研究亮点
- •APOE ε4等位基因不会导致荷兰型遗传性脑淀粉样血管病（D-CAA）中症状性脑出血的早期发作。
- •APOE ε4等位基因不会影响D-CAA中的关键放射影像学参数。
- •D-CAA患者的全局认知功能在APOE ε4携带者与非携带者之间没有差异。
摘要
背景
载脂蛋白E（APOE）基因型影响散发性脑淀粉样血管病（sCAA）的存在、病程和严重程度。我们调查了APOE ε4等位基因对荷兰型遗传性（D-）CAA突变携带者临床和神经影像学结果的影响。
方法
从一项前瞻性队列研究中纳入D-CAA参与者，收集症状性脑内出血（sICH）病史和血管危险因素数据，并进行3特斯拉磁共振成像（MRI）扫描，以评估宏观出血、脑微出血（CMBs）、皮质浅表铁沉积症（cSS）、扩大的血管周围间隙（EPVS）、白质高信号（WMH）体积和WMH多点病变。使用蒙特利尔认知评估（MoCA）和简易精神状态检查（MMSE）评分测量全局认知功能。分析≥1个APOE ε4等位基因与首次sICH年龄、复发时间、认知功能和影像学数据之间的关联，并对混杂因素进行调整。
结果
共纳入81名参与者（平均年龄47岁，54%为女性，38%有sICH病史）。APOE ε4等位基因与sICH早期发作（中位年龄分别为56岁与57岁；p = 0.6）或复发时间（5.0年与3.9年；p = 0.4）无关，也与宏观出血（β 2.0；95%CI 2.4- -2.7；p = 0.4）、CMBs（β 2.9；95%CI 1.0-8.9；p = 0.06）、cSS（aOR 0.5；95%CI 0.1-2.0；p = 0.3）、EPVS（aOR 0.4；95%CI 0.1-1.5；p = 0.6）、WMH体积（β 6.8；95%CI -1.9-15.4；p = 0.1）、多点模式（OR 0.7；95%CI 0.2-2.7，p = 0.6）或认知功能（β -0.3；95%CI -0.4- -0.5；p = 0.5）无关。
结论
APOE ε4不影响关键临床参数或D-CAA神经影像学标记，因此不能解释D-CAA疾病进程中观察到的巨大差异。
关键词
脑卒中
脑内出血
脑淀粉样血管病
载脂蛋白E
术语表
AD：阿尔茨海默病
CMB：脑微出血
cSS：皮质浅表铁沉积症
D-CAA：荷兰型脑淀粉样血管病
EPVS：扩大的血管周围间隙
sCAA：散发性脑淀粉样血管病
sICH：症状性脑内出血
WMH：白质高信号
引言
载脂蛋白E（APOE）基因已被证明影响散发性脑淀粉样血管病（sCAA）的存在、病程和严重程度。载脂蛋白E蛋白主要参与脂质转运，APOE基因型的ε4等位基因是多种退行性疾病（尤其是阿尔茨海默病（AD））的重要危险因素。载脂蛋白E在中枢神经系统（CNS）中的作用复杂且尚未完全理解，但它影响CNS细胞类型的突触功能、脂质稳态和免疫反应，同时也调节神经炎症。APOE ε2等位基因与CAA的出血性表现相关，导致症状性脑内出血（sICH）风险增加、脑叶ICH后血肿扩大，以及更广泛的皮质浅表铁沉积症（cSS）患病率较高。相反，APOE ε4等位基因通常与脑微出血（CMB）而非sICH相关，以及与CAA的非出血性表现相关：白质高信号（WMH）负担增加和半卵圆中心扩大的血管周围间隙（CSO-EPVS）。然而，这些研究的受试者往往不仅包括sCAA患者，还包括普通人群、其他脑血管疾病患者或合并AD的患者。这引发了一个问题：APOE ε4等位基因在多大程度上确实是CAA的疾病修饰因子，还是这些先前结果也反映了其他可能的混杂因素，如年龄、合并症或其他神经退行性病理，以及APOE ε4等位基因与这些因素的相互作用。
这些发现尚未在荷兰型遗传性CAA（D-CAA）中得到复制，这在考虑到其与散发形式的共同病理特征时是出乎意料的。D-CAA是一种由淀粉样前体蛋白（APP）基因突变引起的单基因CAA变体，其发病年龄早于sCAA且进展更快。在D-CAA中，ε2等位基因似乎很少见，而先前研究表明ε4等位基因频率增加。然而，在有或无ε4等位基因的患者之间未观察到临床表达的差异，并且ε4等位基因与血浆中淀粉样β（Aβ）40和Aβ42浓度之间也未发现相关性。APOE基因型也未与WMH、局灶性磁共振成像（MRI）病变（表示旧出血或梗死）或病理病变相关联。这些在1990年代和2000年代初进行的研究涉及相对较小的队列（约30名突变携带者），使用1.5T MRI扫描仪，没有易感加权成像。在D-CAA中，尚未分析ε4等位基因与某些出血标记物（cSS、CMBs）以及更近期的MRI标记物（如CSO-EPVS和多点模式的WMH）之间的关联。在D-CAA中研究APOE基因型可能有助于了解CAA的病理生理学以及D-CAA患者之间的临床变异。我们旨在通过在相对大量的D-CAA突变携带者中研究与sICH、认知功能以及高质量3T MRI上的CAA相关标记物的关联，来调查APOE基因型与D-CAA临床和认知结果之间的关系。
材料与方法
研究参与者和临床特征
参与者从AURORA研究（包括"跟踪荷兰型遗传性CAA自然史"（TRACK D-CAA）子组）中招募，这是一项在莱顿大学医学中心（LUMC）进行的关于D-CAA自然史的观察性研究。患者通过LUMC的（门诊）诊所招募。纳入标准为年龄≥18岁和致病性APP突变。纳入无症状和有症状的（定义为有sICH病史、短暂局灶性神经功能缺损（TFNEs）和/或经神经心理学检查确认的认知功能下降症状）突变携带者。这些数据在研究开始时基于参与者及其医疗记录的报告进行回顾性记录。sICH定义为影像学上显示近期脑出血的证据，结合与所述脑出血位置和大致日期相符的局灶性神经症状。
所有患者都参加了研究日活动，包括医疗史和临床症状问卷调查、神经心理学检查（包括蒙特利尔认知评估（MoCA）和简易精神状态检查（MMSE））、3T脑部MRI以及血液样本采集。横断面记录的临床特征包括年龄、性别、sICH次数、首次sICH年龄、复发时间以及血管危险因素。AURORA和TRACK研究获得LUMC当地伦理审查委员会的批准，所有患者在参与前均提供书面知情同意。
APOE基因型
从样本中分离DNA，并在最终体积为25 µl的条件下进行包含SNP的DNA区域的PCR扩增，使用5 pmol APOE引物。从检测中获得的等位基因读数被转换为APOE基因型。基因分型人员对临床和影像学数据不知情。具有ε2/ε4、ε3/ε4或ε4/ε4基因型的参与者被定义为APOE ε4携带者。
MRI
图像采集
参与者接受了脑部MRI扫描（全身人体3T-MRI，Philips，荷兰）。影像采集的详细信息见补充材料。
图像分析
根据"血管变化神经影像报告标准"（STRIVE）标准对脑叶宏观出血、脑叶CMBs、cSS和CSO-EPVS进行评分。如有疑问，扫描结果将与经验丰富的神经放射科医生讨论。
脑叶宏观出血（定义为直径≥1 cm的出血）和CMBs（定义为直径<1 cm）由训练有素的观察者在MeVisLab框架（版本3.2）开发的内部工具辅助下，使用易感加权成像（SWI）图像进行计数。cSS在SWI图像上评分，弥散性cSS（≥4脑沟）表示严重cSS。CSO-EPVS在T2图像上使用经过验证的视觉评分量表进行评分：无EPVS、1-10 EPVS、11-20 EPVS、21-40 EPVS、>40 EPVS。严重CSO-EPVS定义为>21 EPVS。
白质高信号（WMH）体积在流体衰减反转恢复（FLAIR）图像上使用MeVisLab 3.61中开发的半自动分割流程进行量化（补充材料），并以毫升报告。WMH斑点被定义为在FLAIR或T2图像上表现为高信号的点状、圆形或卵圆形皮下斑点。对斑点进行计数，>10个斑点被视为多点模式。
统计分析
对整个人群以及ε4等位基因携带者和非ε4携带者分别进行人口统计学变量和血管危险因素的描述性统计。使用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验比较首次sICH年龄以及有≥1次sICH参与者的复发时间。
我们使用回归模型研究APOE基因型、不同神经影像标记物和认知功能之间的关联。为评估对CMBs数量的影响，我们使用Kaplan-Meier生存分析分析首次微出血的时间，将具有>0个CMBs的参与者视为左删失，将没有微出血的患者视为右删失。然后，我们对具有>0个CMBs的参与者进行微出血数量的对数转换线性回归。使用此方法的理由是，CMBs数量不服从正态分布（许多年轻参与者有0个CMBs），这种转换允许保持结果连续，但使分布更接近正态，同时仅评估APOE ε4等位基因对已经开始发展CMBs的参与者的CMBs数量的影响。对宏观出血数量使用了类似的方法，不同之处在于该结果未进行转换，因为它服从正态分布。为研究APOE ε4等位基因携带状态与任何cSS、严重和多灶性cSS、CSO-EPVS高负担（定义为3级或4级）或WMH多点模式之间的关系，我们使用逻辑回归，将这些标记作为二元结果变量。对于连续尺度测量的WMH体积，我们进行了线性回归。由于WMH体积的分布有些右偏，我们通过进行立方根转换WMH体积的线性回归进行了敏感性分析（补充材料）。对于认知分析，我们使用MMSE和MoCA的平均得分作为全局认知的衡量标准，并进行线性回归。我们提供了仅使用MoCA作为敏感性分析的结果（补充材料）。
所有模型均根据年龄、性别和额外的血管危险因素（高血压、高胆固醇血症、吸烟史）进行调整。p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
我们纳入了81名D-CAA突变携带者（平均年龄47岁）：47/81（58%）为无症状，34/81（42%）为有症状。总计40/81（49%）的参与者携带≥1个APOE ε4等位基因副本，2/81（3%）携带两个副本。8/81（10%）的参与者携带APOE ε2等位基因副本。图S1显示了每项分析的参与者数量。APOE ε4携带者高血压和sICH发病率较高。
表1. 人口统计学和认知评分。
人口统计学 | 整个队列 (n=81) | APOE ε4携带者 (n=40) | APOE ε4非携带者 (n=41) | APOE基因型差异的p值
-- - | --- | --- | --- | ---
基线年龄（岁）（均值，SD） | 47.0 (12.5) | 49.1 (12.5) | 44.9 (12.4) | 0.1
男性（n, %） | 37 (45.7) | 21 (52.5) | 16 (39.0) | 0.2
病史 | | | |
高血压（n, %） | 18 (22.2) | 13 (32.5) | 5 (12.2) | 0.03
高胆固醇血症（n, %） | 15 (18.5) | 12 (30.0) | 3 (7.3) | 0.09
糖尿病（n, %） | 3 (3.7) | 2 (5.0) | 1 (2.4) | 0.5
吸烟史（n, %） | 51 (63.0) | 26 (65.0) | 25 (61.0) | 0.7
sICH（n, %） | 31 (38.3) | 20 (50.0) | 11 (26.8) | 0.03
MoCA（均值，SD） | 28.5 (1.5) | 27.1 (2.9) | 27.2 (2.3) | 0.9
MMSE（均值，SD） | 27.2 (2.6) | 28.4 (1.3) | 28.7 (1.7) | 0.5
APOE = 载脂蛋白E。
MRI = 磁共振成像。
SD = 标准差。
sICH = 症状性脑内出血。
MoCA = 蒙特利尔认知评估。
MMSE = 简易精神状态检查。
首次sICH时间
APOE ε4等位基因携带者首次sICH的中位年龄为56岁（95%CI 53.1-59.0），而非携带者为57岁（95%CI 51.1-62.9；p = 0.6）。19名参与者有≥1次sICH（11名APOE ε4携带者）。ε4携带者的复发中位时间为5.0年（95%CI 3.8-6.1），而非携带者为3.9年（95%CI 2.5-5.4；p = 0.4）。
出血性MRI标记物
28名（37%）参与者有≥1个宏观出血：19名APOE ε4携带者（宏观出血中位数为5）和9名非携带者（宏观出血中位数为5；表2总结了所有结果）。APOE ε4等位基因与宏观出血数量之间没有显著关系（β 2.0；95%CI 2.4- -2.7；p = 0.4）。
表2. APOE ε4携带者与非携带者之间临床和放射学结果的差异。
| APOE ε4携带者 (n=40) | APOE ε4非携带者 (n=41) | P值*
-- - | --- | --- | ---
首次sICH年龄（中位数，95%CI） | 56 (53.1-59.0) | 57 (51.1-62.9) | 0.6
复发性出血时间（中位年数，95%CI） | 5.0 (3.8-6.1) | 3.9 (2.5-5.4) | 0.4
MRI标记物 | | |
≥1个宏观出血（n, %） | 19 (51%) | 9 (24%) |
计数（中位数，IQR） | 5 (2-11) | 5 (2-11) | 0.4
0个宏观出血（n） | 18 (49%) | 29 (76%) |
≥1个微出血（n, %） | 24 (65%) | 18 (47%) |
计数（中位数，IQR） | 253 (105-465) | 76 (3.8-260) | 0.06
0个微出血（n, %） | 13 (35%) | 20 (53%) |
cSS（n, %） | 14 (38%) | 6 (16%) | 0.3
无cSS | 23 (62%) | 32 (84%) |
半球评分（中位数，IQR） | 0 (0-1.75) | 0 (0-0) |
严重cSS | 5 (14%) | 5 (13%) | 0.5
无SWI成像可用 | 3 (8%) | 3 (7%) |
EPVS（中位数，IQR） | 4 (3-4) | 3 (2-4) |
严重EPVS（n） | 30 (86%) | 23 (61%) | 0.2
无T2成像可用 | 5 (13%) | 3 (7%) |
WMH体积（均值，SD） | 19.4 (21.9) | 6.9 (10.6) | 0.1
多点模式 | | |
存在（n） | 28 (78%) | 22 (58%) | 0.6
不存在（n） | 8 (22%) | 16 (42%) |
无FLAIR成像可用 | 4 (10%) | 3 (7%) |
全局认知（平均MoCA和MMSE，SD） | 27.7 (1.8) | 27.9 (1.8) | 0.5
*根据年龄、性别、高血压、高胆固醇血症、吸烟史进行调整。
APOE = 载脂蛋白E。
sICH = 症状性脑内出血。
CI = 置信区间。
MRI = 磁共振成像。
IQR = 四分位距。
cSS = 皮质浅表铁沉积症。
EPVS = 扩大的血管周围间隙。
WMH = 白质高信号。
SD = 标准差。
FLAIR = 流体衰减反转恢复。
MoCA = 蒙特利尔认知评估。
MMSE = 简易精神状态检查。
42名（56%）参与者有≥1个CMBs。首次微出血时间在APOE ε4携带者和非携带者之间无显著差异（p = 0.5）。在那些有≥1个CMBs的参与者中，拥有APOE ε4将CMBs数量增加了2.9倍，但这与非携带者相比无显著差异（β 2.9；95%CI 1.0-8.9；p = 0.06）。
14名（38%）具有ε4等位基因的参与者有cSS，6名（16%）没有ε4等位基因的参与者有cSS。8名（40%）有严重cSS（其中5名具有ε4等位基因）。在调整了与cSS有强关联的年龄和其他血管危险因素后，ε4等位基因的存在与cSS无关（aOR 0.5；95%CI 0.1-2.0；p = 0.3），ε4等位基因与严重cSS之间也没有关联（aOR 2.7；95%CI 0.1-49.9；p = 0.5）。
非出血性MRI标记物
53名（73%）参与者有严重（3级或4级）CSO-EPVS（其中30名具有ε4等位基因）。ε4等位基因与严重CSO-EPVS之间无关联（aOR 0.4；95%CI 0.1-1.5；p = 0.2）。
具有ε4等位基因的参与者的WMH体积均值为19.4 ml（标准差（SD）21.9 ml），而非携带者为6.9 ml（SD 10.6）。在调整年龄和血管危险因素后，携带者和非携带者之间的WMH体积无显著差异（β 6.8；95%CI -1.9-15.4；p = 0.1）。
50名（68%）参与者有多点模式的WMH（其中28名具有ε4等位基因）。ε4等位基因的存在与多点模式无关（OR 0.7；95%CI 0.2-2.7；p = 0.6）。
认知功能
具有ε4等位基因的参与者的全局认知评分（平均MoCA和MMSE）为27.7（SD 1.8），而非携带者评分为27.9（SD 1.8）。全局认知评分与APOE ε4等位基因存在之间无显著关联（β -0.3；95%CI -0.4- -0.5；p = 0.5）。
讨论
我们调查了APOE ε4等位基因携带对D-CAA突变携带者的影响，发现它不影响关键临床因素，如发病年龄、sICH复发时间或全局认知，也未与宏观出血、CMBs、cSS、EPVS、WMH体积或多点WMH等CAA相关影像标记物相关联。这些结果表明，APOE ε4等位基因不影响临床结果或影像学发现。
我们在D-CAA中的结果与其他人群中的发现不同，在其他人群中，APOE ε4已与脑叶CMBs（在认知功能正常个体和患有神经疾病、主要是脑血管疾病的个体的综合人群中）以及AD、sCAA和对照组个体中CAA病理的严重程度相关联。在我们的人群中，拥有APOE ε4等位基因与CMBs数量增加之间存在趋势，尽管统计学上不显著，这可能是由于我们的样本量较小。APOE ε2等位基因已与（弥散性）cSS以及多点模式的WMH的存在相关联，但由于我们队列中ε2携带者数量较少，我们无法对此进行研究。ε2和ε4都与WMH负荷增加相关，我们在D-CAA中也没有看到这一点，这与先前的发现类似。
我们还发现，在关键临床参数方面，APOE ε4与非携带者之间没有差异，如首次sICH年龄和复发性ICH时间。可能的解释是，在普通人群和sCAA和/或ICH人群中，APOE ε2（而非ε4）与更大的血肿、更多的血肿扩大以及（弥散性）cSS的存在相关，这是CAA中sICH的重要危险因素。相反，ε4更多与没有ICH的CAA相关。D-CAA具有更激进的出血性疾病进程，与sCAA相比，其临床表现更为突出，可能ε4等位基因对CAA这一方面的影响太小，无法影响我们检查的影像学和临床参数。也有可能先前的研究（通常在包括其他或混合脑血管病理和/或阿尔茨海默病的异质人群）过于明确地将APOE ε4等位基因与CAA联系起来，而实际上它可能是由APOE ε4等位基因、sCAA和其他因素（年龄、神经退行性疾病、合并症）之间的相互作用引起的。
在普通人群中，杂合子和纯合子APOE ε4携带者从65岁（纯合子）和75岁（杂合子）开始经历较差的认知功能和更高的痴呆风险。然而，由于D-CAA患者首次ICH的平均年龄为55岁，且中风后生存期约为十年，大多数D-CAA患者无法达到这些年龄。在当前的D-CAA人群中，携带APOE ε4等位基因对全局认知功能没有影响，这表明该等位基因的存在与APP突变结合，不会导致更早的认知功能下降。
我们的报告存在一些局限性；首先，我们无法探索APOE ε2等位基因的影响。此外，我们对cSS和CSO-EPVS使用了定性方法，这可能导致在更严重受影响的参与者中产生天花板效应。此外，我们的D-CAA人群仍然相对年轻，一些个体尚未发展出CAA的影像学标志物，只有19名参与者有第二次sICH。这可能降低了我们在ε4携带者和非携带者之间检测影像学差异的能力。我们对无症状和有症状D-CAA的定义也依赖于参与者报告其症状并在首次sICH时寻求医疗护理。因此，我们可能错误地将一些参与者归类为无症状。另一个局限性是，sICH的数据取决于患者在出现神经症状时寻求医疗护理，而一些参与者可能没有这样做。然而，我们研究的许多方面使我们对我们的发现充满信心，包括相对较大的样本量，涵盖广泛的年龄和疾病阶段，以及纳入了公认的和较新的MRI标记物。所有神经影像特征都以标准化方式评估。专注于D-CAA参与者也使我们能够在基因同质人群中研究APOE ε4等位基因对淀粉样蛋白病理的影响，并为进一步研究APOE ε4等位基因作为sCAA的疾病修饰因子的作用提供了可能。
结论
D-CAA突变携带者中APOE ε4等位基因的存在与影像学标记物无关，也与sICH早期发作、复发性出血时间缩短或全局认知功能下降无关。我们的研究表明，我们在D-CAA患者中观察到的显著临床变异很可能不是由他们的APOE基因型引起的。
资金支持
本研究得到了荷兰心脏基金会（Dekker grant 2016T086）对M.J.H. Wermer和TRACK-D-CAA联盟（包括Biogen、Alnylam以及来自莱顿、波士顿和珀斯的研究人员）的资助。资助机构在设计或进行本研究中没有发挥作用。
作者贡献
Maaike C. van der Plas：审阅与编辑写作、原创草稿写作、方法学、正式分析、数据管理、概念化。
Rosemarie van Dort：审阅与编辑写作、方法学、数据管理。
Ingeborg Rasing：审阅与编辑写作、方法学、数据管理。
Yongxi Long：审阅与编辑写作、正式分析。
Erik W. van Zwet：审阅与编辑写作、正式分析。
Matthias J.P. van Osch：审阅与编辑写作。
Hamid R. Sohrabi：审阅与编辑写作。
Kevin Taddei：审阅与编辑写作。
Samantha L. Gardener：审阅与编辑写作。
Ralph N. Martins：审阅与编辑写作。
Steven M. Greenberg：审阅与编辑写作。
Gisela M. Terwindt：审阅与编辑写作。
Marianne A.A. van Walderveen：审阅与编辑写作、方法学。
Marieke J.H. Wermer：审阅与编辑写作、监督、资金获取、概念化。
利益冲突声明
M.C.P.、R.D.、I.R.、Y.L.、E.W.Z.、S.L.G.、S.M.G.、M.A.A.W.和M.J.H.W.报告无披露。
M.J.P.O.报告获得Leducq基金会和Leducq心血管研究基金会（23CVD03）的支持，NWO-Human Measurement Models 2.0 grant（18969）以及荷兰研究委员会（NWO）、欧洲共同体、荷兰心脏基金会和荷兰脑基金会的支持。他是Alnylam的cAPPricorn试验临床试验指导委员会的无薪成员。
HRS、KT和RNM报告担任澳大利亚SMarT Minds WA的董事，并曾获得或正在获得来自阿尔茨海默病研究澳大利亚以及包括Alector、Alnylam Pharmaceuticals、CWEKPTYLTD、澳大利亚WA和Biogen制药公司的制药和营养公司研究支持。
G.M.T.获得了来自Abbvie、Lilly、Lundbeck、Novartis、Organon、Pfizer、Teva和Dioraphte以及荷兰研究委员会、欧洲共同体、荷兰心脏基金会、荷兰脑基金会和Clayco基金会的独立支持的研究资助和/或咨询费。
【全文结束】
