S100β、基质金属蛋白酶-9、D-二聚体和热休克蛋白70是短暂性大脑中动脉闭塞小鼠模型中急性脑梗死的血清生物标志物 - 心脑血管

摘要

目的

诊断急性脑梗死对确定卒中患者的预后至关重要。尽管有许多可用于快速诊断的血清学检测方法，但目前血清学检测的临床应用仍有限。本研究探究了S100β、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、D-二聚体和热休克蛋白70(HSP70)是否可作为急性脑梗死的生物标志物。

方法

采用改良的管腔内丝线技术诱导局灶性脑缺血。将小鼠随机分配至30分钟闭塞组(n=10)、60分钟闭塞组(n=10)或假手术组(n=5)。4小时后，评估神经功能缺损并采集血液样本。计算梗死体积，并使用酶联免疫吸附测定法测量血浆S100β、MMP-9、D-二聚体和HSP70水平。

结果

30分钟组和60分钟组的平均梗死体积分别为12.32±2.31 mm³和46.9±7.43 mm³。两个缺血组的平均神经功能评分分别为1.6±0.55和3.2±0.70。缺血4小时后，S100β、MMP-9和HSP70的表达显著增加(p=0.001)。此外，S100β和MMP-9的表达与梗死体积(p<0.001)和神经功能缺损(p<0.001)相关。各组间D-二聚体表达无显著差异(p=0.843)。受试者工作特征曲线(ROC)下的面积(AUC)显示MMP-9和HSP70具有高灵敏度和特异性(AUC=1)，S100β的AUC为0.98。

结论

S100β、MMP-9和HSP70可以补充现有诊断工具来评估脑梗死，表明它们可作为急性脑梗死的潜在生物标志物。

关键词： 急性缺血性卒中；生物标志物；脑梗死体积

引言

诊断急性脑梗死最广泛使用的工具是神经影像学检查，包括计算机断层扫描(CT)和磁共振成像等技术。弥散加权成像对诊断急性脑梗死的敏感性>90%，尤其是[10]。此外，目前正有许多努力致力于提高神经影像学工具的诊断能力；急性脑梗死生物标志物的研究就是其中一个例子。

生物标志物在其他医学领域(如急性冠状动脉综合征)已显示出有效性，可为早期诊断和干预提供大量信息。这表明在急性脑梗死中，生物标志物与神经学检查和神经影像学结合，可促进早期治疗干预[25,26]。

许多研究表明，与缺血级联相关的生物标志物在评估急性脑梗死方面具有潜在作用，如早期神经功能恶化、最终梗死体积、临床状态和功能结局[5,9]。然而，据我们所知，尚无研究发现成功的临床生物标志物。这可能是因为在急性脑梗死期间升高的大多数蛋白质不具备作为重要且有用生物标志物所需的主要特征。这些特征包括：1)脑特异性；2)存在于血浆中，便于血液而非脑脊液取样；3)在临床症状发作早期存在于血浆样本中；4)表达与病灶大小相对应；5)具有预后价值。目前，由于这些限制，生物标志物在急性脑梗死中的使用仅限于研究实验室，尚未在临床环境中应用[18]。

为克服这些困难并提高其诊断效用，研究尝试将几种生物标志物组合成面板使用。Reynolds等人[19]和Lynch等人[16]表明，生物标志物组合与脑成像结合可具有成本效益且节省时间。这使医生能够迅速识别可能从立即干预和重症监护中受益的患者亚群。

关于生物标志物组合是否在临床上有用、具有良好的预测率并有助于现有诊断工具，存在争议[15]。此外，有限数量的生物标志物研究报道了急性脑梗死早期阶段的结果。这个时间点是使用静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(IV-tPA)在4.5小时内或在卒中发作后6小时内进行干预治疗的关键窗口期[3]。

要创建可在脑梗死急性期使用的生物标志物组合，关键是要发现并选择在缺血发作点可在血浆中检测到且对缺血性脑损伤具有特异性的生物标志物。在本研究中，我们从参与急性脑梗死期间各种病理过程的蛋白质中选择了S100β、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、D-二聚体和热休克蛋白70(HSP70)，包括脑特异性标志物、炎症介质、血栓形成/止血相关标志物和神经保护剂，以测试它们作为临床适用生物标志物的有效性[15,16]。

我们使用短暂性大脑中动脉(MCA)闭塞的小鼠梗死模型，研究这些蛋白质作为急性脑梗死生物标志物的效用，时间点在症状发作后4.5小时内，即可以进行IV-tPA给药的时间。

材料与方法

小鼠局灶性脑梗死模型

本研究使用25只C57BL/6成年雄性小鼠(年龄7-8周，体重23-25克)。机构动物护理和使用委员会审查并批准了本研究中使用的动物实验方案。小鼠被随机分为三个实验组：假手术组(n=5)、30分钟大脑中动脉闭塞(MCAO；n=10)组和60分钟MCAO组(n=10)。

通过使用改良的管腔内丝线技术暂时闭塞这些小鼠的MCA来诱导局灶性脑缺血[29]。使用V-10麻醉系统(VetEquip, Inc., Pleasanton, CA, USA)以5%异氟烷在30% O₂/70% N₂O中麻醉小鼠。麻醉诱导后，将异氟烷水平降低并维持在1.5%。在颈部正中切口后，分离并结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，并在左侧颈内动脉上暂时放置微血管夹。

将涂有硅树脂的8-0尼龙单丝通过切口引入颈总动脉，并推进至距颈动脉分叉9mm处以实现MCAO。30分钟或60分钟MCAO组的小鼠分别在30或60分钟后取出尼龙单丝。假手术组小鼠接受颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，但不进行进一步操作。在整个手术过程中，直肠温度维持在37±0.2℃。缝合皮肤切口后，将小鼠放回笼中。

神经功能评分

在取出尼龙单丝后4小时评估各组的神经功能缺损。每组小鼠使用6点缺陷评分进行行为评估[11]。

评分标准如下：0，正常运动功能；1，轻度环形行为，提起尾巴时可能有不一致的旋转，向对侧旋转的尝试<50%；2，轻度一致环形，向对侧旋转的尝试>50%；3，持续强烈的即时环形，小鼠保持旋转位置超过1-2秒，鼻子几乎到达尾巴；4，严重旋转发展为桶状，丧失行走或翻正反射；5，昏迷或濒死状态。

脑梗死体积测量

取出大脑以确定梗死是否存在。测量所有小鼠的梗死体积。将大脑取出，并在冰上使用Brain Matrix(Braintree Scientific, Braintree, MA, USA)冠状切成四个2-mm切片。将切片在2% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物中孵育，并在室温下加热20分钟，然后在4℃下用4%多聚甲醛固定48小时后再扫描。使用美国国立卫生研究院(NIH)Image J软件版本9(Bethesda, MD, USA)，测量每个切片的梗死区域，并计算总梗死体积。

还确定了同侧和对侧半球体积，以校正可能人为影响梗死体积的脑水肿[23]。使用以下公式计算水肿校正的梗死体积：校正梗死体积=对侧非梗死体积-同侧非梗死体积[24]。

使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估血浆生物标志物(S100β、MMP-9、D-二聚体和HSP70)

为定量分析血浆S100β、MMP-9、D-二聚体和HSP70表达，在MCAO后4小时使用1-mL注射器和22号针头通过心脏穿刺获取血样。将血样收集在含乙二胺四乙酸的玻璃管中，以1000 g离心30分钟，并将上清液在-80℃下冷冻直至进一步分析。计算每个测定所需的血浆量，并确定最佳稀释比例(S100β，无稀释；MMP-9，1:20；D-二聚体，1:4；HSP70，无稀释)。

使用小鼠蛋白S100β(CSB-EL-0206643MO；CUSABIO, 武汉, 中国)、小鼠总MMP-9(MMPT90；R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、小鼠D-二聚体(E03D0224；BlueGene, 上海, 中国)和小鼠HSP70(CSB-E08311m；CUSABIO)ELISA试剂盒计算血浆S100β、MMP-9、D-二聚体和HSP70浓度。所有夹心ELISA均按照制造商的说明使用标准程序进行。

生物标志物的敏感性和特异性

为评估生物标志物的敏感性和特异性，我们构建了受试者工作特征(ROC)曲线，该曲线将测试敏感性作为y坐标，将1-特异性(或假阳性率)作为x坐标。我们估计了ROC曲线下面积(AUC)，该面积在0-1之间测量，因为两个轴的值范围都是0-1。AUC值为1表示最佳整体诊断性能。

统计分析

使用Windows版社会科学统计软件包18.0(SPSS Corp., Chicago, IL, USA)进行统计分析。使用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney U检验比较组间连续变量的分布。使用双侧假设检验。使用Spearman相关系数分析生物标志物、梗死体积和神经功能评分之间的关系。p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

脑梗死体积

在所有暴露于短暂性缺血的小鼠(30分钟MCAO，n=10；60分钟MCAO，n=10)中，闭塞同侧半球均发现脑梗死。假手术组小鼠(n=5)未见梗死。脑梗死体积随MCA闭塞时间增加而增大。30分钟闭塞组的平均梗死体积为12.32±2.31 mm³，梗死主要局限于基底节区。60分钟闭塞组的平均梗死体积为46.9±7.43 mm³，分布范围更广，从基底节区延伸至大脑皮层。30分钟和60分钟MCAO组之间的梗死体积存在显著差异(p=0.008)，60分钟缺血组的梗死体积更大(图1)。

神经功能评分

在所有经历短暂性缺血的小鼠(30分钟MCAO，n=10；60分钟MCAO，n=10)中发现神经功能缺损。假手术组小鼠(n=5)未见神经功能缺损。30分钟和60分钟缺血组的平均神经功能评分分别为1.6±0.55和3.2±0.70。假手术组的神经功能评分为0。神经功能评分的统计比较显示30分钟和60分钟MCAO组之间存在显著差异(p=0.002；图2)。

血浆生物标志物表达

S100β

血浆S100β的定量ELISA测量显示，假手术组、30分钟MCAO组和60分钟MCAO组的平均值分别为3.9±2.47 pg·mL⁻¹、16.8±8.34 pg·mL⁻¹和55.1±21.63 pg·mL⁻¹。因此，与假手术组相比，两个梗死组中S100β的浓度显著增加(p=0.001)。此外，与30分钟组相比，60分钟闭塞组的S100β浓度显著更高(p=0.001；图3A)。血浆S100β浓度与脑梗死体积和神经功能评分呈显著正相关，统计值分别为r=0.867(p<0.001)和r=0.802(p<0.001；图3B和C)。

MMP-9

血浆MMP-9的定量ELISA测量显示，假手术组、30分钟MCAO组和60分钟MCAO组的平均值分别为0.63±0.09 ng·mL⁻¹、1.20±0.22 ng·mL⁻¹和1.88±0.41 ng·mL⁻¹。与假手术组相比，两个梗死组中MMP-9的浓度显著增加(p=0.001)。此外，60分钟闭塞组的MMP-9浓度显著高于30分钟闭塞组(p=0.001；图4A)。血浆MMP-9浓度与脑梗死体积和神经功能评分均呈显著正相关，统计值分别为r=0.890(p<0.001)和r=0.879(p<0.001；图4B和C)。

D-二聚体

血浆D-二聚体的定量ELISA测量显示，假手术组、30分钟MCAO组和60分钟MCAO组的平均值分别为3689±335 pg·mL⁻¹、3884±532 pg·mL⁻¹和3900±1228 pg·mL⁻¹。三组之间的血浆D-二聚体浓度无显著差异(p=0.843；图5A)。此外，D-二聚体浓度与脑梗死体积(r=0.255，p=0.218)或神经功能评分(r=0.139，p=0.507)无显著相关性(图5B和C)。

HSP70

血浆HSP70的定量ELISA测量显示，假手术组、30分钟MCAO组和60分钟MCAO组的平均值分别为1.15±0.41 ng·mL⁻¹、2.48±0.15 ng·mL⁻¹和2.24±0.19 ng·mL⁻¹。与假手术组相比，两个梗死组中HSP70的浓度均显著增加(p=0.001)。此外，与60分钟闭塞组相比，30分钟闭塞组的HSP70浓度更高，但未达到统计学显著性(p=0.66；图6A)。血浆HSP70浓度与脑梗死体积(r=0.174，p=0.406)或神经功能评分(r=0.138，p=0.510)无相关性(图6B和C)。

生物标志物的敏感性和特异性

受试者工作特征曲线(ROC)下的面积(AUC)显示MMP-9和HSP70具有高敏感性和特异性，AUC均为1，S100β的AUC为0.98。D-二聚体的AUC为0.58(图7)。

讨论

急性缺血性卒中患者的许多血浆蛋白水平升高[17]。这些蛋白与参与急性脑梗死发病机制的某些生化变化相关。

缺血的早期阶段诱导星形胶质细胞活化、神经元损伤、氧化应激增加和炎症介质释放。在急性缺血期，脑特异性蛋白通过血脑屏障(BBB)破坏释放到血液中，使其能够进行血清学检测。此外，在急性缺血期，存在于血液中的炎症介质和与血栓形成/止血相关的分子水平升高[25,26]。

尽管有这些变化的理论证据，但没有单一生物标志物具有足够的预测价值，可作为缺血性卒中的早期诊断指标，或区分卒中与其他情况。最近发表的一项关于卒中相关血清标志物的荟萃分析报告称，每种标志物都未能改善当前临床模型获得的预测值[26]。因此，近期研究集中在通过建立生物标志物组合来提高诊断准确性，以克服单个生物标志物的低敏感性和特异性[15,26]。

缺血损伤快速评估研究小组评估了缺血性卒中或卒中模拟事件患者在24小时内的血浆D-二聚体、S100β、MMP-9和脑钠肽水平。该小组分析了诊断预测率，报告诊断敏感性为90%。此外，与CT结合时，这一比率进一步提高[15]。为提高急性脑梗死的诊断准确性和治疗效果，需要进一步研究有效的生物标志物组合。为此，需要识别和选择对急性脑梗死高度敏感和特异的生物标志物。

S100β是一种钙结合肽，在脑损伤、神经退行性疾病和精神疾病期间由星形胶质细胞分泌。S100β与脑免疫系统之间的相互作用导致在低浓度S100β下发育中神经元的存活增强。在较高浓度下，S100β在体外刺激促炎细胞因子和凋亡的产生。S100β血清水平升高见于缺血性卒中以及许多其他急性和慢性疾病，如创伤性脑损伤、阿尔茨海默病和精神分裂症[14]。

在缺血性卒中中，S100β血清浓度在第2-4天达到最大浓度。峰值浓度与较高的美国国立卫生研究院卒中量表评分、梗死大小以及梗死和蛛网膜下腔出血的临床病程相关[6,7]。Reynolds等人[19]报告称，在脑梗死发生后0-12小时内达到峰值的S100β浓度与缺血高度相关。此外，在卒中发生后0-6小时内也发现这种模式。其他几项研究报告称，与对照组相比，脑梗死发作后12小时内(或最早6小时内)S100β浓度更高[6,15,19,27]。

在本研究中，S100β浓度随缺血发展而增加，并在MCAO持续时间较长后进一步增加。S100β浓度与梗死体积和神经功能缺损程度呈正相关。总体而言，我们的结果与先前报道一致，表明血浆S100β浓度可用于补充急性脑梗死的传统早期诊断工具并评估其严重程度。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一组14种酶，包括在脑组织中活跃的子集。MMPs分为基质溶解素、明胶酶、胶原酶、膜型蛋白酶和基质溶解素[19]。MMPs以潜伏形式产生，需要激活才能导致其毒性。一旦激活，这些酶参与许多不同过程，如血脑屏障破坏、毛细血管损伤和炎症持续。因此，它们促进缺血的继发进展和出血性转化[4]。MMP活性引起的炎症和血管壁结构改变都与颅内动脉粥样硬化和急性期损伤的慢性进行性损伤有关[2]。

MMP-9在脑组织中广泛表达。它可以通过破坏血脑屏障诱导脑水肿和出血性转化，从而在缺血期间增加其通透性。MMP-9由白细胞、神经元、胶质细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞产生。它通过分解胶原蛋白IV、基底膜和纤维连接蛋白来介导炎症。MMP-9浓度在缺血2小时后增加，在72小时达到峰值，并在发病120小时后下降。MMP-9水平在脑梗死期间迅速增加，与梗死大小一致；因此，它是有助于急性脑梗死早期诊断和严重程度评估的潜在生物标志物[20]。

本研究表明，血浆MMP-9浓度可用于补充当前诊断方案，以检测急性脑梗死的早期阶段并估计其严重程度。我们发现MMP-9浓度随缺血发展而增加，较高浓度与MCAO持续时间较长相关。MMP-9浓度也与梗死体积和神经功能缺损程度呈正相关。

D-二聚体是纤溶酶介导的纤维蛋白降解标志物，与纤维蛋白降解产物(FDP)交联，指示血管闭塞。当凝血和纤溶系统被激活时，纤溶酶将纤维蛋白分裂为FDP和D-二聚体。在深静脉血栓形成、肺血栓栓塞、心肌梗死、弥散性血管内凝血、手术、创伤和卒中等不同情况下，D-二聚体升高[1]。

缺血性卒中期间D-二聚体浓度增加是由于颅内压升高引起的脑膜刺激激活止血系统，以及脑组织损伤和脑血管破坏导致凝血途径激活[8]。脑梗死后24小时，D-二聚体血浆浓度增加；然而，我们未发现MCAO后D-二聚体浓度有任何显著增加。此外，在急性脑梗死的早期阶段，D-二聚体浓度与梗死体积或神经功能缺损程度不相关。

热休克蛋白70(HSP70)是一种由各种病理损伤诱导的分子伴侣，如高热、凋亡刺激、氧化应激和缺血[29]。脑中热休克蛋白(如HSP70)的基因表达增加是由包括缺血在内的各种损伤触发的[18]。Yenari等人[28]提出，HSP70表达增加表明细胞应激。应激条件可导致蛋白质变性。这些变性蛋白质的存在触发热休克蛋白(如HSP70)的转录，这些蛋白与变性蛋白质结合以防止进一步变性。

在脑梗死期间，HSP70可在脑中的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞或内皮细胞中表达[18]。HSP70的过表达通过防止蛋白质变性以及稳定和恢复部分变性蛋白质的功能来保护这些细胞免受缺血条件的影响[18]。HSP70伴侣家族通过阻断途径中多个不同步骤的凋亡来调节凋亡和坏死性细胞死亡。基于这些知识，我们试图验证HSP70是否可作为脑梗死急性期的生物标志物。缺血后HSP70显著增加；然而，在我们的实验设置中，这种增加与梗死体积或神经功能缺损程度不相关。

关于这一结果，有一项临床报告表明，淋巴细胞中HSP70的表达与卒中严重程度以及卒中后神经功能缺损评分的改善相关[12]。因此，需要进行动物和临床研究来调查急性脑梗死期间梗死脑组织和血浆中基因表达的关系。

总之，在我们的小鼠模型中，短暂性MCAO诱导的脑梗死急性期，S100β、MMP-9和HSP70显著增加。此外，血浆S100β和MMP-9浓度与脑梗死体积和神经功能缺损程度相关。这表明它们可能在急性脑梗死的诊断和卒中严重程度预测中作为有用的生物标志物。

一项研究显示，D-二聚体水平在脑梗死期间显著增加并反映卒中严重程度[22]。然而，我们未发现急性脑梗死早期阶段D-二聚体浓度有任何有意义的增加。需要进一步研究以澄清这一点。

HSP70在健康脑中表达水平较低，但在缺血后在所有细胞类型中被诱导，特别是梗死周围区域的神经元[21,23]。研究表明，HSP70和其他热休克蛋白由应激细胞作为游离可溶性蛋白或包埋在去污剂可溶性膜囊泡中释放[13]。因此，脑梗死急性期的血浆HSP70水平指示缺血性卒中并预测梗死周围区域的大小。应进行包括大规模前瞻性队列研究在内的进一步研究，以评估其作为生物标志物的临床适用性。

本研究存在若干局限性。首先，样本量小，评估的生物标志物数量有限。此外，可以使用更多类别的实验梗死组。当MCA闭塞时间超过1小时时，大多数小鼠无法存活以进行适当的神经功能检查；因此，我们排除了该组，并将小鼠分为30分钟和60分钟MCAO组，神经功能缺损的评估仅基于行为评估。其次，本研究对急性脑梗死期间的血浆蛋白表达进行了定量分析。为进一步提高诊断价值，未来研究需要对脑组织和血浆四组的表达率进行比较分析，以及根据梗死体积的基因表达差异。