同时诱导压倒性氧化应激，同时战略性地瓦解细胞主要基于谷胱甘肽的抗氧化防御并削弱中心能量代谢。由此产生的致命反馈循环——受损呼吸加剧ROS产生而受损修复系统无法缓解损伤——为观察到的快速代谢瘫痪和细胞死亡提供了连贯模型。我们将此作为我们数据产生的中心假说提出。虽然SeNPs的显著效力已得到明确证实，但我们注意到，源自初始单次重复分析的特定蛋白质组模型需要通过复制组学和遗传实验进行未来验证。尽管如此，这项工作通过提供解释SeNPs抗菌作用的明确分子框架，超越了简单的功效报告，将其定位为对抗日益严重的抗菌素耐药性危机的复杂多靶点治疗策略。
局限性
蛋白质组学研究设计为初始发现筛选，缺乏生物学重复。因此，虽然核心通路的显著改变为SeNPs机制提供了引人注目的、产生假说的证据，但个体蛋白质的发现（尤其是倍数变化较低的）需要通过靶向后续实验（如遗传或生化测定）进行验证。此外，纳米颗粒在其纯化状态下进行了表征，但未直接评估其在生物测定介质中的稳定性。在抗菌、形态学和蛋白质组学测定中观察到的可重复剂量-反应表明NPs保持活性，但未来研究应考虑纳入原位稳定性测量，以完全定义操作中的纳米形式。
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