初审时间：30天
锌指E-box结合同源盒2（ZEB2）是上皮-间质转化（EMT）的关键调控因子，EMT是组织重塑和伤口愈合的必要过程[1]。我们先前研究表明，体内腺相关病毒9型（AAV9）介导的ZEB2递送促进了心肌细胞（CMs）与内皮细胞（ECs）之间的相互作用，增强了ECs的增殖和迁移能力，促进了梗死愈合并修复心脏功能[2,3]。类似地，ZEB2递送还能在离体成年猪心肌组织切片中诱导血管生成[4]。
为了深入了解AAV递送的ZEB2在人类心脏组织中的心脏保护作用，我们利用了活体心肌切片（LMSs）的离体模型。人类LMSs在疾病建模和药物测试方面具有显著优势，因为它们保留了成人心脏的组织结构，维持了所有心脏细胞类型之间完整的细胞间相互作用，并保留了供体一生中经历的合并症所导致的病理生理状态。所有涉及人类参与者的研究程序均符合相关伦理法规，并获得了阿姆斯特丹大学医学中心机构审查委员会（2024.0643）的批准。所有供体均提供了书面知情同意，研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。我们分离了一位74岁女性供体（患有收缩功能障碍（HFrEF）、心房颤动和肥胖症）的心脏，并利用它制备了300微米厚的LMSs，采用气液界面法培养总计4天（图1A）。对于转基因递送，我们使用了由CMV启动子驱动的AAV6载体（图1B），该载体在LMSs中具有优异的基因转导效率（感染复数MOI为20000），如先前报道[4,5]。通过观察AAV6递送的绿色荧光蛋白（GFP）确认了转导效率（图1C）。与先前发现一致[3]，ZEB2递送导致血管生成增强，表现为与对照组相比，VWF+血管区域显著增加（图1D和E）。
图1
ZEB2驱动成人人心肌细胞去分化。（A）研究设计。（B）AAV6载体设计。（C）未转导和转导了AAV6-GFP的LMSs代表性免疫荧光图像。LMSs染色显示TNNT2（红色）、GFP（绿色）和DAPI（蓝色）。（D）转导了AAV6-对照和AAV6-Zeb2的LMSs中VWF（红色）、TNNT2（绿色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。（E）AAV6-对照和AAV6-Zeb2处理的LMSs中VWF+（阳性）血管区域的定量（*P < 0.05；学生t检验，LMSs n = 4），条形图显示重复实验的平均值±标准误。（F）AAV6-Zeb2与AAV6-对照处理的LMSs中差异表达基因（DEGs）的火山图。蓝色表示下调基因，红色表示上调基因。ZEB2过表达以黄色标记。（G）使用AAV6-对照或AAV6-Zeb2转导的LMSs生成的RNA-seq数据的功能富集分析。显示了基因本体论和KEGG通路中最显著的术语（P < 0.05）。（H）研究设计。（I）AAV6-对照或AAV6-Zeb2转导的LMSs中RNA-seq鉴定的部分外源Zeb2（exogZeb2）和DEGs的相对表达热图（*P < 0.05，**P < 0.01；学生t检验，LMSs n = 4-6），数据表示为HPRT1标准化表达的Z分数。（J）RNA-seq和ChIP-seq整合分析工作流程（TSS范围=10 kb）。A组：RNA-seq中上调基因，B组：RNA-seq中下调基因，C组：RNA-seq中无变化基因。对于C组，使用DESeq2报告的基线值>1作为阈值（*P < 0.05；Z检验）。（K）RNA-seq和ChIP-seq整合分析（TSS范围=1 kb）。A组：RNA-seq中上调基因，B组：RNA-seq中下调基因，C组：RNA-seq中无变化基因。对于C组，使用DESeq2报告的基线值>1作为阈值。TSS，转录起始位点（*P < 0.05；Z检验）。
从AAV6处理的LMSs中分离总RNA，用于文库制备（Ovation RNA-seq System V2，Tecan genomics，#7102-31）和后续RNA-seq分析（NovaSeq，Illumina）。使用DESeq2分析（Galaxy工具版本24.2.4dev0）确定AAV6-Zeb2处理的LMSs与对照组相比的差异表达基因（DEGs）（图1F）。
对RNA-seq数据进行通路分析（DAVID，v2024q4）显示，在AAV6-Zeb2转导的LMSs中激活了与PI3K-Akt信号通路相关的基因（图1G）。PI3K-Akt信号通路对心肌细胞生长、存活和心脏保护至关重要[6]。下调基因涉及心脏肌肉收缩、细胞骨架、微管和肌动蛋白丝组织等过程，这些过程是成人CMs的特征（图1G）。这些过程的减少可能代表了心肌细胞去分化的第一步，通常表现为细胞可塑性增强和部分细胞周期重新进入，类似于EMT样再生状态[7]。在成年哺乳动物心脏中，心肌细胞去分化很少导致细胞增殖，而是涉及从成熟功能（如氧化代谢和收缩活动）回归到更少特化、发育不成熟的的状态[8]。这种转变降低了能量需求并提供了心脏保护益处，可能类似于祖先再生机制的进化残留。
使用来自第二位供体（80岁男性，患有2型糖尿病、高血压和哮喘/慢性阻塞性肺病）心脏的LMSs进行靶标验证（图1H）。在确认外源Zeb2（exogZeb2）递送后，我们测试了通过RNA-seq鉴定的部分DEGs，观察到类似的基因表达变化（图1I）。
为测试ZEB2的直接靶基因是否在DEGs中富集，我们确定了在转录起始位点（TSS）±10或±1 kbp范围内ZEB2结合的频率，这些基因的表达在上调（A组）、下调（B组）或无变化（C组）（图1J）。ZEB2基因组结合位点从现有的ChIP-seq数据集中获取[9]。使用BWA以默认参数将测序读段比对到hg19人类基因组。合并重复样本后，使用BEDTools将基因组划分为1000 bp的bin，滑动窗口为500 bp[10]。对于峰调用，将含有>500个标签的bin合并，生成43,069个与ZEB2相关的单个基因组位点。TSS从hg19基因组（GRCh37.p13）通过Biomart获取，并合并了重叠的TSS。使用BEDTools分析不同表达基因集和对照基因集的TSS ±10 kbp或±1 kbp区域与ZEB2 ChIP-seq峰的重叠[10]。我们发现，无论分析TSS周围10 kb（图1J）还是1 kb窗口（图1K），上调基因（A组）的TSS最常与ZEB2 ChIP-seq峰相关联。这证实了我们先前的发现，即ZEB2在成年哺乳动物心脏中主要作为转录激活剂而非抑制剂发挥作用[3]。
在本研究中，与我们在小鼠心脏和猪源LMSs中的先前发现一致，我们发现ZEB2递送增加了人源LMSs中内皮细胞的数量。我们还发现了提示心肌细胞去分化的转录证据，这是心脏再生的前提[7]。需要在更大样本量上进行进一步测试，以证实这些观察结果，并在功能层面上评估成人人类CMs以EMT样方式去分化的程度。此外，还需要解决基于ZEB2的心脏疗法在人源LMSs中的长期影响，以充分探索将ZEB2递送到人类心脏的益处和缺点。尽管存在这些局限性，本研究首次探索了AAV6介导的Zeb2基因转移对成人人心肌的影响，证明了基于AAV的Zeb2疗法在促进人类心脏组织修复方面的潜在适用性。
致谢
我们衷心感谢阿姆斯特丹大学医学中心的遗体捐赠计划提供人类心脏，以及的里雅斯特国际遗传工程与生物技术中心（ICGEB）的AAV载体单元生产腺相关病毒。
资金支持
本工作得到了荷兰心脏基金会（Hartstichting）Dr. Dekker高级科学家奖学金（NHS2020T041至M.M.G.）的支持。
数据可用性
包括转录组分析在内的数据可应要求向作者索取。
伦理批准
伦理批准由阿姆斯特丹大学医学中心（2024.0643）获得。
【全文结束】
