药物发现与临床前开发

引言

过去十年间，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准约260种新型治疗药物，包括220种新分子实体（小分子药物）和42种生物治疗药物（通常为重组蛋白产品）。此类疗法使诸多原本无法治疗的疾病获得有效干预手段，部分药物因疗效更显著或毒性更低而拓展了治疗选择。例如在抗感染领域，制药企业、生物技术公司及大学实验室持续开发新型药物，以应对耐药性疾病的挑战。随着下一代测序技术和新型蛋白质工程策略等创新技术的出现，未来数十年预计将有更多重要药物类别被发现和开发。

新药研发过程充满挑战且成本高昂。仅有极少数进入开发阶段的分子最终能获批上市：在初始筛选中表现良好的10,000种化合物中，不足10种能进入临床试验，仅2种最终获批。新药研发成本估计略超12亿美元，部分研究甚至指出成本高达50亿美元。尽管风险巨大，成功药物往往能为承担风险者带来丰厚回报，如阿立哌唑（Abilify®）等商业明星产品的年销售额均超60亿美元。

近年来，生物医学研究界在创新疗法产出方面的困境引发高度关注。2004年FDA关键路径计划报告（详见"推荐阅读"）重点指出了药物研发面临的挑战及潜在解决方案。该报告指出，自1993年起的十年间，美国国立卫生研究院（NIH）预算与制药企业研发投入均翻倍增长，但新药研发速率未见提升，FDA收到的重大药物和生物制品申报数量反而下降。尽管已提出多种解决方案，需特别强调的是，FDA与美国医学院协会的联合报告突显了医师科学家在提升药物研发效率中的关键作用。

本章将阐述药物发现与开发各阶段流程及涉及的科学学科。药物发现涵盖从潜在治疗靶点识别到选定人体试验分子的全过程；药物开发则通常定义为从支持首次临床试验的临床前研究到监管机构批准药物的阶段。此过程高度复杂，需整合众多学科专业知识（图51-1）。

药物发现项目常始于已明确表征的生化或分子靶点——该靶点被证实与特定疾病相关。研发工作随之聚焦于设计调控目标通路的化学化合物（小分子）或工程化大分子（通常为蛋白质）。下文案例展示了替代路径：通过大规模基因组学与生物信息学计划发现新型蛋白（骨保护素），进而揭示骨代谢重要新通路，最终推动新型蛋白治疗药物的开发与商业化，该药物现用于治疗骨质疏松症及癌症骨转移相关骨破坏。

1990年代初，安进公司研究人员启动大规模基因组计划，旨在识别新基因与蛋白质以发现生物新通路及潜在治疗靶点。研究人员为特定目标基因生成全长序列并在小鼠肝脏过表达，随后利用转基因小鼠进行表型筛选，检测其与野生型对照组在生化、血液学、放射影像及组织学方面的差异。优先筛选编码分泌蛋白的基因及已知疾病通路关键蛋白家族的新成员。通过此流程，研究者发现骨保护素（OPG）——一种与肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员具有序列同源性的新蛋白。OPG过表达小鼠呈现显著骨表型：骨量大幅增加并填满髓腔，此现象归因于破骨细胞数量显著减少。1995年，安进公司专利文件确认OPG是骨代谢的重要调控因子。基于此发现，安进及其他实验室研究者阐明了破骨细胞生物学中的新关键通路，包括发现核因子κB受体激活因子（RANK）及其配体（RANKL）。

将生物认知转化为有效治疗的初始策略聚焦于OPG，包括开发OPG与人免疫球蛋白G1（IgG1）Fc区的融合蛋白。动物模型显示，该融合蛋白活性比全长OPG高200倍；经动物安全性测试后，于1998年进入临床试验。I期研究证实剂量依赖性骨转换标志物降低，证明调控RANKL通路可对人体骨骼产生有益影响。后续优化工作开发出具有更高靶点亲和力和更长半衰期的类似分子（源自哺乳动物细胞系）。该分子（AMGN-0007）进入临床开发，但因临床试验受试者产生针对OPG的免疫应答而终止开发。鉴于OPG构建体可能诱发免疫应答并中和内源性OPG的担忧，OPG基药物研发工作被搁置。

安进公司并未局限于OPG基疗法研发，而是利用单克隆抗体生成技术的重大进展，启动了靶向RANKL的全人源单克隆抗体开发。这些努力最终鉴定出AMG 162（后命名为地诺单抗）。由于地诺单抗在啮齿类动物中无活性，非人灵长类动物研究对证明其骨骼益处至关重要。非人灵长类研究还用于表征地诺单抗的毒性谱，此后该药物于2001年进入骨质疏松症适应症临床试验。I期临床计划中，地诺单抗展现出持久的骨转换标志物降低效果。II期研究证实骨矿物质密度增加与骨转换标志物降低，并确定了III期计划的研究剂量。III期研究证实骨折风险显著降低，最终于2010年获FDA批准用于治疗骨质疏松症（商品名：普罗力/Prolia®）。

研究者假设RANKL不仅是骨质疏松症，也是转移性骨病中破骨细胞活性的重要介质。多种骨骼转移啮齿类模型显示基质RANKL升高，部分肿瘤类型中也观察到RANKL表达。安进及其他机构的非临床研究表明，抑制RANKL可减少破骨细胞数量与活性，限制溶骨性骨病变发展并降低骨骼肿瘤负荷。基于这些积极的临床前研究结果，临床开发计划随即启动，并同样于2010年获得FDA批准，将地诺单抗（商品名：安加维/Xgeva®）用于预防实体瘤患者骨骼相关事件。

问题

本案例描述了一种方法：首先识别新型蛋白质，随后确定其在特定通路中的生物学意义，最终开发调控该通路的治疗药物。与始于已验证生物靶点的研发项目相比，此方法有何优劣？您认为哪种方法更可能产出获批治疗药物？
阐明OPG–RANK–RANKL通路后，研发了哪些类型的蛋白构建体来调控该通路？这些不同构建体各有何优劣？
在以基因组学和生物信息学为核心的发现方法中，动物研究发挥了何种作用？
哪些关键数据可证明操控OPG–RANK–RANKL通路能对患者产生有益效果？

药物发现过程

"药物发现"指制药企业、生物技术公司、学术机构及政府实验室通过筛选化合物寻找潜在活性治疗剂的过程。下文聚焦低分子量化学合成化合物的发现。尽管生物治疗药物（单克隆抗体及相关分子、寡核苷酸分子等）的筛选过程通常涉及较少分子，但其核心概念与原则相似。筛选指在与疾病相关的检测中测试大量化合物：通过筛选的化合物称为"苗头化合物"。若该化合物或其结构衍生物经进一步生物与化学表征仍显示前景，则成为"先导化合物"。理想情况下，药物发现应具备成本效益，产出高概率转化为先导化合物并最终成为成功药物的苗头化合物（图51-1）。

识别苗头化合物主要有两种基本策略。在化合物中心法中，通过若干方法（下文详述）识别化合物并探索其生物学特性；若显示理想药理活性，则进一步优化开发。而在当前更主流的靶点中心法中，首先识别假定药物靶点——可能是参与疾病过程的受体、关键酶或疾病通路中其他重要生物分子。确定靶点后，研究人员寻找能作为激动剂、拮抗剂或调节剂与靶点相互作用的化合物。搜索可系统化进行（以靶点结构信息为起点，即基于结构生物学的方法），也可采用"霰弹枪"策略——在高速自动化检测中测试组合化学合成的大型化合物库中的所有物质。无论何种方法识别出苗头化合物后，常借助对其靶点的特定认知进行修饰。例如，此类知识可用于设计高通量筛选，测试原始苗头化合物化学修饰产物的生物活性。

化合物中心药物设计

天然与合成化合物

传统上，药物通过化合物中心法发现。早期药物多为从植物、霉菌等生物体分离的天然产物，发现常具偶然性。例如青霉素（参见第35章《细菌与分枝杆菌感染药理学：细胞壁合成》）的发现源于亚历山大·弗莱明观察到污染物青霉菌（Penicillium notatum）孢子抑制培养皿中细菌生长。其他成功转化为药物的天然产物包括：太平洋紫杉树提取的化疗药物紫杉醇；罂粟提取的阿片类镇痛药吗啡（经少量合成步骤转化为药物羟考酮）；海洋海绵Halichondria okadai提取的海兔毒素（用作合成抗癌药物艾立布林/Halaven®的先导物）；链球菌细菌提取的溶栓剂链激酶；以及真菌提取的免疫抑制剂环孢素。近年，细胞毒性天然产物作为"弹头"用于抗体-药物偶联物（ADCs）再度引发关注。表51-1展示了若干源自天然产物的药物结构。

以天然产物为药物来源具有多重优势：首先，天然产物具有合理生物学活性概率；其次，从天然来源分离化合物可能比从头合成更简便，尤其当结构复杂或需困难合成操作时（如紫杉醇含四个稠合环，其中一个含八个碳原子，化学合成需50余步且总产率不足1%）；第三，可将天然化合物作为合成微调起点（即形成半合成产品）。但天然产物亦有劣势：分离过程常需大量努力且未必成功；即便具有药理活性，分离与修饰成本也可能高昂；此外，许多天然产物体内作用机制常未知，在当前靶向药物治疗环境中，为其建立筛选系统及识别临床可行的安全监测工具面临重大挑战。

合成化合物现常用于新药搜索。研究者可构建含数千种具不同结构特征化合物的文库，针对特定研究定制。例如文库可包含大量含苯丙氨酸-脯氨酸键的化合物，或可能是某类受体的潜在激动剂/拮抗剂。

天然配体的类似物

另一种化合物中心法以受体天然配体（常为激动剂）为药物开发起点。例如，帕金森病（参见第14章《多巴胺神经传递药理学》）与黑质纹状体通路多巴胺缺乏相关，早期有效治疗即采用多巴胺代谢前体药物左旋多巴（L-DOPA）。胰岛素开发路径类似：发现糖尿病症状源于胰岛素水平低下后，外源性给予胰岛素成为有效疗法。

受体天然激动剂亦可作为化学修饰的骨架，改变化合物的结合亲和力、生理效应（如将激动剂转为拮抗剂；参见第1章《药物-受体相互作用》）、分布、代谢或药代动力学。此法应用于西咪替丁（参见第44章《组胺药理学》）——一种H2受体拮抗剂的开发。研究者从组胺出发，连续修饰结构骨架，合成出对受体高亲和力且毒性降低的拮抗剂。类似地，现用于糖尿病治疗的修饰胰岛素具有不同药代动力学特性。

修饰小分子激动剂成功率相对较高。因天然激动剂具生物活性，其化学衍生物也 likely 具生物活性。但问题仍存：外源性L-DOPA生成的多巴胺可结合黑质纹状体通路外脑区受体引发幻觉。且许多疾病过程并非由小分子激动剂与其受体相互作用介导。电压门控离子通道或细胞内信号蛋白等众多药物靶点缺乏内源性小分子激动剂，故不适用类似物方法。

靶点中心药物设计

在靶点中心药物发现与设计中，研究者利用已知对目标疾病至关重要的生化或分子靶点（"已验证靶点"）搜索苗头化合物。此法具多重优势：首先，若靶点与疾病过程相关，则成功作用于该靶点的苗头化合物具较高概率产生有用药理活性；其次，因靶点明确，更易设计能分离潜在苗头化合物对靶点效应的检测方法，这对在细胞或组织制备中难以快速观察的复杂疾病过程尤为重要。例如，虽药物对动脉粥样硬化过程的影响难以快速测量，但检测其是否抑制动脉粥样硬化发病机制中已知酶（如HMG-CoA还原酶；参见第20章《胆固醇与脂蛋白代谢药理学》）则相对容易。随着对疾病病理生理学认知的深入，靶点中心法在药物发现中日益成功，多数新药均采用此法发现。如利托那韦等HIV蛋白酶抑制剂，即为通过靶点中心法发现的小分子药物典型范例（参见第38章《病毒感染药理学》）。在互补性靶点中心法中，剖析潜在生物通路促成了包括抗体在内的大分子作为新型药物中断该通路（方框51-1）。

方框51-1 大分子生物制剂与治疗药物

制药与生物技术公司 increasingly 转向肽、拟肽、蛋白质、反义寡核苷酸及单克隆抗体等大分子。第54章《蛋白质治疗药物》详述了这些疗法的药理特性与临床效用。

此类分子的发现与开发路径与小分子显著不同。例如，针对内源性化合物不足或缺失相关疾病的治疗剂开发（如糖尿病用胰岛素、贫血用促红细胞生成素、遗传性凝血障碍用凝血因子VIII或IX），即"替代疗法"场景中，无需广泛筛选大量分子以确定是否需修饰内源性分子，因此这些药物可快速进入开发与人体测试阶段。

天然或修饰大分子 increasingly 不仅用于替代，还用于调控生理过程，工程化大分子（如抗体）正应用于疾病治疗（表51-2）。以抗体为例，药物发现与开发过程可能涉及提升抗体对目标分子靶点亲和力或特异性的修饰，或"人源化"抗体以最小化其免疫原性。因此类分子通常需胃肠外给药，对可接受药代动力学特性的筛选需求降低。此外，生物治疗药物的毒性通常与"过度药理作用"相关且"脱靶"毒性风险较低（参见第6章《药物毒性》），故所需发现生物学与动物毒性测试可能不如小分子广泛。生物制品的制造比化学合成分子更昂贵且技术挑战更大。生物制品开发的主要挑战在于建立能在细菌、酵母或哺乳动物细胞中生产目标大分子的系统，并从合成产生的大量代谢产物混合物中纯化分离该化合物。精确复制大分子合成与纯化所涉复杂工序，使仿制生物药物的制备面临重大挑战。

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